Protokol gojenja in ločitve biofilma Staphylococcus

Standardizirane metode so bistvenega pomena za zanesljive rezultate raziskav. Tukaj lahko najdete protokol gojenja in ločitve stafilokoknih biofilmov. Ta protokol se osredotoča na poenostavljeno visoko zmogljivo pripravo vzorcev z uporabo UIP400MTP zvočnega plošča z več vdolbicami za učinkovito, visoko zmogljivo ločevanje biofilma na ploščah s 96 vdolbinicami. Protokol vsebuje tudi ključne korake za gojenje, pranje in vizualizacijo biofilma, s poudarkom na zmanjšanju variabilnosti in zagotavljanju ponovljivosti.

Staphylococcus Biofilm in raziskave antibiotikov

Biofilmi stafilokoka igrajo ključno vlogo pri trajnih okužbah zaradi svoje odpornosti na antibiotike in imunske odzive. Nastajanje biofilma zagotavlja zaščitno okolje za bakterije, zaradi česar je okužbe težko zdraviti. Raziskave biofilmov se pogosto osredotočajo na razumevanje njihovega nastanka, vedenja in dovzetnosti za protimikrobna zdravila, s poudarkom na visoko zmogljivih metodah za racionalizacijo eksperimentalnih delovnih tokov.
Sonikator z več vdolbicami UIP400MTP ponuja pomembno prednost pri raziskavah biofilma, saj omogoča hitro in učinkovito ločevanje biofilmov s plošč s 96 jamicami. Ta naprava zagotavlja enotno ultrazvočno energijo vsem vrtinam, kar zagotavlja dosledne rezultate in hkrati zmanjšuje variabilnost.

Protokol za gojenje in ločevanje biofilma stafilokoka

Spodaj vas vodimo z navodili po korakih skozi postopek gojenja in ločevanja biofilma stafilokoka. Kot zgled analitičnega koraka vam pokažemo, kako kvantificirati spektrofotometrično kultivirano biomaso s kristalno vijoličnim barvanjem.

Gojenje biofilma Staphylococcus

Potrebni materiali:

• Sterilne mikrotitrijske plošče z ravnim dnom z 96 jamicami s polistirensko tkivno kulturo, obdelane s pokrovi
• Triptična sojina juha (TSB) z 0,25% glukoze
• Omarica za biološko varnost

Korake:

1. Pripravite sterilno delovno okolje v omari za biološko varnost, da zmanjšate kontaminacijo.
2. Dodajte TSB, ki vsebuje 0,25% glukoze, v vdolbinice mikrotitrične plošče. TSB brez glukoze na splošno ne podpira tvorbe biofilma in ga je treba uporabljati le kot kontrolo, če je potrebno.
3. Vdolbinice inokuliramo z bakterijskimi sevi, pripravljenimi na naslednji način:
4. Pripravite bakterijske suspenzije, pri čemer zagotovite, da ni že obstoječih celičnih grozdov, tako da homogenizirate suspenzije z ultrazvočnim razbijanjem ali z razbijanjem grozdov z iglo 23 gauge in kratkim vrtinčenjem.
5. Ploščo zaprite s pokrovom in inkubirajte v pogojih, ki so optimalni za nastajanje biofilma (npr. 37 °C 24 ur).
6. Poskus izvedite v treh izvodih za vsak bakterijski sev (tri vdolbinice na sev), da zagotovite zanesljivost.
7. Dodelite šest vdolbinic na ploščo za negativne kontrole. Na 96-jamično ploščo se lahko testira do 30 sevov.

Vizualizacija in pranje biofilma

1. Po inkubaciji gojišče previdno zavrzite, da ne motite biofilma.
2. Vsako vdolbinico štirikrat operite s fiziološko raztopino, da odstranite planktonske bakterije.
3. Preglejte dno vdolbinic, ali so bele lise, ki kažejo na prisotnost biofilma.

