ASTM E2799-22 Protokol za ocenjevanje protimikrobnih zdravil

Hielscher UIP400MTP je zmogljiv in učinkovit zvočni zvočnik z več vdolbinicami, zasnovan za racionalizacijo koraka ultrazvočnega razbijanja v protokolu ASTM E2799-22. Z zagotavljanjem enakomerne ultrazvočne energije po celotni mikrotitrski plošči UIP400MTP zagotavlja dosledno in zanesljivo ločevanje biofilmov od pokrovov klinov, ne da bi poškodovali celice ali ogrozili celovitost vzorca. Njegova visoka zmogljivost in uporabniku prijazno delovanje znatno skrajšata čas obdelave, hkrati pa izboljšata ponovljivost, zaradi česar je idealna rešitev za laboratorije, ki izvajajo teste sposobnosti preživetja biofilma in testiranje protimikrobne učinkovitosti.

ASTM E2799

ASTM E2799 je standardizirana preskusna metoda, namenjena ocenjevanju učinkovitosti protimikrobnih sredstev proti biofilmom, s posebnim poudarkom na Pseudomonas aeruginosa. Biofilmi so kompleksne mikrobne skupnosti, ki se držijo površin in kažejo povečano odpornost na protimikrobno zdravljenje, zaradi česar so pomemben izziv v zdravstvenem, industrijskem in okoljskem kontekstu. Ta metoda uporablja test minimalne koncentracije izkoreninjenja biofilma (MBEC), da zagotovi zanesljiv in ponovljiv okvir za testiranje razkužil v realnih pogojih biofilma.

Kako ultrazvočno razbijanje prispeva k ASTM E2799?

Sonication igra ključno vlogo v protokolu ASTM E2799, saj olajša ločevanje biofilmov s preskusnih površin, kar zagotavlja natančno oceno sposobnosti preživetja mikrobov po obdelavi. Z uporabo nadzorovane ultrazvočne energije protokol doseže učinkovito in dosledno motnjo biofilma, ne da bi poškodoval celice, kar omogoča natančne in ponovljive rezultate. Zaradi tega je ASTM E2799 bistveno orodje za napredovanje raziskav biofilma in razvoj učinkovitih protimikrobnih strategij.

Kako zagnati test MBEC v skladu s ASTM E2799-22

Protokol ASTM E2799-22 opisuje korake za ocenjevanje učinkovitosti protimikrobnih sredstev proti biofilmom. Pri uporabi Hielscherjevega UIP400MTP mikrotitarskega ploščnega sonikatorja se lahko protokol prilagodi tako, da vključuje to napredno metodo ultrazvočne obdelave za odvajanje biofilma. Spodaj je opis korakov, prilagojenih uporabi ultrazvočnega UIP400MTP mikroplošče:

1. Priprava biofilmov
   Pripravite sterilno mikrotitrično ploščo s 96 jamicami z odstranljivimi pokrovi.
   Vdolbinice inokuliramo s standardizirano bakterijsko suspenzijo v primernem rastnem mediju.
   Pokrov kljukice namestite na ploščo in se prepričajte, da so kljukice popolnoma potopljene v bakterijsko suspenzijo.
   Ploščo inkubiramo pod nadzorovanimi pogoji (npr. temperaturo in čas), da omogočimo tvorbo biofilma na kljukicah.
2. Zdravljenje s protimikrobnimi sredstvi
   Po nastanku biofilma se gojišče nadomesti s svežim gojiščem, ki vsebuje preskusna protimikrobna sredstva v različnih koncentracijah.
   Ponovno pritrdite pokrov kljukice in inkubirajte pod pogoji, določenimi v načrtu preskusa.
3. Priprava na odcepitev biofilma
   Po zdravljenju sperite pokrov noža tako, da ga potopite v sterilno raztopino za izpiranje, da odstranite ostanke protimikrobnih sredstev in ohlapno prilepljene planktonske celice.
4. Odvajanje biofilma z uporabo UIP400MTP Sonicatorja
   Pripravite svežo mikrotitro ploščo z 96 jamicami, ki vsebuje sredstvo za predelavo (npr. nevtralizacijsko juho).
   Biofilm se odstrani tako, da se pokrov kljukice namesti v vdolbinice plošče medija za pridobivanje.
   Vstavite ploščo v zvočni UIP400MTP in se prepričajte, da sta pokrov in plošča pravilno poravnana.
   Nastavite sonikator na 70% -80% amplitudo in sonikirajte 3-4 minute v cikličnem načinu, da zagotovite dosledno odvajanje biofilma brez lize celic.
5. Ocena sposobnosti preživetja biofilma
   Po ultrazvočni obdelavi kultivatorja, ki vsebuje ločene biofilmske celice, z uporabo standardnih mikrobioloških ali analitskih tehnik, kot so:
   • Število enot, ki tvorijo kolonije (CFU): Izvedite serijske razredčitve in ploščo na agarju za naštevanje živih celic.
   • Meritve optične gostote (OD): Uporabite spektrofotometrično analizo za oceno gostote celic.
   • Fluorescenčni testi sposobnosti preživetja: Kvantificirajte žive in mrtve celice s fluorescentnimi barvili.
6. Analiza podatkov
   Primerjajte podatke o sposobnosti preživetja tretiranih in neobdelanih biofilmov, da določite učinkovitost protimikrobnih sredstev.
   Izračunajte najmanjšo koncentracijo izkoreninjenja biofilma (MBEC) na podlagi koncentracije, potrebne za odstranitev živih celic biofilma.
7. Nadzor kakovosti
   Zagotovite dosledne pogoje ultrazvočnega razbijanja z rednim umerjanjem UIP400MTP in preverjanjem, da proces odvajanja biofilma ne povzroči pomembne lize ali uničenja celic.
   Vključite ustrezne kontrole, kot so neobdelani biofilmi in slepi vzorci, ki vsebujejo samo medije, za potrditev rezultatov.

Celice biofilma, ki so nastale na zatičih, so bile odstranjene z ultrazvočno razbijanjem (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Nemčija, UIP250MTP) za 5 minut na ploščah z 96 jamicami, ki so vsebovale sveže gojišče za obnovitev celic.
(Slika in študija: ©de Oliveira et al., 2016)

Z vključitvijo UIP400MTP v potek dela ASTM E2799-22 je proces odvajanja biofilma optimiziran za doslednost, učinkovitost in visoko zmogljive aplikacije.