Protokol za gojenje in odstranjevanje biofilma bakterij rodu Staphylococcus

Standardizirane metode so bistvene za zanesljive rezultate raziskav. Tukaj je na voljo protokol za gojenje in odstranjevanje stafilokoknih biofilmov. Ta protokol se osredotoča na poenostavljeno pripravo vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave z uporabo sonikatorja za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP za učinkovito odstranjevanje biofilmov z visoko zmogljivostjo obdelave na ploščah s 96 vdolbinicami. Protokol vsebuje tudi ključne korake za gojenje, izpiranje in vizualizacijo biofilmov, pri čemer je poudarek na zmanjševanju variabilnosti in zagotavljanju ponovljivosti.

Raziskave stafilokoknih biofilmov in antibiotikov

Stafilokokni biofilmi imajo ključno vlogo pri trdovratnih okužbah zaradi svoje odpornosti proti antibiotikom in imunskim odzivom. Nastanek biofilma bakterijam zagotavlja zaščitno okolje, zaradi česar je okužbe težko zdraviti. Raziskave biofilmov se pogosto osredotočajo na razumevanje njihovega nastanka, vedenja in občutljivosti za protimikrobna sredstva, s poudarkom na metodah z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev za poenostavitev eksperimentalnih delovnih postopkov.
Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP zagotavlja pomembno prednost pri raziskavah biofilmov, saj omogoča hitro in učinkovito odstranjevanje biofilmov s plošč s 96 vdolbinicami. Ta naprava vsem vdolbinicam dovaja enakomerno ultrazvočno energijo, s čimer zagotavlja dosledne rezultate in hkrati zmanjšuje variabilnost.

Protokol za gojenje in odstranjevanje biofilma bakterij rodu Staphylococcus

V nadaljevanju vas z navodili po korakih vodimo skozi postopek gojenja in odstranjevanja stafilokoknega biofilma. Kot primer analitičnega koraka vam pokažemo, kako z barvanjem s kristal vijoličnim spektrofotometrično kvantificirati gojeno biomaso.

Gojenje biofilma bakterij rodu Staphylococcus

Potrebni materiali:

• Sterilne polistirenske mikrotitrske plošče s 96 vdolbinicami z ravnim dnom, s površino, obdelano za gojenje tkivnih kultur, in s pokrovi
• Triptična sojina juha (TSB) z 0,25% glukoze
• Biološka varnostna komora

Koraki:

1. V biološki varnostni komori pripravite sterilno delovno okolje, da čim bolj zmanjšate kontaminacijo.
2. V vdolbinice mikrotitrske plošče dodajte TSB, ki vsebuje 0,25% glukoze. TSB brez glukoze na splošno ne podpira nastanka biofilma in ga uporabite samo kot kontrolo, če je to potrebno.
3. Vdolbinice inokulirajte z bakterijskimi sevi, pripravljenimi, kot je opisano spodaj:
4. Pripravite bakterijske suspenzije in zagotovite, da ne vsebujejo že obstoječih skupkov celic, tako da suspenzije homogenizirate s sonikacijo ali skupke razbijete z iglo velikosti 23 G in kratkim mešanjem na vrtinčnem mešalniku.
5. Ploščo zaprite z njenim pokrovom in inkubirajte v pogojih, optimalnih za nastanek biofilma (npr. pri 37°C 24 ur).
6. Poskus izvedite v treh ponovitvah za vsak bakterijski sev (tri vdolbinice na sev), da zagotovite zanesljivost.
7. Na vsaki plošči namenite šest vdolbinic negativnim kontrolam. Na posamezni plošči s 96 vdolbinicami lahko testirate do 30 sevov.

Vizualizacija in izpiranje biofilma

1. Po inkubaciji previdno zavrzite gojišče, da ne porušite biofilma.
2. Vsako vdolbinico štirikrat izperite s fiziološko raztopino, da odstranite planktonske bakterije.
3. Preglejte dno vdolbinic in preverite, ali so prisotne bele lise, ki kažejo na prisotnost biofilma.

