Protokol preskusa minimalne inhibitorne koncentracije (MIC)

Preskus minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) na osnovi biofilma je ključna metoda za vrednotenje učinkovitosti protimikrobnih učinkovin proti mikroorganizmom, povezanim z biofilmom, ki zaradi zaščitnega zunajceličnega matriksa kažejo povečano odpornost. Ključen korak pri tem preskusu je odstranjevanje struktur biofilma, da se sprostijo vanje vgrajene celice za natančno oceno viabilnosti. Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP olajša ta proces z uporabo usmerjenega ultrazvoka za ustvarjanje nadzorovane kavitacije, s čimer učinkovito odstrani celice biofilma in jih dispergira v enakomerno suspenzijo. Ta natančna in ponovljiva razgradnja biofilma izboljša zanesljivost in zmogljivost obdelave vzorcev pri preskusih MIC, zato je UIP400MTP ključno orodje za napredek raziskav biofilmov.

Zakaj uporabljati sonikacijo pri preskusih MIC?

• Natančni, ponovljivi podatki: Pridobite enakomerne celične suspenzije, ki odpravijo zaščitni učinek matriksa, tako da število kolonij in odčitki optične gostote resnično odražajo protimikrobno učinkovitost.
• Učinkovitost z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev: Celotno ploščo s 96 vdolbinicami obdelajte hkrati v samo 1–3 minutah ter počasno, neenakomerno ročno strganje nadomestite z učinkovitejšim potekom dela.
• Ohranjena viabilnost celic: Nežno odstranite vgrajene celice brez fizičnih poškodb, ki jih povzroča strganje, ter ohranite višje stopnje preživetja za zanesljive izračune MIC/MBEC.
• Ničelno tveganje navzkrižne kontaminacije: Izkoristite brezkontaktno zasnovo z ultrazvočnim pretvornikom v obliki čaše, ki enakomerno obdeluje vse vdolbinice, ne da bi se sonde dotikale posameznih vzorcev ali vdolbinic.
• Skladnost s standardi: Uskladite svojo metodologijo z validiranimi industrijskimi protokoli, kot je ASTM E2799-22, ter povečajte verodostojnost svojih podatkov za regulativne namene ali objavo.
• Zanesljivo presejalno preskušanje zdravil in zdravljenj: Zanesite se na rezultate občutljivosti za boljše odločitve o protimikrobni učinkovitosti, določanju profilov odpornosti ali razvoju zdravljenja.

Sonikacija za odstranjevanje biofilma

Preskus MIC na osnovi biofilma običajno meri viabilnost bakterij ali zaviranje rasti z metodami, kot so nacepljanje na gojišče, štetje kolonij ali meritve optične gostote. Sonikacija je ključni korak pri preskusih MIC na osnovi biofilma, kadar ocenjujemo občutljivost mikroorganizmov, povezanih z biofilmom, za protimikrobne učinkovine. Njena glavna naloga je odstraniti celice, vgrajene v matriks biofilma, in jih dispergirati v enakomerno suspenzijo za natančno analizo.
Biofilmi so bistveno odpornejši proti protimikrobnim učinkovinam kot planktonske celice, zato je pravilno odstranjevanje ključno za natančno analizo. Med tem procesom ultrazvočni valovi ustvarjajo nadzorovano kavitacijo, ki razgradi matriks biofilma in sprosti vgrajene celice v enakomerno suspenzijo v gojišču za obnovo celic. Ta korak omogoča natančno oceno viabilnosti celic, dispergiranih iz biofilma, z metodami, kot so nacepljanje na gojišče, redčenje in štetje kolonij. Pravilna razgradnja biofilma s sonikacijo preprečuje, da bi preostale sestavine matriksa ščitile celice, kar bi sicer lahko privedlo do podcenjevanja protimikrobne aktivnosti. Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP je še posebej primeren za ta namen, saj zagotavlja natančne in ponovljive pogoje sonikacije za zanesljivo pripravo preskusnih plošč z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev.

