FFPE visokozmogljiva priprava vzorcev: ekstrakcija beljakovin in striženje nukleinskih kislin
Z visoko zmogljivim ultrazvočnim UIP400MTP Hielscher Ultrasonics obravnava izzive fiksacije formalina in priprave tkiva s parafinom (FFPE). Naučite se, kako ultrasonication obdeluje vzorec FFPE v velikem številu za deparafinizacijo FFPE, lizo tkiva, homogenizacijo, ekstrakcijo beljakovin in striženje DNK / RNA! Izkoristite ultrazvočno pripravo tkiva FFPE – Obdelava velikih vzorčnih številk v ploščah z več vdolbinicami! Pridobite visokokakovostne vzorce in pridobite visoko število vzorcev za zanesljive rezultate raziskav! In nenazadnje prihranite čas in denar!
Priprava vzorca FFPE, ki jo olajša visokozmogljiva ultrazvočna razbijanje
Fiksacija formalina in vgradnja parafina (FFPE) je najpogostejša metoda za ohranjanje in arhiviranje trdnih tkiv. Ekstrakcija biomolekul iz vzorcev tkiv FFPE pogosto predstavlja velike izzive zaradi kakovosti shranjenih vzorcev. Ti vzorci, ki so neprecenljiva sredstva v molekularni biologiji in kliničnih raziskavah, zagotavljajo bogat vir bioloških informacij za retrospektivne študije in validacijo diagnostičnih biomarkerjev. Vendar pa proces fiksacije formalina in vgradnje parafina, ob ohranjanju arhitekture in morfologije tkiva, otežuje ekstrakcijo visokokakovostnih nukleinskih kislin in beljakovin. Formalin povzroča navzkrižno povezovanje nukleinskih kislin in beljakovin, kar vodi do molekularne fragmentacije in kemičnih sprememb. Naučite se, kako visokozmogljiv ultrazvočni UIP400MTP premaguje izzive priprave vzorcev FFPE!
Ultrazvočni aparat za učinkovito pripravo vzorcev FFPE
- Enostaven potek dela: poenostavljeni procesi, ki so uporabniku prijazni.
- Deparafinizacija, ekstrakcija beljakovin, striženje DNA / RNA
- Hitra visokozmogljiva obdelava: Učinkovito ravnanje z večjamičnimi ploščami.
- Učinkovita deparafinizacija: Izboljšana raztapljanje beljakovin.
- Netrupena topila: Izogiba se uporabi škodljivih organskih topil, kot je ksilen.
UIP400MTP visoko zmogljiv zvočnik za visoko zmogljivo obdelavo vzorcev FFPE v ploščah z več jamicami
Napredek v tehnikah ekstrakcije beljakovin iz tkiva FFPE
Hielscher Ultrasonics obravnava izzive pri pripravi vzorcev FFPE z visoko zmogljivostjo. Sonication uporablja ultrazvočne valove za ustvarjanje mehanskih vibracij in osredotočene kavitacije, kar učinkovito moti celične strukture in povečuje raztapljanje biomolekul. Ta tehnika je postala priljubljena zaradi svoje sposobnosti povečanja učinkovitosti in donosa ekstrakcije nukleinskih kislin in beljakovin iz tkiv FFPE ter striženja DNA in RNA za pripravo knjižnice. Zelo pomembno je poudariti, da ultrasonication z uporabo sonikatorja z več vdolbinicami UIP400MTP ohranja celovitost teh biomolekul za nadaljnje aplikacije.
Striženje nukleinskih kislin z uporabo ultrazvočne naprave z visoko zmogljivo ultrazvokom
Ultrazvočni UIP400MTP z več jamicami za uporabo v visoko zmogljivih nastavitvah prinaša pripravo vzorcev FFPE na novo raven. Ta metoda ultrazvočne obdelave z več ploščami zagotavlja učinkovito in zanesljivo rešitev za hkratno obdelavo več vzorcev. Omogoča hitro in ponovljivo ekstrakcijo DNA, RNA in beljakovin, ki so ključne za različne analitske tehnike, vključno z zaporedjem naslednje generacije (NGS), kvantitativno PCR in proteomskimi analizami. Optimizacija parametrov ultrazvočne obdelave, kot so amplituda, trajanje in temperatura, dodatno izboljša kakovost in količino ekstrahiranih biomolekul.
UIP400MTP sonikator za plošče z več vdolbicami ponuja pomembne prednosti za fragmentacijo in striženje DNA in RNA iz tkiva FFPE. Ena od izstopajočih značilnosti tega sistema je njegova sposobnost, da doseže ozke velikosti fragmentov DNK in RNA, kar zagotavlja natančno prilagodljivost intenzivnosti ultrazvočnega razbijanja za pridobitev kratkih fragmentov 150-200 baznih parov (bp) ali daljših fragmentov 15-20 kilobaznih parov (kbp). Zaradi te vsestranskosti je UIP400MTP nepogrešljiv za aplikacije za sekvenciranje s kratkim in dolgim branjem, kar zagotavlja visokokakovostne rezultate za sekvenciranje naslednje generacije (NGS) in sekvenciranje celotnega genoma (WGS). Njegov natančen nadzor nad velikostjo fragmentov je ključnega pomena za raziskovalce na vseh področjih genomike, saj omogoča pripravo vzorcev v skladu s specifikacijami.
Kontaktirajte nas za napredne rešitve v tkivu FFPE
Odkrijte sonikator z več jamicami UIP400MTP za učinkovito pridobivanje biomolekul iz vzorcev FFPE, ohranjanje celovitosti ekstrahiranih nukleinskih kislin in beljakovin ter zagotavljanje ponovljivosti rezultatov. Ta tehnologija se brezhibno integrira z drugimi pripravljalnimi in analitičnimi delovnimi tokovi, racionalizira in izboljšuje molekularne preiskave z uporabo arhivov tkiv FFPE.
Fiksativi in njihovi učinki
Fiksacija je ključni korak pri pripravi vzorca, ki ohranja celične strukture, ustavi biokemične reakcije in preprečuje razgradnjo. Uporabljajo se različni fiksativi, odvisno od specifičnih eksperimentalnih zahtev. Dva najpogostejša fiksativa sta formaldehid in paraformaldehid, ki povezujeta beljakovine in nukleinske kisline, ohranjata morfologijo in antigenost celic in tkiv. Drugi fiksativi, kot so etanol, metanol in glutaraldehid, se uporabljajo za posebne aplikacije.
Formaldehid in paraformaldehidni fiksativi tvorijo metilenske mostove med amino skupinami, kar povzroči premreženje beljakovin. Ta proces učinkovito imobilizira celične komponente in ohranja njihovo celovitost med nadaljnjimi koraki analize. Na učinke teh fiksativ lahko vplivajo dejavniki, kot so koncentracija, pH in temperatura, optimizacija teh parametrov pa je ključnega pomena za zagotovitev optimalnega ohranjanja celičnih struktur.
Prednosti ultrazvočne priprave FFPE
Ultrasonication je močna tehnika za motenje fiksiranih celic in tkiv, ki je odlična s konvencionalnimi tehnikami. Ponuja več pomembnih prednosti pred tradicionalnimi metodami lize:
- Hitrost in učinkovitost: Ultrazvočna liza zagotavlja hitro motnjo celic in tkiv, kar znatno skrajša čas obdelave v primerjavi z mehanskimi ali kemičnimi metodami lize. Visokofrekvenčni zvočni valovi, ki jih ustvarja ultrazvočna sonda, ustvarjajo mehanske strižne sile, kar povzroča motnje fiksiranih celičnih struktur. Ta hitra in učinkovita prekinitev omogoča raziskovalcem, da v kratkem času obdelajo velike količine vzorcev.
- Nežen in nastavljiv: Ultrazvočna liza ponuja nežen mehanizem motenj, ki zmanjšuje poškodbe občutljivih biomolekul, kot so beljakovine, nukleinske kisline in encimi. Za razliko od mehanskih metod, ki ustvarjajo prekomerno toploto ali strižne sile, ultrazvočna liza uporablja nadzorovano kavitacijo za motnje celic, hkrati pa ohranja celovitost in funkcionalnost znotrajceličnih komponent.
- Vsestranskost: Ultrazvočna liza se lahko uporablja za različne fiksatorje, kar raziskovalcem omogoča delo s široko paleto fiksiranih vzorcev. Ne glede na to, ali uporabljate formaldehid, paraformaldehid ali alternativne fiksative, ultrazvočna liza dosledno zagotavlja učinkovite motnje in zagotavlja optimalno obnovo celičnih komponent.
- Visok donos in kakovost: Ultrazvočna liza omogoča visoke donose nepoškodovanih celičnih komponent zaradi svoje sposobnosti, da enakomerno moti fiksirane celice in tkiva. To omogoča nadaljnje aplikacije, kot so analiza beljakovin, ekstrakcija nukleinskih kislin in encimski testi, da dobijo zanesljive in ponovljive rezultate.
- Združljivost avtomatizacije: Ultrazvočna liza se lahko enostavno integrira v avtomatizirane sisteme, kar omogoča visoko zmogljivo obdelavo vzorcev. Ta združljivost omogoča raziskovalcem, da racionalizirajo svoj potek dela in povečajo produktivnost, zlasti v obsežnih študijah.
96-jamični sonikator UIP400MTP za ultrazvočno razbijanje mikrotitra in plošč z več jamicami
Ultrazvočna liza je revolucionirala motnje fiksiranih celic in tkiv, kar ponuja številne prednosti pred tradicionalnimi metodami lize. Zaradi svoje hitrosti, učinkovitosti, selektivnosti, vsestranskosti, visokega donosa in združljivosti z avtomatizacijo je nepogrešljivo orodje v molekularni biologiji in biotehnoloških raziskavah. Hielscher Ultrasonics, ki ponuja brezkontaktne sonikatorje in sonde, ponuja najprimernejši ultrazvočni homogenizator za vašo uporabo v znanosti o življenju. Ne glede na to, ali želite hkrati obdelati posamezne vzorce, več vzorcev ali zelo visoko število vzorcev, vam bomo ponudili najboljši zvočnik, ki ustreza vašim raziskovalnim in diagnostičnim zahtevam.
Preberite več o Hielscher brezkontaktnih sonikatorjih za pripravo vzorcev z več vzorci in visoko zmogljivostjo!
- enkratna naložba
- Uporabite svoj potrošni material
- brez ponavljajočih se stroškov za lastniško dodatno opremo in potrošni material
- Visoka zmogljivost
- Natančno krmiljenje
- Najsodobnejša tehnologija
- Zanesljivost & Robustnosti
- nastavljiv, natančen nadzor procesa
- Industrijski razred: Lahko deluje neprekinjeno 24 ur na dan, 7 dni v tednu
- enostaven in varen za uporabo
- nizko vzdrževanje
Preberite več o uporabi sonikatorjev v znanosti o življenju!
Plošča sonikatorja UIP400MTP za vse plošče z 96 jamicami, mikrotitrijske plošče in plošče z več vdolbicami.
Projektiranje, izdelava in svetovanje – Kakovost izdelana v Nemčiji
Hielscher ultrazvočni aparati so znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih aparatov v industrijske objekte. Težke pogoje in zahtevna okolja zlahka obvladajo Hielscher ultrasonicatorji.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visoko zmogljivim ultrazvočnim aparatom z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so Hielscher ultrazvočni aparati skladni s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Kontaktirajte nas! / Vprašajte nas!
UIP400MTP ultrazvočni aparat: Visoko zmogljiva priprava vzorcev FFPE v plošči z več vdolbinicami
FAQ
V nadaljevanju odgovarjamo na pogosto zastavljena vprašanja, ki so pomembna za pripravo tkiva FFPE in ultrazvočno razširitev vzorcev FFPE.
Kako se pripravlja FFPE tkivo?
Koraki za pripravo tkiva FFPE: Natančno ravnanje in obdelava svežega tkiva sta ključnega pomena za ustvarjanje visokokakovostnih vzorcev FFPE. Zagotavljanje ohranjanja celične arhitekture, nukleinskih kislin in beljakovin je bistvenega pomena za natančno analizo v nadaljnjem toku. Vsak korak - od zbiranja do vdelave - zahteva natančnost, da se ohrani celovitost vzorca za različne analize, vključno s histološkim pregledom, imunohistokemijo in molekularnimi študijami. Pravilno izveden postopek fiksacije in vgradnje zagotavlja, da ohranjeno tkivo natančno odraža stanje in vivo, kar omogoča zanesljive diagnostične in raziskovalne rezultate.
Vodimo vas skozi 6 glavnih korakov postopka vgradnje vzorcev tkiva FFPE.
- Zbiranje tkiv
Biopsije živih sesalcev in tkivne kulture so izvedljivi viri za pridobivanje svežega tkiva za pripravo vzorcev FFPE.
Pomembno je, da uporabite aseptično tehniko: Uporabite sterilne instrumente in rokavice, da se izognete kontaminaciji. V idealnem primeru zbirajte tkiva v sterilnem okolju, kot je kirurški apartma ali laminarni pokrov.
Ker je vzorec zelo krhek, je njegovo občutljivo ravnanje bistvenega pomena: zmanjšajte zamude pri obdelavi in takoj začnite z obdelavo tkiva po eksciziji. To je ključnega pomena za preprečevanje avtolize in razgradnje. Tkivo hranite pri sobni temperaturi; Izogibajte se zmrzovanju, saj lahko povzroči nastanek ledenih kristalov in poškodbe tkiva. - Fiksacija tkiva
Najprej tkivo obdelamo s fiksativno raztopino: Uporabite 10% nevtralno puferiran formalin (NBF), ki ustreza 4% formaldehidu v vodi, pufriranem na nevtralni pH.
Tkivo popolnoma potopite v formalin. Zagotovite razmerje med fiksatorjem in volumnom tkiva najmanj 10:1. Čas fiksacije se običajno giblje od 6 do 24 ur, odvisno od vrste in velikosti tkiva. Pomembno je, da lahko fiksativ temeljito prodre v tkivo. Vendar pa lahko prekomerna fiksacija povzroči navzkrižno povezovanje, ki otežuje pridobivanje antigena, medtem ko lahko premajhna fiksacija povzroči slabo ohranjanje tkiva. - Obrezovanje tkiv
Drugič, tkivo obrežite na debelino približno 3-5 mm, da omogočite ustrezno penetracijo fiksativa. Zagotovite pravilno usmeritev tkiva, da zajamete ustrezne histološke strukture. To olajša postopek ekstrakcije, ko se tkivo kasneje uporabi za analizo. - Obdelava fiksiranega vzorca
Zdaj je treba fiksno tkivo dehidrirati: Po fiksaciji je treba tkivo dehidrirati, da se zagotovi temeljita penetracija parafinskega voska. Tkivo prenesite skozi razvrščeno serijo etanola (70%, 80%, 90% in 100%), da odstranite vodo.
Čiščenje s ksilenom: Parafinski vosek je netopen v vodi, vendar topen v ksilenu. Zato je treba vodo v tkivu nadomestiti s ksilenom. Vendar pa je ksilen sam po sebi netopen v vodi, vendar topen v alkoholu, kar zahteva vmesni korak, kjer se voda najprej nadomesti z alkoholom. Tkivo potopite v ksilen ali ksilenski nadomestek, da odstranite etanol in pripravite tkivo za parafinsko infiltracijo.
