Deparafinizacija in ekstrakcija beljakovin iz FFPE

Olajšajte ekstrakcijo beljakovin iz tkivnih odsekov s formalinom, fiksnim parafinom (FFPE), z optimizirano kombinacijo deparafinizacije, raztapljanja in ultrazvočnega razbijanja z večcevnim ultrazvočnim aparatom VialTweeter. Ta protokol podpira proteomiko, ki temelji na masni spektrometriji, in je združljiv s čiščenjem SP3 in encimsko prebavo.

Ta SOP je namenjen laboratorijskemu osebju, ki sodeluje pri proteomski analizi vzorcev tkiva FFPE z uporabo visoko zmogljive ultrazvočne obdelave. Optimiziran je za do deset vzorcev FFPE, ki se obdelujejo vzporedno z uporabo VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Protokol: Ekstrakcija beljakovin iz vzorcev FFPE z uporabo VialTweeter

Materiali in reagenti

Reagenti

• Ksilen (histološki razred)
• Etanol (absolutno 96 %)
• Pufer za lizo:

6 M gvanidinijev klorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfin)
40 mM CAA (2-kloracetamid)

• Zaviralec proteaze (neobvezno; npr. cOmplete™ mini EDTA-free)

Oprema

• VialTweeter večcevni ultrazvočni aparat
• 1,5 ml ali 2,0 ml nizko vezavne mikrocentrifugalne epruvete
• Toplotni blok ali inkubator (nastavitve 95 °C in 80 °C)
• Mikrocentrifuga
• Termomešalnik (neobvezno, vendar priporočeno)

Vzorčni vnos

• 1–2 odseka 10 μm debelega FFPE tkiva na vzorec (tj. na vialo)

ali

• Skupaj ~ 100 μg tkiva na vzorec (tj. na vialo)

Opomba: Uporabite sveža rezila za mikrotomijo, da zmanjšate kontaminacijo s parafinskimi odpadki.

Procedura

1. deparafinizacija
   1. Prenesite FFPE odseke v nizko vezavne mikrocentrifugalne epruvete.
   2. Dodajte 1 ml ksilena, na kratko vrtinec.
   3. Inkubirajte 10 minut pri sobni temperaturi.
   4. Centrifugiramo pri 14 000 × g 2 minuti; Zavrzite supernatant.
   5. Še enkrat ponovite ksilensko pranje (koraki 2–4).
   6. Pelet speremo z 1 ml 96% etanola, vrtinca, nato centrifugiramo pri 14.000 × g 2 minuti. Zavrzite supernatant.
   7. Še enkrat ponovite pranje z etanolom (skupaj 2 izpiranja z etanolom).
   8. Pelet sušimo na zraku 10 minut pri sobni temperaturi z odprtimi pokrovi, da izhlapi ostanek etanola.
2. Ekstrakcija beljakovin in ultrazvočno razbijanje
   1. Vsaki suhi peleti dodamo 200 μl pufra za lizo.
      Opomba: Čeprav sonikator sprejme do 1 ml, je 200 μl optimalno za nadaljnjo obdelavo.

   2. Mešajte z vrtincem ali nežnim pipetiranjem.
3. Prva toplotna inkubacija
   1. Epruvete inkubiramo 30 minut pri 95 °C z mešanjem pri 400 vrt./min z uporabo termomešalnika ali toplotnega bloka.
   2. Vzorce pustite, da se ohladijo pri sobni temperaturi 5 minut.
4. Prva ultrazvočna razbijanje z VialTweeterjem
   1. Postavite cevi v VialTweeter.
   2. Nastavite VialTweeter UP200St na spodnje vrednosti in sonikirajte.
Nastavitve sonatorja
• Amplitudo (A) nastavite na 100 %
• Nastavite način pulziranja (C) na 100%
• Ura obdobja: vklopljena
• Pravočasno: 60s
• Čas izklopa: 30s
• Mejna vrednost: 15 min (ustreza 10 ciklom)
(Opomba o izračunu: (60 s vklopljeno + 30 s izklopljeno) × 10 ciklov = 900 s = 15 min)
5. Druga toplotna inkubacija
   Epruvete odstranimo in ponovno inkubiramo pri 95 °C 15 min, 400 vrt./min.
6. Druga ultrazvočna razbijanje
   Ponovite ultrazvočno razbijanje na VialTweeterju z enakimi nastavitvami (kot zgoraj) za dodatnih 10 ciklov (skupaj 15 minut).
7. Pojasnitev lizata
   1. Vzorce centrifugiramo pri 13 000 × g 10 minut pri 23 °C (sobna temperatura).
   2. Previdno zberite supernatant v novo 2,0 ml cevko Safe-lock Eppendorf. Izogibajte se motenju peletov.
8. Nadaljnja obdelava
   Lizat je zdaj pripravljen za čiščenje SP3 in encimsko prebavo.

Opombe in najboljše prakse

1. Tveganje pregrevanja med ultrazvočnim razbijanjem se ublaži s programiranim ciklizmom ON/OFF.
2. Izogibajte se vrtinčenju po ultrazvočnem razbijanju, da preprečite agregacijo beljakovin.

Odstranjevanje odpadkov in varnost

Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih aparatov v laboratoriju: