Preskusni protokol MBEC z uporabo 96-jamičkovega zvočnega UIP400MTP

Test MBEC se uporablja za določanje koncentracije protimikrobnih sredstev, potrebnih za odstranjevanje biofilmov, ki nastanejo na pokrovih klinov. Za oceno sposobnosti preživetja biofilma je treba biofilm najprej ločiti od pokrovov plošče s 96 jamicami. Sonikacija je najbolj zanesljiva in učinkovita metoda za to ločitev. Zvočni UIP400MTP z več vdolbinicami je posebej zasnovan za obdelavo preskusnih plošč z največjo učinkovitostjo in priročnostjo, racionalizacijo in pospeševanje visoko zmogljivih testov MBEC.

Sonication za odvajanje biofilma

Sonication je ključni korak pri testih minimalne koncentracije izkoreninjenja biofilma (MBEC), ki omogoča učinkovito odstranjevanje celic biofilma iz njihove površinske pritrditve. Biofilmi so po naravi strukturirane skupnosti mikroorganizmov, zaprte v zunajcelični matriks, zaradi česar so bistveno bolj odporne na protimikrobna sredstva v primerjavi s planktonskimi celicami. Med testi MBEC ultrazvočna razbijanje uporablja ultrazvočne valove za ustvarjanje nadzorovane kavitacije, ki moti matriks biofilma in sprošča vgrajene celice v suspenzijo. Ta korak zagotavlja, da so celice biofilma enakomerno razpršene v mediju za predelavo, kar omogoča natančne ocene sposobnosti preživetja s prevleko, redčenjem ali spektrofotometričnimi metodami. Brez ustreznega odvajanja biofilma bi lahko preostale komponente matriksa zaščitile celice, kar bi privedlo do podcenjevanja protimikrobne učinkovitosti. Zato je ultrazvočna razbijanja nepogrešljiva za pridobitev zanesljivih in ponovljivih vrednosti MBEC, ki odražajo dejanski potencial izkoreninjenja testiranih sredstev. Sonikator z več vdolbicami UIP400MTP omogoča enostavno visoko zmogljivo pripravo vzorcev v testnih ploščah.

Protokol za preskus minimalne koncentracije izkoreninjenja biofilma (MBEC)

1. korak: Tvorba biofilma

1. Pripravite bakterijsko suspenzijo:
   Gojite bakterije v ustreznem mediju za rast v log-fazi.
   Bakterijsko kulturo razredčimo do določene optične gostote (npr. OD600 ~ 0,1).
2. Inokulirajte ploščo z 96 jamicami:
   Bakterijsko suspenzijo (npr. 150–200 μL) dodamo v vsako jamico standardne mikrotitrijske plošče s 96 jamicami.
3. Pritrdite pokrov klina:
   Pokrovček kljukice položite na inokulirano ploščo, da omogočite nastanek biofilma na površinah klina.
4. Inkubirajte ploščo:
   Postavitev inkubirajte pri ustrezni temperaturi (npr. 37 ° C) 24–48 ur brez stresanja, da spodbudite rast biofilma.

2. korak: Zdravljenje s protimikrobnimi sredstvi

• Pripravite protimikrobne raztopine:
  Pripravite vrsto protimikrobnih koncentracij v svežem mediju.
  Izpostavite biofilme protimikrobnim sredstvom:
  Odstranite pokrov z bakterijske kulture in ga sperite v sterilni fiziološki raztopini ali PBS, da odstranite planktonske celice.
  Pokrovček položite na novo ploščo z 96 jamicami, ki vsebuje protimikrobne raztopine.
• Inkubirajte ploščo:
  Inkubiramo za določeno obdobje (npr. 24 ur), da omogočimo izpostavljenost protimikrobnim zdravilom.

3. korak: Sonication z 96-jamično ploščo Sonicator UIP400MTP

Korak ultrazvočne obdelave je ključnega pomena za ločevanje biofilmov s pokrovov za oceno sposobnosti preživetja. Sledite tem korakom za UIP400MTP sonicator:

1. Pripravite nastavitev:
   V vsako jamico napolnite svežo ploščo z 96 jamicami z medijem za predelavo (npr. nevtralizacijsko juho ali svežim rastnim medijem).
2. Prenesite pokrov klina:
   Odstranite pokrovček s protimikrobne plošče.
   Pokrovček sperite s sterilno fiziološko raztopino ali PBS, da odstranite ostanke protimikrobnih sredstev.
3. Postavite ploščo in zvočnikator:
   Pokrov kljukice pritrdite na ploščo medija za pridobivanje.
   Ploščo za rekuperacijo postavite na platformo UIP400MTP sonikatorja, pri čemer zagotovite, da je plošča centrirana in stabilna.
4. Prilagodite parametre ultrazvočnega razbijanja:
   Nastavite parametre ultrazvočnega razbijanja na UIP400MTP (nastavitve lahko prilagodite biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Čas ultrazvočnega razbijanja: 1–3 minute (prilagodite glede na robustnost biofilma) v cikličnem načinu.
5. Sonikati:
   Začnite postopek ultrazvočnega razbijanja. Ultrazvočne vibracije bodo odstranile biofilme s površin klinov v medij za predelavo.
6. Spremljajte postopek:
   Uporabite vtični temperaturni senzor za spremljanje temperature vzorca v vdolbinicah. UIP400MTP lahko priključite na laboratorijski hladilnik za hlajenje.
7. Ravnanje po ultrazvočnem razbijanju:
   Sredstvo za predelavo (ki zdaj vsebuje ločene biofilme) takoj prenesite v svežo sterilno ploščo za analizo v nadaljnjem toku toka.

(A) plošča, ki vsebuje TSB z 2 % glukoze, ki se uporablja za tvorbo biofilma, obnovo celic in
določanje MIC in MBCB; (B) Pokrov z zatiči za tvorbo stafilokoknih biofilmov. določanje MIC in MBCB; (B) Pokrov z zatiči za tvorbo stafilokoknih biofilmov.
Celice biofilma, ki so nastale na zatičih, so bile odstranjene s ultrazvočnim razbijanjem (Hielscherjeva ultrazvočna tehnologija) za 5 minut na ploščah z 96 jamicami, ki so vsebovale svež medij za kulturo za obnovitev celic.
(Slika in študija: ©de Oliveira et al., 2016)

4. korak: Ocena sposobnosti preživetja

Biofilmi, ločeni od plošč in kultur:

1. Izvedite zaporedne razredčitve rekuperacijskega medija in plošče na agar, da naštejete enote, ki tvorijo kolonije (CFU).
   Druga možnost je, da uporabite kolorimetrični ali fluorescenčni test sposobnosti preživetja.
2. Rekordni rezultati:
   MBEC se določi kot najnižja koncentracija protimikrobnega zdravila, ki je izkoreninila zaznavno sposobnost preživetja biofilma.

Projektiranje, izdelava in svetovanje – Kakovost izdelana v Nemčiji

Hielscher ultrazvočni aparati so znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih aparatov v industrijske objekte. Hielscher sonicatorji zlahka obvladajo težke pogoje in zahtevna okolja.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visoko zmogljivim ultrazvočnim aparatom z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so Hielscher ultrazvočni aparati skladni s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

Tukaj preberite, kako se UIP400MTP uporablja za odvajanje biofilma kot korak priprave vzorca med protokolom ASTM E2799 za testiranje učinkovitosti razkužila proti biofilmu Pseudomonas aeruginosa z uporabo testa MBEC.