Odstranjevanje biofilma s sonikatorjem za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP

Nastavitev naprave in parametri:

• Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP
• Delovne nastavitve: 60% amplituda, ciklično delovanje s 60 sekundami VKLOPA / 30 sekundami IZKLOPA

Koraki:

1. Izprano mikrotitrsko ploščo postavite na platformo UIP400MTP.
2. Vzorce sonikirajte pri priporočenih nastavitvah (60% amplituda, 60 sekund VKLOPA, 30 sekund IZKLOPA). Nastavitve prilagodite bakterijskemu sevu.
3. Zaženite postopek sonikacije, da odstranite biofilm. Ultrazvočni valovi porušijo matriks biofilma in sprostijo pritrjene bakterije.
4. UIP400MTP zagotavlja enakomerno izpostavljenost v vseh vdolbinicah za dosledne rezultate odstranjevanja.

Analitični korak: kvantifikacija biomase odstranjenega stafilokoknega biofilma s kristal vijoličnim (CV)

Potrebni materiali:

• 0,1% raztopina kristal vijoličnega (CV)
• 95% etanol ali 30% ocetna kislina (za raztapljanje)
• Čitalnik mikroplošč, ki omogoča merjenje pri 570 nm
• Sterilne mikrotitrske plošče za barvanje

Koraki:

1. Priprava plošče za barvanje: Iz vsake vdolbinice sonikirane plošče prenesite 100 µL suspenzije odstranjenega biofilma v ustrezne vdolbinice čiste, sterilne mikrotitrske plošče s 96 vdolbinicami. Tako zagotovite čisto in enotno okolje za barvanje.
2. Barvanje odstranjenega biofilma: V vsako vdolbinico, ki vsebuje suspenzijo odstranjenega biofilma, dodajte 150 µL 0,1% raztopine kristal vijoličnega. Nežno pipetirajte, da zagotovite enakomerno mešanje suspenzije biofilma in kristal vijoličnega.
3. Inkubacija: Ploščo inkubirajte pri sobni temperaturi 15 minut, da kristal vijolično učinkovito obarva biomaso.
4. Izpiranje: Po inkubaciji previdno zavrzite raztopino kristal vijoličnega iz vdolbinic, ne da bi pri tem porušili biomaso. Vsako vdolbinico trikrat izperite s sterilno fiziološko raztopino, da odstranite nevezano barvilo.
5. Sušenje: Pustite, da se plošča posuši na zraku pri sobni temperaturi ali v komori s sterilnim pretokom zraka. Izogibajte se segrevanju, saj lahko to spremeni rezultate.
6. Raztapljanje: V vsako vdolbinico dodajte 200 µL 95% etanola (ali 30% ocetne kisline, odvisno od standardnih laboratorijskih praks), da raztopite vezano kristal vijolično. Nežno mešajte s pipetiranjem ali stresanjem plošče 10 minut pri sobni temperaturi.
7. Merjenje: S čitalnikom mikroplošč izmerite optično gostoto (OD) raztopljenega kristal vijoličnega pri 570 nm.
8. Analiza podatkov: Od vrednosti v eksperimentalnih vdolbinicah odštejte povprečno vrednost OD570 negativnih kontrol (vdolbinic s TSB, vendar brez bakterijskega inokuluma), da upoštevate obarvanje ozadja. Podatke zabeležite in analizirajte.

Opomba: Poskus izvedite v treh ponovitvah za vsak pogoj, da zagotovite ponovljivost. Zagotovite pravilno ravnanje s kristal vijoličnim in etanolom ter upoštevajte varnostne protokole in protokole odstranjevanja odpadkov.
 

Ključne prednosti UIP400MTP na enem mestu:

• Visoka zmogljivost obdelave vzorcev: Zasnovan posebej za plošče z več vdolbinicami, kar vam omogoča hkratno obdelavo več vzorcev.
• Enakomerna porazdelitev ultrazvoka: Zagotavlja enako ultrazvočno intenzivnost v vseh vdolbinicah in s tem dosledne rezultate pri vseh vzorcih.
• Uporabite katero koli standardno ploščo: UIP400MTP omogoča obdelavo v katerih koli standardnih ploščah z več vdolbinicami, petrijevkah in stojalih za epruvete. Drage namenske plošče niso potrebne!
• Uporabniku prijazen vmesnik: Preprosta nastavitev in upravljanje zagotavljata odlično orodje za povečanje laboratorijske produktivnosti. Programirljive nastavitve in avtomatizacija olajšajo standardizacijo postopkov!