Deparafinizacija in ekstrakcija beljakovin iz FFPE

Olajšajte ekstrakcijo beljakovin iz tkivnih rezin, fiksiranih v formalinu in vklopljenih v parafin (FFPE), z optimizirano kombinacijo deparafinizacije, solubilizacije in sonikacije z ultrazvočno napravo VialTweeter za več epruvet. Ta protokol podpira nadaljnje proteomske analize na osnovi masne spektrometrije in je združljiv s postopki čiščenja SP3 in encimske razgradnje.

Ta standardni operativni postopek (SOP) je namenjen laboratorijskemu osebju, ki izvaja proteomske analize tkivnih vzorcev FFPE z visokozmogljivo sonikacijo. Optimiziran je za vzporedno obdelavo do desetih vzorcev FFPE s sonikatorjem VialTweeter za več epruvet.

VialTweeter na ultrazvočnem procesorju UP200ST

Sonikator VialTweeter za sočasno sonikacijo 10 vzorcev, npr. za lizo in ekstrakcijo beljakovin iz vzorcev FFPE

Protokol: ekstrakcija beljakovin iz vzorcev FFPE z napravo VialTweeter

Materiali in reagenti

Reagenti

Ksilen (histološke čistosti)
Etanol (absolutni 96%)
Pufer za lizo:

6 M gvanidinijev klorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine)
40 mM CAA (2-Chloroacetamide)

Zaviralec proteaz (neobvezno; npr. cOmplete™ mini EDTA-free)

Oprema

Ultrazvočna naprava VialTweeter za več epruvet
Mikrocentrifugirne epruvete s prostornino 1,5 mL ali 2,0 mL in nizko vezavo na površino
Grelni blok ali inkubator (nastavitvi 95°C in 80°C)
Mikrocentrifuga
Termomešalnik (neobvezen, vendar priporočen)

Začetna količina vzorca

1–2 rezini tkiva FFPE debeline 10 µm na vzorec (tj. na vialo)

ALI

Skupno ~100 µg tkiva na vzorec (tj. na vialo)

Opomba: Za rezanje z mikrotomom uporabite sveža rezila, da čim bolj zmanjšate kontaminacijo s parafinskimi ostanki.

Postopek

Deparafinizacija
1. Prenesite rezine FFPE v mikrocentrifugirne epruvete z nizko vezavo na površino.
2. Dodajte 1 mL ksilena in na kratko premešajte z vrtinčnim mešalnikom.
3. Inkubirajte 10 minut pri sobni temperaturi.
4. Centrifugirajte pri 14.000 × g 2 minuti; zavrzite supernatant.
5. Še enkrat ponovite spiranje s ksilenom (koraki 2–4).
6. Usedlino sperite z 1 mL 96% etanola, premešajte z vrtinčnim mešalnikom in nato centrifugirajte pri 14.000 × g 2 minuti. Zavrzite supernatant.
7. Še enkrat ponovite spiranje z etanolom (skupno 2 spiranji z etanolom).
8. Usedlino sušite na zraku 10 minut pri sobni temperaturi z odprtimi pokrovčki, da preostali etanol izhlapi.
Ekstrakcija beljakovin in sonikacija
1. Vsaki suhi usedlini dodajte 200 µL pufra za lizo. 
  Opomba: Čeprav sonikator omogoča obdelavo do 1 mL, je za nadaljnjo obdelavo optimalna prostornina 200 µL.
2. Premešajte z vrtinčnim mešalnikom ali nežnim pipetiranjem.
Prva toplotna inkubacija
1. Epruvete inkubirajte pri 95 °C 30 min ob stresanju pri 400 rpm s termomešalnikom ali grelnim blokom.
2. Pustite, da se vzorci 5 min ohlajajo pri sobni temperaturi.
Prva sonikacija z napravo VialTweeter
1. Epruvete vstavite v napravo VialTweeter.
2. Nastavite VialTweeter UP200St na spodnje vrednosti in izvedite sonikacijo.

Nastavitve sonikatorja
• Nastavite amplitudo (A) na 100%
• Nastavite pulzni način (C) na 100%
• Časovnik periode: vklopljen
• Čas vklopa: 60s
• Čas izklopa: 30s
• Mejna vrednost: 15 min (ustreza 10 ciklom)
(Opomba glede izračuna: (60 s vklopa + 30 s izklopa) × 10 ciklov = 900 s = 15 min)

Druga toplotna inkubacija
Odstranite epruvete in jih znova inkubirajte pri 95 °C 15 min, 400 rpm.
Druga sonikacija
Ponovite sonikacijo z napravo VialTweeter z enakimi nastavitvami (kot zgoraj) za dodatnih 10 ciklov (skupno 15 min).
Bistrenje lizata
1. Vzorce centrifugirajte pri 13.000 × g 10 min pri 23°C (sobna temperatura).
2. Supernatant previdno prenesite v novo epruveto Safe-lock Eppendorf s prostornino 2,0 mL. Pazite, da ne zmotite usedline.
Nadaljnja obdelava
Lizat je zdaj pripravljen za čiščenje SP3 in encimsko razgradnjo.