Infiltracija s parafinom: Vdelajte tkivo v staljeni parafinski vosek, s čimer zagotovite popolno infiltracijo. Ta korak običajno vključuje več sprememb parafina, da se zagotovi temeljita impregnacija. - Vgradnja tkiva
V tem koraku se tkivo oblikuje v tkivni blok: Tkivo položite v kalup z želeno usmerjenostjo in ga prelijte staljeni parafin. Parafin pustimo, da se strdi tako, da se ohladi pri sobni temperaturi ali na hladni plošči. - Rezanje in montaža
Mikrotomija: Za rezanje vgrajenega tkiva uporabite mikrotom za rezanje tankih odsekov (običajno 4-5 mikrometrov) iz parafinskega bloka. Nato se vzorec namesti in se odseki postavijo na steklena stekelca za naknadno barvanje in mikroskopsko analizo.
Na koncu preverite kakovost histologije: Ocenite prve odseke pod mikroskopom, da zagotovite pravilno fiksacijo in obdelavo. Po potrebi prilagodite protokole glede na vrsto tkiva in opazovano kakovost.
FFPE tkiva se lahko uporabljajo za obnovitev RNA, DNK in beljakovin ter odkrivanje znakov raka ali druge bolezni. Lahko se shranjujejo več let in so bistveni del tega, kako raziskovalci in zdravniki izkoriščajo vzorce tkiva za diagnozo in raziskave.
Katere so pogoste težave in izzivi s tkivom FFPE?
Vzorci tkiva, ki so fiksirani na formalin, vgrajeni v parafin (FFPE) se pogosto uporabljajo v raziskavah in diagnostiki, vendar predstavljajo več izzivov in pogostih težav:
- Razgradnja biomolekul: Dolgotrajna fiksacija lahko privede do razgradnje DNK, RNA in beljakovin, zaradi česar je težko ekstrahirati visokokakovostne nukleinske kisline ali beljakovine za nadaljnjo uporabo. Pravilna fiksacija (izogibanje premajhni in prekomerni fiksaciji) je bistvenega pomena za ohranjanje tkiva.
- Maskiranje antigenov: Postopek fiksacije lahko prikrije antigenska mesta, kar zmanjša učinkovitost vezave protiteles v imunohistokemiji in drugih imunoloških testih. To pogosto zahteva pridobivanje antigena, postopke, s katerimi se maskiranje epitopa obrne in obnovi vezava epitop-protitelesa. Vendar pa se popolna antigenost ne sme vedno obnoviti.
- Spremenljiva kakovost pritrditve: Razlike v času in pogojih fiksacije lahko povzročijo nedosledno kakovost vzorca, kar vpliva na obnovljivost in primerljivost rezultatov. Uporabite zanesljive protokole fiksacije in se izogibajte premajhni in prekomerni fiksaciji.
- Poškodbe in fragmentacija DNK: Formalinska fiksacija vzorcev FFPE lahko povzroči različne vrste poškodb DNA, vključno z deaminacijo citozina (mutacije C do T), oksidativno poškodbo (npr. 8-okso-gvanin, ki vodi do mutacij G do T), pa tudi fizične motnje, kot so zareze, vrzeli in abazična mesta, ki ovirajo aktivnost DNA polimeraze. Postopek fiksacije formalina lahko povzroči fragmentacijo DNK, kar otežuje genetske in genomske analize, kot sta PCR in zaporedje.
- Kakovost RNA: RNA, pridobljena iz tkiv FFPE, je pogosto razdrobljena in kemično spremenjena, zaradi česar je težko izvajati visokokakovostne transkriptomske analize.
- Spremembe beljakovin: Formalin lahko povzroči kemične spremembe v beljakovinah, kar vpliva na njihovo strukturo in funkcijo, kar lahko vpliva na proteomske analize.
- Artefakti za obdelavo vzorcev: Med postopkom vgradnje in rezanja lahko mehanske obremenitve in toplota povzročijo artefakte in povzročijo nadaljnje poškodbe tkiva.
- Variabilnost med serijami: Razlike v protokolih fiksacije in vdelave med različnimi serijami lahko privedejo do znatne variabilnosti rezultatov, kar otežuje primerjave med študijami.
- Težave s shranjevanjem: Dolgoročno shranjevanje blokov FFPE lahko sčasoma povzroči dodatno razgradnjo in izgubo celovitosti nukleinske kisline, kar vpliva na sposobnost preživetja arhivskih vzorcev za retrospektivne študije.
