Priprava vzorcev FFPE z visoko zmogljivostjo obdelave: ekstrakcija beljakovin in strižno drobljenje nukleinskih kislin
Z ultrazvočnim procesorjem UIP400MTP z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev Hielscher Ultrasonics rešuje izzive priprave tkiv, fiksiranih s formalinom in vklopljenih v parafin (FFPE). Spoznajte, kako ultrazvočna obdelava omogoča obdelavo velikega števila vzorcev FFPE za deparafinizacijo, lizo tkiva, homogenizacijo, ekstrakcijo beljakovin in strižno drobljenje DNA/RNA! Izkoristite prednosti ultrazvočne priprave tkiv FFPE – obdelave velikega števila vzorcev v ploščah z več vdolbinicami! Pridobite visokokakovostne vzorce in veliko število vzorcev za zanesljive rezultate raziskav! In nenazadnje prihranite čas in denar!
Lažja priprava vzorcev FFPE s sonikacijo z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev
Fiksacija s formalinom in vklapljanje v parafin (FFPE) sta najpogostejši način konzerviranja in arhiviranja trdnih tkiv. Ekstrakcija biomolekul iz vzorcev tkiv FFPE zaradi kakovosti shranjenih vzorcev pogosto predstavlja velike izzive. Ti vzorci, ki so neprecenljivi za molekularno biologijo in klinične raziskave, zagotavljajo bogat vir bioloških informacij za retrospektivne študije in validacijo diagnostičnih bioloških označevalcev. Vendar postopek fiksacije s formalinom in vklapljanja v parafin, čeprav ohranja arhitekturo in morfologijo tkiva, otežuje ekstrakcijo visokokakovostnih nukleinskih kislin in beljakovin. Formalin povzroča navzkrižno povezovanje nukleinskih kislin in beljakovin, kar vodi do molekularne fragmentacije in kemijskih modifikacij. Spoznajte, kako ultrazvočni procesor UIP400MTP z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev premaguje izzive priprave vzorcev FFPE!
Ultrazvočni procesor za učinkovito pripravo vzorcev FFPE
- Preprost potek dela: poenostavljeni postopki, prijazni do uporabnika.
- Deparafinizacija, ekstrakcija beljakovin, strižno drobljenje DNA / RNA
- Hitra obdelava z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev: učinkovito delo s ploščami z več vdolbinicami.
- Učinkovita deparafinizacija: izboljšana solubilizacija beljakovin.
- Nestrupena topila: izogibanje uporabi škodljivih organskih topil, kot je ksilen.
Sonikator UIP400MTP z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev za obdelavo vzorcev FFPE z visoko zmogljivostjo v ploščah z več vdolbinicami
Napredek pri tehnikah ekstrakcije beljakovin iz tkiv FFPE
Hielscher Ultrasonics rešuje izzive priprave vzorcev FFPE z visoko zmogljivostjo obdelave. Sonikacija uporablja ultrazvočne valove za ustvarjanje mehanskih vibracij in usmerjene kavitacije, s čimer učinkovito razgrajuje celične strukture in izboljšuje solubilizacijo biomolekul. Ta tehnika je postala priljubljena zaradi svoje sposobnosti povečanja učinkovitosti in izkoristka ekstrakcije nukleinskih kislin in beljakovin iz tkiv FFPE ter strižnega drobljenja DNA in RNA za pripravo knjižnic. Zelo pomembno je poudariti, da ultrazvočna obdelava s sonikatorjem UIP400MTP za plošče z več vdolbinicami ohranja celovitost teh biomolekul za nadaljnje aplikacije.
Strižno drobljenje nukleinskih kislin z ultrazvočno obdelavo z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev
Ultrazvočni procesor UIP400MTP za plošče z več vdolbinicami, namenjen uporabi pri obdelavi velikega števila vzorcev, dviguje pripravo vzorcev FFPE na novo raven. Ta metoda sonikacije plošč z več vdolbinicami zagotavlja učinkovito in zanesljivo rešitev za sočasno obdelavo več vzorcev. Omogoča hitro in ponovljivo ekstrakcijo DNA, RNA in beljakovin, ki so ključne za različne analitske tehnike, vključno s sekvenciranjem naslednje generacije (NGS), kvantitativnim PCR in proteomskimi analizami. Optimizacija parametrov sonikacije, kot so amplituda, trajanje in temperatura, dodatno izboljšuje kakovost in količino ekstrahiranih biomolekul.
