Protokol za preskus minimalne inhibitorne koncentracije (MIC)

Preskus minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) na osnovi biofilma je ključna metoda za ocenjevanje učinkovitosti protimikrobnih sredstev proti mikroorganizmom, povezanim z biofilmom, ki zaradi svoje zaščitne ekstracelularne matrice kažejo povečano odpornost. Ključni korak v tem preskusu je odstranitev struktur biofilma, da se sprostijo vgrajene celice in omogoči natančna ocena njihove vitalnosti. Ultrazvočni aparat za večluknjaste plošče UIP400MTP olajša ta proces z uporabo usmerjenega ultrazvoka za ustvarjanje nadzorovane kavitacije, s čimer učinkovito odstrani celice iz biofilma in jih razprši v enotno suspenzijo. Ta natančno izvedeno in ponovljivo razbijanje biofilma poveča zanesljivost in zmogljivost testov MIC, zaradi česar je UIP400MTP nepogrešljivo orodje za napredek raziskav na področju biofilma.

Zakaj naj pri določanju minimalne zaviralne koncentracije (MIC) uporabljam ultrazvok?

• Natančni, ponovljivi podatki: Zagotovite si enotne celične suspenzije, ki odpravljajo zaslonitev matriksa, s čimer boste zagotovili, da število kolonij in odčitki optične gostote resnično odražajo protimikrobno učinkovitost.
• Visoka zmogljivost: V samo 1–3 minutah hkrati obdelajte celotno ploščo s 96 jamicami in tako nadomestite počasno ter nepredvidljivo ročno strganje s poenostavljenim delovnim postopkom.
• Ohranjena vitalnost celic: Nežno odstranite vgrajene celice brez fizične poškodbe, ki jo povzroča strganje, ter tako zagotovite višje stopnje preživetja za zanesljive izračune MIC/MBEC.
• Nobeno tveganje za navzkrižno onesnaženje: Izkoristite prednosti brezdotične zasnove v obliki skodelice z rogom, ki omogoča enakomerno obdelavo vseh vdolbinic, ne da bi se sonde dotikale posameznih vzorcev ali vdolbinic.
• Skladnost s standardi: Svojo metodologijo uskladite z veljavnimi industrijskimi protokoli, kot je ASTM E2799-22, s čimer boste svojim podatkom zagotovili večjo verodostojnost za regulativne namene ali objavo.
• Zaupljivo zdravilo & Preverjanje primernosti za zdravljenje: Zaupajte rezultatom testov občutljivosti, da boste lahko sprejemali pametnejše odločitve glede učinkovitosti protimikrobnih sredstev, profiliranja odpornosti ali razvoja terapij.

Sonication za odvajanje biofilma

Test MIC na osnovi biofilma običajno meri sposobnost preživetja bakterij ali zaviranje rasti z uporabo metod, kot so prenašanje, štetje kolonij ali meritve optične gostote. Sonication je kritičen korak pri testih MIC na osnovi biofilma pri ocenjevanju protimikrobne občutljivosti mikroorganizmov, povezanih z biofilmom. Njegova primarna funkcija je ločevanje in razpršitev celic, vgrajenih v matrico biofilma, v enakomerno suspenzijo za natančno analizo.
Biofilmi so bistveno bolj odporni na protimikrobna sredstva v primerjavi s planktonskimi celicami, zaradi česar je pravilen odmik ključnega pomena za natančno analizo. Med tem postopkom ultrazvočni valovi ustvarjajo nadzorovano kavitacijo, razbijajo matrico biofilma in sproščajo vgrajene celice v enakomerno suspenzijo v mediju za predelavo. Ta korak omogoča natančno oceno sposobnosti preživetja celic, razpršenih v biofilmu, z metodami, kot so prenašanje, redčenje in štetje kolonij. Pravilna motnja biofilma s ultrazvočnim razbijanjem preprečuje, da bi preostale komponente matriksa ščitile celice, kar bi sicer lahko privedlo do podcenjevanja protimikrobne aktivnosti. Za ta namen je še posebej primeren UIP400MTP sonikator z več vdolbinicami, ki ponuja natančne in ponovljive pogoje ultrazvočne obdelave, ki zagotavljajo zanesljivo in visoko zmogljivo pripravo testnih plošč.