VialTweeter je edinstven ultrazvočni sistem za sočasno sonikacijo do 10 vial v povsem enakih pogojih brez navzkrižne kontaminacije.

VialTweeter z epruvetami Eppendorf s prostornino 2,0mL za zanesljivo pripravo vzorcev v sterilnih pogojih

Hielscher VialTweeter z 10 epruvetami Eppendorf

Opombe in dobre prakse

Tveganje pregrevanja med sonikacijo zmanjšuje programirano izmenjevanje ciklov vklopa in izklopa.
Po sonikaciji se izogibajte mešanju z vrtinčnim mešalnikom, da preprečite agregacijo beljakovin.

Odstranjevanje odpadkov in varnost

Ksilen in gvanidinijev klorid sta nevarni kemikaliji; z njima ravnajte v digestoriju.

Vse odpadke topil in biološke odpadke odstranite v skladu s protokoli ustanove za biološko varnost in kemijsko higieno.

Spodnja preglednica prikazuje približno zmogljivost obdelave naših laboratorijskih ultrazvočnih naprav:

Priporočene naprave	Prostornina šarže	Pretok
Sonikator UIP400MTP za plošče s 96 vdolbinicami	plošče z več vdolbinicami / mikrotitrske plošče	n.a.
Ultrazvočni CupHorn	CupHorn za viale ali čašo	n.a.
GDmini2	ultrazvočni mikropretočni reaktor	n.a.
VialTweeter	0,5 do 1,5mL	n.a.
UP100H	1 do 500mL	10 do 200mL/min
UP200Ht, UP200St	10 do 1000mL	20 do 200mL/min
UP400St	10 do 2000mL	20 do 400mL/min
Ultrazvočni stresalnik sit	n.a.	n.a.

Ultrazvočni homogenizatorji z visokim strigom se uporabljajo za laboratorijsko obdelavo, obdelavo z namiznimi napravami ter pilotno in industrijsko obdelavo.

Hielscher Ultrasonics izdeluje visokozmogljive ultrazvočne homogenizatorje za mešanje, dispergiranje, emulgiranje in ekstrakcijo v laboratorijskem, pilotnem in industrijskem merilu.

Sorodne teme

Literatura / reference

Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.

Pogosta vprašanja

Zakaj se tkivni vzorci fiksirajo kot FFPE?

Konzerviranje s fiksacijo v formalinu in vklapljanjem v parafin (FFPE) stabilizira morfologijo tkiva in strukture beljakovin z nastankom kovalentnih prečnih povezav prek formaldehida. Vklapljanje v parafin omogoča dolgotrajno shranjevanje pri sobni temperaturi, pri čemer ohranja histološko in molekularno celovitost za retrospektivne analize.

Kako deparafiniziram vzorce FFPE?

Deparafinizacija vključuje zaporedna spiranja s topili za odstranitev parafina: običajno dve inkubaciji s ksilenom, ki jima sledita dve spiranji z etanolom (96%). Po centrifugiranju in sušenju je tkivo pripravljeno za nadaljnjo ekstrakcijo. Ta postopek ponovno omogoči dostop do vzorca za lizo in encimsko razgradnjo.

Kakšen je namen toplotne inkubacije?

Toplotna inkubacija pomeni nadzorovano izpostavljanje vzorca določeni temperaturi za določeno časovno obdobje, da se sprožijo biokemijske ali fizikalne spremembe. V proteomiki se pogosto uporablja za denaturacijo beljakovin, odpravljanje prečnih povezav, nastalih zaradi formaldehida, v tkivih FFPE ali povečanje učinkovitosti pufra za lizo. Temperatura in trajanje sta ključna parametra, prilagojena ciljni reakciji ali vrsti vzorca.

Kaj je razgradnja SP3?

Priprava vzorcev v eni posodi s pomočjo trdne faze (SP3) je proteomski postopek, ki temelji na uporabi kroglic. Za vezavo beljakovin uporablja paramagnetne kroglice, kar omogoča učinkovito čiščenje, koncentriranje in encimsko razgradnjo na kroglicah v denaturacijskih pogojih. SP3 zmanjšuje izgubo vzorca na najmanjšo možno mero in je zelo združljiv z vzorci z majhno začetno količino materiala ter vzorci FFPE.

Visokozmogljiva ultrazvočna tehnologija! Ponudba izdelkov Hielscher zajema celoten spekter od kompaktnega laboratorijskega sonikatorja prek namiznih naprav do ultrazvočnih sistemov za celovito industrijsko uporabo.

Hielscher Ultrasonics izdeluje visokozmogljive ultrazvočne homogenizatorje od laboratorijskih do industrijskih velikosti.