Sonikator UIP400MTP za plošče z več vdolbinicami ponuja pomembne prednosti pri fragmentaciji in strižnem drobljenju DNA in RNA iz tkiv FFPE. Ena od izstopajočih lastnosti tega sistema je njegova sposobnost doseganja ozkega razpona velikosti fragmentov DNA in RNA, pri čemer omogoča natančno prilagajanje intenzivnosti sonikacije za pridobivanje kratkih fragmentov s 150–200 baznimi pari (bp) ali daljših fragmentov s 15–20 kilobaznimi pari (kbp). Zaradi te vsestranskosti je UIP400MTP nepogrešljiv tako pri sekvenciranju s kratkimi odčitki kot pri sekvenciranju z dolgimi odčitki, saj zagotavlja visokokakovostne rezultate pri sekvenciranju naslednje generacije (NGS) in sekvenciranju celotnega genoma (WGS). Natančen nadzor nad velikostjo fragmentov je ključen za raziskovalce na vseh področjih genomike, saj omogoča pripravo vzorcev v skladu s specifikacijami.
Stopite v stik z nami za napredne rešitve za tkiva FFPE
Odkrijte sonikator UIP400MTP za plošče z več vdolbinicami, ki omogoča učinkovito pridobivanje biomolekul iz vzorcev FFPE, ohranja celovitost ekstrahiranih nukleinskih kislin in beljakovin ter zagotavlja ponovljivost rezultatov. Ta tehnologija se brez težav vključuje v druge pripravljalne in analitske postopke ter poenostavlja in izboljšuje molekularne raziskave z uporabo arhivov tkiv FFPE.
Fiksativi in njihovi učinki
Fiksacija je ključen korak pri pripravi vzorcev, ki ohranja celične strukture, ustavlja biokemijske reakcije in preprečuje razgradnjo. Glede na posebne zahteve poskusa se uporabljajo različni fiksativi. Najpogostejša fiksativa sta formaldehid in paraformaldehid, ki navzkrižno povezujeta beljakovine in nukleinske kisline ter ohranjata morfologijo in antigenost celic in tkiv. Drugi fiksativi, kot so etanol, metanol in glutaraldehid, se uporabljajo za posebne aplikacije.
Formaldehidni in paraformaldehidni fiksativi tvorijo metilenske mostičke med amino skupinami, kar povzroči navzkrižno povezovanje beljakovin. Ta postopek učinkovito imobilizira celične sestavine in ohranja njihovo celovitost med nadaljnjimi koraki analize. Na učinke teh fiksativov lahko vplivajo dejavniki, kot so koncentracija, pH in temperatura, optimizacija teh parametrov pa je ključna za zagotovitev optimalnega ohranjanja celičnih struktur.
Prednosti ultrazvočne priprave vzorcev FFPE
Ultrazvočna obdelava je zmogljiva tehnika za razgradnjo fiksiranih celic in tkiv, ki prekaša običajne tehnike. V primerjavi s tradicionalnimi metodami lize ponuja več pomembnih prednosti:
- Hitrost in učinkovitost: Ultrazvočna liza omogoča hitro razgradnjo celic in tkiv ter znatno skrajša čas obdelave v primerjavi z mehanskimi ali kemijskimi metodami lize. Visokofrekvenčni zvočni valovi, ki jih ustvarja ultrazvočna sonda, povzročajo mehanske strižne sile, ki razgrajujejo fiksirane celične strukture. Ta hitra in učinkovita razgradnja raziskovalcem omogoča obdelavo velikih prostornin vzorcev v kratkem času.
- Nežnost in prilagodljivost: Ultrazvočna liza ponuja nežen mehanizem razgradnje, ki zmanjšuje poškodbe občutljivih biomolekul, kot so beljakovine, nukleinske kisline in encimi. Za razliko od mehanskih metod, ki ustvarjajo čezmerno toploto ali strižne sile, ultrazvočna liza uporablja nadzorovano kavitacijo za razgradnjo celic, pri tem pa ohranja celovitost in funkcionalnost znotrajceličnih sestavin.
- Vsestranskost: Ultrazvočna liza se lahko uporablja pri vzorcih, obdelanih z različnimi fiksativi, kar raziskovalcem omogoča delo s širokim naborom fiksiranih vzorcev. Ne glede na to, ali se uporablja formaldehid, paraformaldehid ali alternativni fiksativi, ultrazvočna liza dosledno zagotavlja učinkovito razgradnjo in s tem optimalno pridobivanje celičnih sestavin.
- Visok izkoristek in kakovost: Ultrazvočna liza zaradi svoje sposobnosti enakomerne razgradnje fiksiranih celic in tkiv omogoča visok izkoristek nepoškodovanih celičnih sestavin. To omogoča, da nadaljnje aplikacije, kot so analiza beljakovin, ekstrakcija nukleinskih kislin in encimski testi, dajejo zanesljive in ponovljive rezultate.
- Združljivost z avtomatizacijo: Ultrazvočno lizo je mogoče preprosto vključiti v avtomatizirane sisteme, kar omogoča visoko zmogljivost obdelave vzorcev. Ta združljivost raziskovalcem omogoča poenostavitev poteka dela in povečanje produktivnosti, zlasti pri obsežnih študijah.