Zakaj je ultrazvočna razbijanje potrebna pri testih minimalne inhibitrojske koncentracije na osnovi biofilma

Za meritve sposobnosti preživetja in štetje celic je potrebna popolna in zanesljiva odstranitev in razpršenost posameznih celic. UIP400MTP spodbuja enakomerno, neškodljivo odvajanje biofilma in celično disperzijo za robustne rezultate testa.

• Kompleksnost biofilma: Biofilmi so strukturirane mikrobne skupnosti, zaprte v matriks zunajcelične polimerne snovi (EPS), ki ščiti mikroorganizme in jih naredi bolj odporne na protimikrobna sredstva.
• Enakomerna disperzija: Za natančno merjenje sposobnosti preživetja celic, vgrajenih v biofilm, ali njihove dovzetnosti za protimikrobna zdravila, je treba biofilm najprej odstraniti in razgraditi v homogeno suspenzijo.

Protokol za preskus minimalne inhibitorne koncentracije na osnovi biofilma

Test minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) določa najnižjo koncentracijo protimikrobnega sredstva, ki je potrebna za zaviranje vidne rasti mikroorganizmov. Ta protokol je zasnovan za mikroorganizme, povezane z biofilmom, z uporabo UIP400MTP sonikatorja z več vdolbicami za motnje biofilma.

1. korak: Priprava bakterijskega inokuluma

1. Pripravite bakterijsko suspenzijo:
   Bakterije se gojijo v ustreznih medijih do srednje logaritmične faze.
   Razredčite kulturo, da dosežete standardizirano gostoto celic (npr. 0,5 McFarlandovega standarda ali OD600 ~ 0,1).
2. Pripravite protimikrobne raztopine:
   Protimikrobno sredstvo razredčimo v ustreznem mediju, da ustvarimo razpon koncentracij (npr. dvojne zaporedne razredčine).
3. Razdelite v ploščo z 96 vdolbinicami:
   Protimikrobne raztopine dodamo v vdolbinice standardne plošče s 96 jamicami, s končnim volumnom jamice ~ 150–200 μL.
   Vključite nadzor rasti (brez protimikrobnih zdravil) in nadzor sterilnosti (brez bakterijskega inokuluma).

2. korak: Tvorba biofilma na pokrovu Peg

• Pritrdite pokrov klina:
  Postavite specializirani pokrov na inokulirane jamice in zagotovite, da so kljukice popolnoma potopljene v bakterijsko suspenzijo.
• Inkubirajte ploščo:
  Inkubiramo pri ustrezni temperaturi (npr. 37 °C) za določeno obdobje (npr. 24 ur) v statičnih pogojih, da se omogoči tvorba biofilma na kljukicah.

3. korak: Izpostavljenost protimikrobnim sredstvom

• Sperite kljukice:
  Odstranite pokrovček z bakterijske suspenzije in nežno sperite v sterilni fiziološki raztopini ali PBS, da odstranite ohlapno pritrjene planktonske celice.
• Izpostavite protimikrobnim sredstvom:
  Pokrov kljukice prenesite v novo ploščo z 96 jamicami, ki vsebuje prej pripravljene protimikrobne razredčine.
  Inkubiramo določeno obdobje (npr. 24 ur) v statičnih pogojih, da lahko protimikrobno sredstvo deluje na biofilme.

4. korak: Sonication z mikroploščo Sonicator UIP400MTP

Korak ultrazvočne obdelave je ključnega pomena za ločevanje biofilmov s pokrovov za oceno sposobnosti preživetja. Sledite tem korakom za UIP400MTP sonicator:

1. Pripravite nastavitev:
   V vsako jamico napolnite svežo ploščo z 96 jamicami z medijem za predelavo (npr. nevtralizacijsko juho ali sterilno rastno gojišče).
2. Prenesite pokrov klina:
   Odstranite pokrovček s protimikrobne plošče.
   Pokrovček sperite s sterilno fiziološko raztopino ali PBS, da odstranite ostanke protimikrobnih sredstev.
3. Ploščo namestite v sonikator:
   Pokrov kljukice pritrdite na ploščo medija za pridobivanje.
   Ploščo za rekuperacijo vstavite v UIP400MTP sonicator, pri čemer zagotovite, da je plošča na sredini in stabilna, kot je opisano v priročniku.
4. Prilagodite parametre ultrazvočnega razbijanja:
   Parametre ultrazvočnega razbijanja nastavite na UIP400MTP (nastavitve se lahko prilagodijo biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Čas ultrazvočnega razbijanja: 1–3 minute (prilagodite glede na strukturo biofilma) v načinu cikla.
5. Sonikati:
   Začnite postopek ultrazvočnega razbijanja. Ultrazvočni valovi bodo motili matrico biofilma in celice premaknili v medij za obnovo.
6. Spremljajte postopek:
   Uporabite vtični temperaturni senzor za spremljanje temperature vzorca v vdolbinicah. UIP400MTP lahko priključite na laboratorijski hladilnik za hlajenje.
7. Ravnanje po ultrazvočnem razbijanju:
   Sredstvo za predelavo, ki vsebuje ločene biofilme, se takoj prenese v svežo sterilno ploščo za nadaljnjo analizo.

(A) plošča, ki vsebuje TSB z 2 % glukoze, ki se uporablja za tvorbo biofilma, obnovitev celic in določanje MIC in MBEC; (B) Pokrov z zatiči za tvorbo stafilokoknih biofilmov.
Celice biofilma, ki so nastale na zatičih, so bile odstranjene s ultrazvočnim razbijanjem (Hielscherjeva ultrazvočna tehnologija) za 5 minut na ploščah z 96 jamicami, ki so vsebovale svež medij za kulturo za obnovitev celic.
(Slika in študija: ©de Oliveira et al., 2016)

4. korak: Ocena sposobnosti preživetja

Biofilmi, ločeni od plošč in kultur:

1. Izvedite zaporedne razredčitve rekuperacijskega medija in plošče na agar, da naštejete enote, ki tvorijo kolonije (CFU).
2. Ocenite MIC:
   MIC se določi kot najnižja protimikrobna koncentracija, ki popolnoma zavira vidno rast mikrobov v mediju za predelavo.

Najmanjša zaviralna koncentracija MIC: Primer mikrotitrijske plošče in interpretacija rezultatov mikrorazredčenja.
(Študija in slika: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Kdo ima koristi od ultrazvoka pri določanju minimalne zaviralne koncentracije (MIC)?

• Proizvajalci medicinskih pripomočkov: Preizkusiti učinkovitost površinskih premazov in potrditi protokole čiščenja za naprave, na katerih se pogosto tvori biofilm.
• Klinični mikrobiologi: Za natančno diagnosticiranje okužb, povezanih z vsadki (kot je PJI), z izolacijo bakterij iz medicinskih pripomočkov.
• Razvijalci farmacevtskih izdelkov: Oceniti učinkovitost novih protimikrobnih sredstev proti odpornih patogenih, vgrajenih v biofilm.
• Akademski raziskovalci: Izvajanje visoko zmogljivih, ponovljivih raziskav na področju biologije biofilmov in mehanizmov odpornosti proti protimikrobnim sredstvom.
• Ekipe za nadzor kakovosti v industriji: Za oceno biološkega obarvanja in učinkovitosti razkužil v industrijskem okolju (npr. v skladu s standardi ASTM E2799-22).

Projektiranje, izdelava in svetovanje – Kakovost izdelana v Nemčiji

Hielscher ultrazvočni aparati so znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih aparatov v industrijske objekte. Hielscher sonicatorji zlahka obvladajo težke pogoje in zahtevna okolja.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visoko zmogljivim ultrazvočnim aparatom z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so Hielscher ultrazvočni aparati skladni s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

Tukaj preberite, kako se UIP400MTP uporablja za odvajanje biofilma v protokolu ASTM E2799 – Testiranje učinkovitosti razkužila proti biofilmu Pseudomonas aeruginosa z uporabo testa MBEC.