Odvajanje biofilma z uporabo zvočnega aparata z več vdolbinicami UIP400MTP

Nastavitev naprave in parametri:

• UIP400MTP sonikator z več vdolbicami
• Nastavitve delovanja: 60% amplituda, način cikla s 60 sekundami vklopa / 30 sekund izklopa

Korake:

1. Oprano mikrotitarsko ploščo postavite na UIP400MTP ploščo.
2. Sonikirajte vzorce pri priporočenih nastavitvah (60% amplituda, 60 sekund vklopljeno, 30 sekund IZKLOPLJENO). Prilagodite nastavitve sevu bakterij.
3. Začnite postopek ultrazvočnega razbijanja, da ločite biofilm. Ultrazvočni valovi motijo matrico biofilma in sproščajo adherentne bakterije.
4. UIP400MTP zagotavlja enakomerno izpostavljenost v vseh vdolbinicah za dosledne rezultate ločevanja.

Analitski korak: Kvantifikacija ločene biomase biofilma stafilokoka z uporabo kristalno vijolične barve (CV)

Potrebni materiali:

• 0.1 % raztopina kristalno vijolične (CV)
• 95% etanol ali 30% ocetna kislina (za raztapljanje)
• Čitalnik mikroplošč z možnostjo odčitavanja pri 570 nm
• Sterilne mikrotitrijske plošče za barvanje

Korake:

1. Priprava plošče za barvanje: Prenesite 100 μl ločene suspenzije biofilma iz vsake jamice sonikirane plošče v ustrezne vdolbinice čiste, sterilne mikrotitrijske plošče z 96 jamicami. To zagotavlja jasno in enakomerno okolje za barvanje.
2. Barvanje ločenega biofilma: V vsako jamico, ki vsebuje ločeno suspenzijo biofilma, dodamo 150 μl 0,1 % raztopine kristalno vijolične barve. Nežno pipetirajte, da zagotovite enakomerno mešanje suspenzije biofilma in kristalno vijolične barve.
3. Inkubacija: Plošča se inkubira pri sobni temperaturi 15 minut, da lahko kristalno vijolična učinkovito obarva biomaso.
4. Pranje: Po inkubaciji previdno zavrzite kristalno vijolično raztopino iz vdolbinic, ne da bi pri tem motili biomaso. Vsako vdolbinico trikrat operite s sterilno fiziološko raztopino, da odstranite nevezan madež.
5. Sušenje: Ploščo pustite, da se posuši na zraku pri sobni temperaturi ali pod sterilnim pokrovom za pretok zraka. Izogibajte se segrevanju, saj lahko to spremeni rezultate.
6. Raztapljanje: V vsako jamico dodajte 200 μl 95% etanola (ali 30% ocetne kisline, odvisno od standardne laboratorijske prakse), da se raztopi vezana kristalno vijolična. Nežno premešajte s pipetiranjem ali stresanjem plošče 10 minut pri sobni temperaturi.
7. Merjenje: Izmerite optično gostoto (OD) topne raztopine kristalno vijolične barve pri 570 nm z uporabo čitalnika mikroplošč.
8. Analiza podatkov: Odštejte povprečno vrednost OD570 negativnih kontrol (vdolbinice s TSB, vendar brez bakterijskega inokuluma) iz eksperimentalnih vdolbinic, da upoštevate obarvanje ozadja. Beležite in analizirajte podatke.

Opomba: Poskus izvedite v treh izvodih za vsak pogoj, da zagotovite ponovljivost. Zagotovite pravilno ravnanje s kristalno vijolično in etanolom ter upoštevajte varnostne protokole in protokole odstranjevanja.
 

Ključne prednosti UIP400MTP na kratko:

• Visoko zmogljiva obdelava: Zasnovan posebej za plošče z več vdolbinicami, kar vam omogoča hkratno obdelavo več vzorcev.
• Enotna ultrazvočna porazdelitev: Zagotavlja enako ultrazvočno intenzivnost v vrtinah in zagotavlja dosledne rezultate v vseh vzorcih.
• Uporabite katero koli standardno ploščo: UIP400MTP lahko obdeluje vse standardne krožnike z več vdolbinicami, petrijevke in stojala za cevi. Drage lastniške plošče niso potrebne!
• Uporabniku prijazen vmesnik: Enostavna nastavitev in nadzor, zaradi česar je odlično orodje za povečanje produktivnosti laboratorija. Programabilne nastavitve in avtomatizacija olajšajo standardizacijo procesov!