Zakaj je sonikacija potrebna pri preskusih minimalne inhibitorne koncentracije na osnovi biofilma

Za meritve viabilnosti in štetje celic sta potrebna popolno in zanesljivo odstranjevanje ter dispergiranje posameznih celic. UIP400MTP omogoča enakomerno odstranjevanje biofilma in dispergiranje celic brez poškodb za zanesljive rezultate preskusa.

• Kompleksnost biofilma: Biofilmi so strukturirane mikrobne združbe, obdane z matriksom zunajceličnih polimernih snovi (EPS), ki ščiti mikroorganizme in povečuje njihovo odpornost proti protimikrobnim učinkovinam.
• Enakomerna disperzija: Za natančno merjenje viabilnosti celic, vgrajenih v biofilm, ali njihove občutljivosti za protimikrobne učinkovine je treba biofilm najprej odstraniti in razgraditi v homogeno suspenzijo.

Protokol preskusa minimalne inhibitorne koncentracije na osnovi biofilma

Preskus minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) določa najnižjo koncentracijo protimikrobne učinkovine, potrebno za zaviranje vidne rasti mikroorganizmov. Ta protokol je zasnovan za mikroorganizme, povezane z biofilmom, in za razgradnjo biofilma uporablja sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP.

Korak 1: Priprava bakterijskega inokuluma

1. Pripravite bakterijsko suspenzijo:
   Gojite bakterije v ustreznih gojiščih do sredine logaritemske faze.
   Kulturo razredčite, da dosežete standardizirano gostoto celic (npr. standard 0,5 McFarland ali OD600 ~0,1).
2. Pripravite raztopine protimikrobnih učinkovin:
   Protimikrobno učinkovino razredčite v ustreznem gojišču, da pripravite razpon koncentracij (npr. zaporedne dvakratne razredčitve).
3. Razdelite v ploščo s 96 vdolbinicami:
   Raztopine protimikrobnih učinkovin dodajte v vdolbinice standardne plošče s 96 vdolbinicami, pri čemer naj bo končni volumen v vdolbinici ~150–200 µL.
   Vključite kontrole rasti (brez protimikrobne učinkovine) in kontrole sterilnosti (brez bakterijskega inokuluma).

Korak 2: Nastanek biofilma na pokrovu z zatiči

• Namestite pokrov z zatiči:
  Posebni pokrov z zatiči namestite na inokulirane vdolbinice in zagotovite, da so zatiči v celoti potopljeni v bakterijsko suspenzijo.
• Inkubirajte ploščo:
  Inkubirajte pri ustrezni temperaturi (npr. 37°C) določen čas (npr. 24 ur) v statičnih pogojih, da omogočite nastanek biofilma na zatičih.

Korak 3: Izpostavitev protimikrobnim učinkovinam

• Sperite zatiče:
  Pokrov z zatiči odstranite iz bakterijske suspenzije in ga nežno sperite v sterilni fiziološki raztopini ali PBS, da odstranite ohlapno pritrjene planktonske celice.
• Izpostavite protimikrobnim učinkovinam:
  Pokrov z zatiči prenesite v novo ploščo s 96 vdolbinicami, ki vsebuje predhodno pripravljene razredčitve protimikrobne učinkovine.
  Inkubirajte določen čas (npr. 24 ur) v statičnih pogojih, da omogočite delovanje protimikrobne učinkovine na biofilme.

Korak 4: Sonikacija s sonikatorjem za mikrotitrske plošče UIP400MTP

Korak sonikacije je ključen za odstranjevanje biofilmov s pokrovov z zatiči za oceno viabilnosti. Pri uporabi sonikatorja UIP400MTP sledite tem korakom:

1. Pripravite opremo:
   V vsako vdolbinico nove plošče s 96 vdolbinicami dodajte gojišče za obnovo celic (npr. nevtralizacijsko tekoče gojišče ali sterilno gojišče za rast).
2. Prenesite pokrov z zatiči:
   Pokrov z zatiči odstranite s plošče za obdelavo s protimikrobno učinkovino.
   Pokrov z zatiči sperite v sterilni fiziološki raztopini ali PBS, da odstranite preostale protimikrobne učinkovine.
3. Namestite ploščo v sonikator:
   Pokrov z zatiči namestite na ploščo z gojiščem za obnovo celic.
   Ploščo z gojiščem za obnovo celic postavite v sonikator UIP400MTP in zagotovite, da je nameščena na sredini in stabilno, kot je opisano v priročniku.
4. Prilagodite parametre sonikacije:
   Na UIP400MTP nastavite parametre sonikacije (nastavitve se lahko prilagodijo biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Čas sonikacije: 1–3 minute (prilagodite glede na strukturo biofilma) v cikličnem načinu.
5. Izvedite sonikacijo:
   Zaženite proces sonikacije. Ultrazvočni valovi bodo razgradili matriks biofilma in sprostili celice v gojišče za obnovo celic.
6. Spremljajte proces:
   S priklopljivim temperaturnim senzorjem spremljajte temperaturo vzorcev v vdolbinicah. UIP400MTP je za hlajenje mogoče priključiti na laboratorijski hladilnik.
7. Ravnanje po sonikaciji:
   Gojišče za obnovo celic, ki vsebuje odstranjene biofilme, takoj prenesite v novo sterilno ploščo za nadaljnjo analizo.

(A) Plošča s TSB z 2% glukoze, uporabljena za nastanek biofilma, obnovo celic ter določanje MIC in MBEC; (B) Pokrov z zatiči za nastanek stafilokoknih biofilmov.
Celice biofilma, nastale na zatičih, so odstranili s sonikacijo (Hielscher Ultrasound Technology), ki je trajala 5 min, v ploščah s 96 vdolbinicami s svežim gojiščem za obnovo celic.
(Slika in študija: ©de Oliveira et al., 2016)

Korak 4: Ocena viabilnosti

Nacepite odstranjene biofilme na gojišče in jih gojite:

1. Pripravite zaporedne razredčitve gojišča za obnovo celic in jih nacepite na agar za štetje enot, ki tvorijo kolonije (CFU).
2. Ocenite MIC:
   Določite MIC kot najnižjo koncentracijo protimikrobne učinkovine, ki popolnoma zavre vidno mikrobno rast v gojišču za obnovo celic.

MIC – minimalna inhibitorna koncentracija: Primer mikrotitrske plošče in interpretacije rezultatov mikrodilucije.
(Študija in slika: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Komu koristi sonikacija pri preskusih MIC?

• Proizvajalci medicinskih pripomočkov: Za preskušanje učinkovitosti površinskih prevlek in validacijo protokolov čiščenja pripomočkov, na katerih pogosto nastajajo biofilmi.
• Klinični mikrobiologi: Za natančno diagnosticiranje okužb, povezanih z vsadki (kot je PJI), s pridobivanjem bakterij z medicinskih pripomočkov.
• Razvijalci zdravil: Za vrednotenje učinkovitosti novih protimikrobnih učinkovin proti odpornim patogenom, vgrajenim v biofilm.
• Akademski raziskovalci: Za izvajanje ponovljivih študij biologije biofilmov in mehanizmov protimikrobne odpornosti z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev.
• Ekipe za industrijsko kontrolo kakovosti: Za ocenjevanje biološkega obraščanja in učinkovitosti razkužil v industrijskih okoljih (npr. z uporabo standardov ASTM E2799-22).

Načrtovanje, proizvodnja in svetovanje – kakovost iz Nemčije

Ultrazvočne naprave Hielscher so znane po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključevanje naših ultrazvočnih naprav v industrijske obrate. Sonikatorji Hielscher zlahka obvladujejo težke razmere in zahtevna okolja.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visokozmogljivim ultrazvočnim napravam z najsodobnejšo tehnologijo in uporabniku prijaznim upravljanjem. Seveda so ultrazvočne naprave Hielscher skladne s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

Tukaj preberite, kako se UIP400MTP uporablja za odstranjevanje biofilma v protokolu ASTM E2799 – preskušanje učinkovitosti razkužil proti biofilmu Pseudomonas aeruginosa s preskusom MBEC.