Navzkrižno povezovanje: Fiksacija formalina povzroča navzkrižno povezovanje beljakovin in nukleinskih kislin, kar lahko ovira molekularno analizo in vpliva na natančnost imunohistokemije in drugih testov.
Uporaba optimiziranih protokolov, skrbno ravnanje z vzorci in uporaba naprednih tehnik pomagajo izboljšati kakovost in zanesljivost podatkov, pridobljenih iz tkiv FFPE.
Kakšna je razlika med FFPE in zamrznjenim tkivom?
FFPE (Formalin-Fix, Paraffin-Embedded) tkivo se konzervira s formalinom za fiksiranje tkiva in nato vstavi v parafinski vosek, kar omogoča dolgoročno shranjevanje pri sobni temperaturi, hkrati pa ohranja morfologijo tkiva. Nasprotno pa se zamrznjeno tkivo hitro ohrani z zamrzovanjem, ki bolje ohranja celovitost nukleinskih kislin in beljakovin, vendar zahteva shranjevanje pri zelo nizkih temperaturah.
Katere kemikalije se uporabljajo za vgradnjo FFPE?
Kemikalije, ki se uporabljajo za vdelavo FFPE, običajno vključujejo formalin za fiksacijo in parafinski vosek za vdelavo. Za vdelavo FFPE se tkiva običajno fiksirajo z uporabo 10% (v/v) nevtralnega puferskega formalina (FA) ali sveže pripravljene 4% (m/v) raztopine formaldehida (PFA) iz paraformaldehidnega prahu. Formalin, ki je raztopina formaldehida v vodi, se pufrira na nevtralni pH, da se ohrani morfologija tkiva in prepreči prekomerno navzkrižno povezovanje. Raztopina na osnovi paraformaldehida zagotavlja tudi učinkovito fiksacijo z navzkrižnim povezovanjem beljakovin in s tem stabilizira strukturo tkiva za kasnejšo vgradnjo v parafinski vosek. Te kemikalije so bistvenega pomena za ohranjanje celovitosti in morfologije tkiva med postopkom fiksacije in vdelave.
Kako se parafin odstrani iz vzorcev FFPE?
Za odstranitev parafina iz vzorcev FFPE so deli tkiva običajno izpostavljeni vrsti izpiranja ksilena, ki mu sledi rehidracija skozi stopenjsko serijo alkoholov in končno vodo. Ker je ksilen zelo strupen, kar predstavlja tveganje za zdravje, kot so težave z dihanjem, draženje kože in morebitni dolgoročni učinki pri ponavljajoči se izpostavljenosti, se ultrazvočno odstranjevanje parafina pojavlja kot obetavna alternativa v mnogih laboratorijih. Ta metoda uporablja intenzivne ultrazvočne valove za učinkovito in varno odstranjevanje parafina brez potrebe po strupenih topilih, kot je ksilen, s čimer se zmanjša tveganje za laboratorijsko osebje in ustvari varnejše delovno okolje.
Kako dolgo naj fiksiram robčke za dobro kakovost vzorca FFPE?
Splošna priporočila za trajanje fiksacije običajno predlagajo fiksiranje vzorcev tkiva v formalinu 24 do 48 ur. To trajanje je na splošno dovolj za ohranitev morfologije tkiva in celičnih struktur, hkrati pa zmanjša prekomerno fiksacijo, kar lahko privede do prekomernega navzkrižnega povezovanja in razgradnje nukleinskih kislin in beljakovin. Vendar pa se lahko optimalni čas fiksacije razlikuje glede na velikost in vrsto tkiva, pri čemer manjši ali bolj občutljivi vzorci zahtevajo krajši čas fiksacije. Ključnega pomena je uravnotežiti ustrezno fiksacijo, da se prepreči avtoliza in razgradnja tkiva, hkrati pa se izogne dolgotrajni fiksaciji, ki bi lahko otežila molekularne analize v nadaljnjem toku.