Protokol z uporabo Hielscherjevih večvzorčnih sonikatorjev v biofilmu in proteomski analizi

Uporaba sonicatorjev z več vzorci, kot sta VialTweeter Multi-Tube Sonicator in UIP400MTP Microplate Sonicator, racionalizira laboratorijske delovne tokove za visoko zmogljive aplikacije. Obe napravi omogočata natančno in enakomerno ultrazvočno obdelavo na več vzorcih, kar zmanjšuje variabilnost in povečuje ponovljivost. To je še posebej koristno pri poskusih, ki zahtevajo dosledno lizo vzorcev, ločevanje biofilma, ekstrakcijo beljakovin ali proteolitično razgradnjo, kjer so ročne metode ali metode z enim vzorcem manj učinkovite in nagnjene k nedoslednosti.

Poenostavite poteke dela z večvzorčnimi zvočniki

UIP400MTP na primer omogoča hkratno ultrazvočno obdelavo vdolbinic z mikroploščami, kar zagotavlja enakomerno ločevanje biofilmov ali celičnega materiala. Medtem VialTweeter ponuja natančno lizo in homogenizacijo več vzorcev epruvete brez navzkrižne kontaminacije. Ti sonikatorji znatno skrajšajo čas obdelave, izboljšajo eksperimentalno ponovljivost in ohranjajo visoko celovitost vzorca, zaradi česar so nepogrešljiva orodja v mikrobiologiji, proteomiki in raziskavah molekularne biologije.
Spodaj je podroben protokol, ki ponazarja uporabo Hielscherjevih modelov sonikatorja z več vzorci, VialTweeter Multi-Tube Sonicator in Microplate Sonicator UIP400MTP, v študiji, ki vključuje tvorbo biofilma E. coli in kasnejšo proteomsko analizo.

Protokol: Tvorba, odmik in proteomska analiza biofilma z uporabo Hielscherjevih zvočnih aparatov z več vzorci

1. Priprava bakterijske kulture

• Bakterija E. coli (sev W3110) pri 30 °C, temperaturi, ki je ugodna za tvorbo biofilma E. coli, v mediju triptonske juhe (TB), ki vsebuje:
  – 10 g/l triptona
  – 5 g/l NaCl
• Po potrebi dopolnite z antibiotiki, da zagotovite zadrževanje plazmidov.
• Za mikroskopske študije in študije aktivnosti promotorjev uporabite sev W3110 E. coli z genomsko okrepljenim reporterjem GFP (eGFP) pod nadzorom promotorja rplL.
• Uporabite GFP reporterske plazmide za različne promotorje (npr. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) za merjenje dejavnosti promotorjev.

2. Gojenje in ločevanje biofilma

• 1,5 ml razredčene bakterijske kulture na vdolbinico sejemo v ploščo z 12 jamicami (plošče CellStar z 12 jamicami, Greiner Bio-One).
• Inkubirajte, da omogočite nastanek biofilma.
• Previdno odstranite planktonsko (neadherentno) kulturo.

– Vsako jamico speremo s 500 μl PBS.
– Odstranite pritrjene celice tako, da ultrazvočno razbijete 12-jamično ploščo v UIP400MTP ultraplošči. UIP400MTP zagotavlja enakomerno ločitev z zagotavljanjem dosledne ultrazvočne energije v vseh vrtinah.
– Nastavitve ultrazvočne obdelave: 60% amplituda, način cikla: 60 sekund vklopljen / 30 sekund izklopljen.

3. Nabiranje celic in liza

• Ločene celice biofilma centrifugiramo pri 4 500 g 5 minut.
• Peletirane celice sperite s PBS.
• Resuspendirajte celice v 100 μl 2 % natrijevega lauroil sarkozinata (SLS) in inkubiramo pri 95 °C 15 minut.
• Sonicate z uporabo VialTweeter Multi-Tube Sonicator, da zagotovite popolno lizo celic.
  – Nastavitve ultrazvočne obdelave: 100% amplituda, 50 s ON / 10 s OFF za 10 min skupnega časa delovanja; Vzorce hranite na ledu.

4. Redukcija in alkilacija

• Dodamo 5 mM Tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP), da zmanjšamo disulfidne vezi, in inkubiramo pri 95 °C 15 minut.
• Alkilatne beljakovine z 10 mM jodoacetamidom 30 minut pri 25 °C.

5. Kvantifikacija in prebava beljakovin

• Centrifugirajte lizate, da odstranite ostanke.
• Količinsko določite skupno vsebnost beljakovin z uporabo kompleta za testiranje beljakovin Pierce BCA.
• 50 μg skupne beljakovine razložimo z 1 μg tripsina v raztopini, ki vsebuje 2 % SLS in 100 mM amonijevega bikarbonata.
• Reakcijo razgradnje inkubirajte čez noč pri 30 °C.

6. Čiščenje peptidov

• Oborimo SLS z dodajanjem 1,5% trifluoroocetne kisline (TFA), nato centrifugiramo.
• Peptide očistite z uporabo C18 microspin kolon.
• Posušite prečiščene peptide in resuspendirajte v 0,1% TFA.

7. Tekočinska kromatografija-masna spektrometrija (LC-MS/MS)

• Analizirajte peptide na masnem spektrometru Q-Exactive Plus, povezanem z nano sistemom Ultimate 3000 RSLC.
• Peptide ločite z uporabo HPLC kolone z reverzno fazo (75 μm × 42 cm), napolnjene s smolo C18 (2,4 μm).
• Nanesite gradient od 2 % do 35 % topila B (acetonitril z 0,15 % mravljične kisline) v 140 minutah.
• Pridobite podatke z uporabo MS skeniranja visoke ločljivosti, ki jim sledi tandemsko MS / MS skeniranje 10 najintenzivnejših ionov.

8. Analiza podatkov

• Obdelajte neobdelane podatke LC-MS s programsko opremo Progenesis.
• Izvozite datoteke .mgf in jih analizirajte z MASCOT.
• Izvedite kvantifikacijo peptidov z uporabo SafeQuant za nadzor kakovosti in prilagoditev napačnega odkrivanja.
• Izvedite vse poskuse v dvojnikih ali triplikih, da zagotovite ponovljivost.

Zvočni aparati z več vzorci za visoko zmogljivo pripravo vzorcev

Modeli sonikatorjev z več vzorci VialTweeter in UIP400MTP znatno povečajo natančnost in učinkovitost eksperimentalnih delovnih tokov, zlasti pri raziskavah biofilma in proteomiki. Njihova sposobnost enakomerne obdelave več vzorcev zagotavlja visoko zmogljivost brez ogrožanja kakovosti podatkov. Zaradi teh prednosti, v kombinaciji z zgoraj opisanimi poenostavljenimi delovnimi tokovi, so Hielscher sonicatorji z več vzorci bistvena orodja za sodobne biološke raziskave.

Projektiranje, izdelava in svetovanje – Kakovost izdelana v Nemčiji

Hielscher ultrazvočni aparati so znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih aparatov v industrijske objekte. Težke pogoje in zahtevna okolja zlahka obvladajo Hielscher ultrasonicatorji.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visoko zmogljivim ultrazvočnim aparatom z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so Hielscher ultrazvočni aparati skladni s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.