Protokol preskusa MBEC s sonikatorjem UIP400MTP za plošče s 96 vdolbinicami

Preskus MBEC se uporablja za določanje koncentracije protimikrobnih sredstev, potrebne za odstranitev biofilmov, nastalih na pokrovih z zatiči. Za oceno viabilnosti biofilmov jih je treba najprej ločiti od pokrovov z zatiči plošče s 96 vdolbinicami. Sonikacija je najzanesljivejša in najučinkovitejša metoda za to ločevanje. Sonikator UIP400MTP za plošče z več vdolbinicami je posebej zasnovan za obdelavo preskusnih plošč z največjo učinkovitostjo in priročnostjo ter poenostavlja in pospešuje preskuse MBEC z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev.

Sonikacija za ločevanje biofilmov

Sonikacija je ključni korak pri preskusih najmanjše koncentracije za eradikacijo biofilma (MBEC), saj omogoča učinkovito odstranjevanje celic biofilma s površine, na katero so pritrjene. Biofilmi so po svoji naravi strukturirane združbe mikroorganizmov, obdane z zunajceličnim matriksom, zaradi katerega so v primerjavi s planktonskimi celicami bistveno odpornejši proti protimikrobnim sredstvom. Pri preskusih MBEC sonikacija z ultrazvočnimi valovi ustvarja nadzorovano kavitacijo, ki poruši matriks biofilma in sprosti v njem ujete celice v suspenzijo. Ta korak zagotavlja enakomerno porazdelitev celic biofilma v mediju za obnovitev celic, kar omogoča natančno ocenjevanje viabilnosti z nacepljanjem, redčenjem ali spektrofotometričnimi metodami. Brez ustreznega ločevanja biofilma bi lahko preostale sestavine matriksa ščitile celice, kar bi povzročilo podcenjevanje učinkovitosti protimikrobnih sredstev. Zato je sonikacija nepogrešljiva za pridobivanje zanesljivih in ponovljivih vrednosti MBEC, ki odražajo dejanski eradikacijski potencial preskušanih sredstev. Sonikator UIP400MTP za plošče z več vdolbinicami omogoča preprosto pripravo vzorcev v preskusnih ploščah z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev.

Protokol preskusa najmanjše koncentracije za eradikacijo biofilma (MBEC)

Korak 1: Nastanek biofilma

1. Pripravite bakterijsko suspenzijo:
   Gojite bakterije v ustreznih gojiščih do logaritemske faze rasti.
   Bakterijsko kulturo razredčite do določene optične gostote (npr. OD600 ~0,1).
2. Inokulirajte ploščo s 96 vdolbinicami:
   Dodajte bakterijsko suspenzijo (npr. 150–200 µL) v vsako vdolbinico standardne mikrotitrske plošče s 96 vdolbinicami.
3. Namestite pokrov z zatiči:
   Pokrov z zatiči namestite na inokulirano ploščo, da omogočite nastanek biofilma na površinah zatičev.
4. Inkubirajte ploščo:
   Sestavljeno ploščo inkubirajte pri ustrezni temperaturi (npr. 37°C) 24–48 ur brez stresanja, da spodbudite rast biofilma.

Korak 2: Obdelava s protimikrobnimi sredstvi

• Pripravite protimikrobne raztopine:
  V svežih gojiščih pripravite niz koncentracij protimikrobnih sredstev.
  Biofilme izpostavite protimikrobnim sredstvom:
  Pokrov z zatiči odstranite iz bakterijske kulture in ga sperite v sterilni fiziološki raztopini ali PBS, da odstranite planktonske celice.
  Pokrov z zatiči namestite v novo ploščo s 96 vdolbinicami, ki vsebuje protimikrobne raztopine.
• Inkubirajte ploščo:
  Inkubirajte določen čas (npr. 24 ur), da omogočite izpostavljenost protimikrobnim sredstvom.

