Protokol z uporabo sonikatorjev Hielscher za več vzorcev pri analizi biofilmov in proteomski analizi

Uporaba sonikatorjev za več vzorcev, kot sta VialTweeter Multi-Tube Sonicator in UIP400MTP Microplate Sonicator, poenostavlja laboratorijske delovne postopke pri aplikacijah z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev. Obe napravi omogočata natančno in enakomerno ultrazvočno obdelavo več vzorcev, kar zmanjšuje variabilnost in izboljšuje ponovljivost. To je še posebej koristno pri poskusih, ki zahtevajo dosledno lizo vzorcev, odlepljanje biofilma, ekstrakcijo beljakovin ali proteolitično razgradnjo, pri katerih so ročne metode ali metode obdelave posameznih vzorcev manj učinkovite in bolj podvržene nedoslednosti.

Poenostavite delovne postopke s sonikatorji za več vzorcev

UIP400MTP na primer omogoča sočasno ultrazvočno obdelavo vdolbinic mikrotitrske plošče, kar zagotavlja enakomerno odlepljanje biofilmov ali celičnega materiala. VialTweeter pa omogoča natančno lizo in homogenizacijo več vzorcev v epruvetah brez navzkrižne kontaminacije. Ti sonikatorji znatno skrajšajo čas obdelave, izboljšajo ponovljivost poskusov in ohranjajo visoko stopnjo celovitosti vzorcev, zato so nepogrešljiva orodja pri raziskavah v mikrobiologiji, proteomiki in molekularni biologiji.
V nadaljevanju je podroben protokol, ki ponazarja uporabo modelov sonikatorjev Hielscher za več vzorcev, VialTweeter Multi-Tube Sonicator in Microplate Sonicator UIP400MTP, v raziskavi nastajanja biofilma E. coli in nadaljnje proteomske analize.

Protokol: nastajanje in odlepljanje biofilma ter proteomska analiza z uporabo sonikatorjev Hielscher za več vzorcev

1. Priprava bakterijske kulture

• Bakterije E. coli (sev W3110) gojite pri 30°C, temperaturi, ugodni za nastajanje biofilma E. coli, v gojišču s triptonsko juho (TB), ki vsebuje:
  – 10 g/L triptona
  – 5 g/L NaCl
• Po potrebi dodajte antibiotike, da zagotovite ohranitev plazmidov.
• Za mikroskopijo in preučevanje aktivnosti promotorjev uporabite sev E. coli W3110 z genomskim reporterskim zapisom za izboljšani GFP (eGFP) pod nadzorom promotorja rplL.
• Za merjenje aktivnosti promotorjev uporabite reporterske plazmide GFP za različne promotorje (npr., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ).

2. Gojenje in odlepljanje biofilma

• V vsako vdolbinico plošče z 12 vdolbinicami (plošče CellStar z 12 vdolbinicami, Greiner Bio-One) nacepite 1,5 mL razredčene bakterijske kulture.
• Inkubirajte, da omogočite nastanek biofilma.
• Previdno odstranite planktonsko (nepritrjeno) kulturo.

– Vsako vdolbinico sperite s 500 µL PBS.
– Pritrjene celice odlepite s sonikacijo plošče z 12 vdolbinicami v sonikatorju za mikrotitrske plošče UIP400MTP. UIP400MTP zagotavlja enakomerno odlepljanje z dovajanjem enake ultrazvočne energije v vse vdolbinice.
– Nastavitve sonikacije: 60% amplituda, ciklični način: 60 sec VKLOP / 30 sec IZKLOP.

3. Zbiranje in liza celic

• Odlepljene celice biofilma centrifugirajte pri 4.500 g 5 minut.
• Celice v usedlini sperite s PBS.
• Celice resuspendirajte v 100 µL 2% natrijevega lavroil sarkozinata (SLS) in inkubirajte pri 95°C 15 minut.
• Sonificirajte z napravo VialTweeter Multi-Tube Sonicator, da zagotovite popolno lizo celic.
  – Nastavitve sonikacije: 100% amplituda, 50 s VKLOP / 10 s IZKLOP s skupnim časom delovanja 10 min; vzorce hranite na ledu.

4. Redukcija in alkilacija

• Dodajte 5 mM tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP) za redukcijo disulfidnih vezi in inkubirajte pri 95°C 15 minut.
• Beljakovine alkilirajte z 10 mM jodoacetamida 30 minut pri 25°C.

5. Kvantifikacija in razgradnja beljakovin

• Lizate centrifugirajte, da odstranite celične ostanke.
• Skupno vsebnost beljakovin kvantificirajte s kompletom Pierce BCA Protein Assay Kit.
• 50 µg skupnih beljakovin razgradite z 1 µg tripsina v raztopini, ki vsebuje 2% SLS in 100 mM amonijevega hidrogenkarbonata.
• Reakcijsko zmes za razgradnjo inkubirajte čez noč pri 30°C.

6. Čiščenje peptidov

• SLS oborite z dodatkom 1,5% trifluoroocetne kisline (TFA), nato centrifugirajte.
• Peptide očistite z mikrocentrifugalnimi kolonami C18.
• Očiščene peptide posušite in resuspendirajte v 0.1% TFA.

7. Tekočinska kromatografija z masno spektrometrijo (LC-MS/MS)

• Peptide analizirajte z masnim spektrometrom Q-Exactive Plus, povezanim s sistemom Ultimate 3000 RSLC nano.
• Peptide ločite s kolono za HPLC z obrnjeno fazo (75 µm × 42 cm), napolnjeno s smolo C18 (2,4 µm).
• V 140 minutah izvedite gradient od 2% do 35% topila B (acetonitril z 0,15% mravljinčne kisline).
• Podatke zajemite z visokoločljivostnimi meritvami MS, ki jim sledijo tandemske meritve MS/MS 10 ionov z največjo intenziteto.

8. Analiza podatkov

• Surove podatke LC-MS obdelajte s programsko opremo Progenesis.
• Izvozite datoteke .mgf in jih analizirajte z MASCOT.
• Kvantifikacijo peptidov izvedite s programom SafeQuant za nadzor kakovosti in prilagoditev glede na lažna odkritja.
• Vse poskuse izvedite v dveh ali treh ponovitvah, da zagotovite ponovljivost.

Sonikatorji za več vzorcev za pripravo vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave

Modela sonikatorjev za več vzorcev VialTweeter in UIP400MTP znatno izboljšata natančnost in učinkovitost eksperimentalnih delovnih postopkov, zlasti pri raziskavah biofilmov in v proteomiki. Njuna sposobnost enakomerne obdelave več vzorcev zagotavlja visoko zmogljivost obdelave vzorcev brez poslabšanja kakovosti podatkov. Zaradi teh prednosti in zgoraj opisanih poenostavljenih delovnih postopkov so sonikatorji Hielscher za več vzorcev bistvena orodja za sodobne biološke raziskave.

Načrtovanje, proizvodnja in svetovanje – kakovost iz Nemčije

Ultrazvočne naprave Hielscher so znane po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključitev naših ultrazvočnih naprav v industrijske obrate. Ultrazvočne naprave Hielscher zlahka obvladujejo težke razmere in zahtevna okolja.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visokozmogljivim ultrazvočnim napravam z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Ultrazvočne naprave Hielscher so seveda skladne s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.