Korak 3: Sonikacija s sonikatorjem UIP400MTP za plošče s 96 vdolbinicami

Korak sonikacije je ključen za ločevanje biofilmov od pokrovov z zatiči za oceno viabilnosti. Pri uporabi sonikatorja UIP400MTP sledite tem korakom:

1. Pripravite postavitev:
   Vsako vdolbinico nove plošče s 96 vdolbinicami napolnite z medijem za obnovitev celic (npr. nevtralizacijsko bujonsko gojišče ali sveže rastno gojišče).
2. Prenesite pokrov z zatiči:
   Pokrov z zatiči odstranite s plošče za obdelavo s protimikrobnimi sredstvi.
   Pokrov z zatiči sperite v sterilni fiziološki raztopini ali PBS, da odstranite preostala protimikrobna sredstva.
3. Namestite ploščo in sonikator:
   Pokrov z zatiči namestite na ploščo z medijem za obnovitev celic.
   Ploščo z medijem za obnovitev celic postavite na platformo sonikatorja UIP400MTP in zagotovite, da je plošča nameščena na sredini in stabilna.
4. Prilagodite parametre sonikacije:
   Na napravi UIP400MTP nastavite parametre sonikacije (nastavitve je mogoče prilagoditi biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Čas sonikacije: 1–3 minute (prilagodite glede na trdovratnost biofilma) v cikličnem načinu.
5. Izvedite sonikacijo:
   Zaženite postopek sonikacije. Ultrazvočne vibracije bodo biofilme s površin zatičev sprostile v medij za obnovitev celic.
6. Spremljajte postopek:
   Za spremljanje temperature vzorcev v vdolbinicah uporabite priklopni temperaturni senzor. UIP400MTP je mogoče za hlajenje priključiti na laboratorijski hladilnik.
7. Ravnanje po sonikaciji:
   Medij za obnovitev celic (ki zdaj vsebuje ločene biofilme) nemudoma prenesite v novo sterilno ploščo za nadaljnjo analizo.

(A) Plošča, ki vsebuje TSB z 2% glukoze in se uporablja za nastanek biofilma, obnovitev celic in
določanje MIC in MBCB; (B) Pokrov z zatiči za nastanek stafilokoknih biofilmov. določanje MIC in MBCB; (B) Pokrov z zatiči za nastanek stafilokoknih biofilmov.
Celice biofilma, nastale na zatičih, so bile odstranjene s sonikacijo (Hielscher Ultrasound Technology) 5 min v ploščah s 96 vdolbinicami, ki so vsebovale sveže gojišče za obnovitev celic.
(Slika in študija: ©de Oliveira et al., 2016)

Korak 4: Ocena viabilnosti

Nacepite in gojite ločene biofilme:

1. Pripravite zaporedne razredčitve medija za obnovitev celic in jih nacepite na agar, da preštejete kolonijske enote (CFU).
   Lahko pa uporabite kolorimetrični preskus viabilnosti ali preskus viabilnosti na osnovi fluorescence.
2. Zabeležite rezultate:
   MBEC določite kot najnižjo koncentracijo protimikrobnega sredstva, ki je odpravila zaznavno viabilnost biofilma.

Zasnova, proizvodnja in svetovanje – kakovost, izdelana v Nemčiji

Ultrazvočne naprave Hielscher so znane po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključitev naših ultrazvočnih naprav v industrijske obrate. Sonikatorji Hielscher zlahka obvladujejo težke razmere in zahtevna okolja.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visokozmogljivim ultrazvočnim napravam z najsodobnejšo tehnologijo in uporabniku prijaznim upravljanjem. Ultrazvočne naprave Hielscher so seveda skladne s CE ter izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

Tukaj preberite, kako se UIP400MTP uporablja za ločevanje biofilmov kot korak priprave vzorcev v okviru protokola ASTM E2799 za preskušanje učinkovitosti razkužil proti biofilmu Pseudomonas aeruginosa s preskusom MBEC.