Sonikator UIP400MTP za plošče s 96 vdolbinicami za sonikacijo mikrotitrskih plošč in plošč z več vdolbinicami
Ultrazvočna liza je korenito spremenila razgradnjo fiksiranih celic in tkiv ter ponuja številne prednosti pred tradicionalnimi metodami lize. Zaradi hitrosti, učinkovitosti, selektivnosti, vsestranskosti, visokega izkoristka in združljivosti z avtomatizacijo je nepogrešljivo orodje v molekularnobioloških in biotehnoloških raziskavah. Hielscher Ultrasonics z brezkontaktnimi sonikatorji in sonikatorji s sondo ponuja najprimernejši ultrazvočni homogenizator za vašo aplikacijo na področju ved o življenju. Ne glede na to, ali želite obdelovati posamezne vzorce, več vzorcev ali zelo veliko število vzorcev hkrati, vam bomo ponudili najboljši sonikator, ki ustreza vašim raziskovalnim in diagnostičnim zahtevam.
Preberite več o brezkontaktnih sonikatorjih Hielscher za pripravo več vzorcev in pripravo z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev!
- enkratna naložba
- uporaba lastnega potrošnega materiala
- brez ponavljajočih se stroškov za lastniško dodatno opremo in potrošni material
- visoka zmogljivost obdelave vzorcev
- natančen nadzor
- najsodobnejša tehnologija
- zanesljivost in robustnost
- prilagodljiv, natančen nadzor procesa
- industrijska kakovost: omogoča neprekinjeno delovanje 24/7
- preprosto in varno upravljanje
- majhne potrebe po vzdrževanju
Sonikator UIP400MTP za vse plošče s 96 vdolbinicami, mikrotitrske plošče in plošče z več vdolbinicami.
Načrtovanje, proizvodnja in svetovanje – kakovost, izdelana v Nemčiji
Ultrazvočni procesorji Hielscher so dobro znani po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključevanje naših ultrazvočnih procesorjev v industrijske obrate. Ultrazvočni procesorji Hielscher zlahka obvladujejo težke pogoje in zahtevna okolja.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in posebno pozornost namenja visokozmogljivim ultrazvočnim procesorjem z najsodobnejšo tehnologijo in uporabniku prijaznim upravljanjem. Ultrazvočni procesorji Hielscher so seveda skladni z zahtevami CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Stopite v stik z nami! / Vprašajte nas!
Ultrazvočni procesor UIP400MTP: Priprava vzorcev FFPE z visoko zmogljivostjo obdelave v plošči z več vdolbinicami
Pogosta vprašanja
V nadaljevanju odgovarjamo na pogosta vprašanja o pripravi tkiv FFPE in ultrazvočni obdelavi vzorcev FFPE.
Kako se pripravi tkivo FFPE?
Koraki priprave tkiv FFPE: skrbno ravnanje s svežim tkivom in njegova obdelava sta ključna za pridobivanje visokokakovostnih vzorcev FFPE. Ohranjanje celične arhitekture, nukleinskih kislin in beljakovin je bistveno za natančne nadaljnje analize. Vsak korak – od odvzema do vklapljanja – zahteva natančnost, da se ohrani celovitost vzorca za različne analize, vključno s histološkim pregledom, imunohistokemijo in molekularnimi študijami. Pravilno izveden postopek fiksacije in vklapljanja zagotavlja, da ohranjeno tkivo natančno odraža stanje in vivo, kar omogoča zanesljive diagnostične in raziskovalne rezultate.
Predstavili vam bomo 6 glavnih korakov postopka vklapljanja vzorcev tkiv FFPE.
- Odvzem tkiva
Biopsije živih sesalcev in tkivne kulture so ustrezni viri svežega tkiva za pripravo vzorcev FFPE.
Pomembna je uporaba aseptične tehnike: uporabljajte sterilne instrumente in rokavice, da preprečite kontaminacijo. Najbolje je tkiva odvzeti v sterilnem okolju, na primer v operacijski dvorani ali komori z laminarnim pretokom zraka.
Ker je vzorec zelo krhek, je nežno ravnanje z njim bistveno: čim bolj skrajšajte zamude pri obdelavi in takoj po izrezu začnite nadaljnjo obdelavo tkiva. To je ključno za preprečevanje avtolize in razgradnje. Tkivo hranite pri sobni temperaturi; izogibajte se zamrzovanju, saj lahko povzroči nastanek ledenih kristalov in poškodbe tkiva. - Fiksacija tkiva
Najprej tkivo obdelajte z raztopino fiksativa: uporabite 10% nevtralno pufrirani formalin (NBF), ki ustreza 4% formaldehidu v vodi, pufriranem na nevtralen pH.
Tkivo popolnoma potopite v formalin. Zagotovite prostorninsko razmerje med fiksativom in tkivom vsaj 10:1. Čas fiksacije običajno znaša od 6 do 24 ur, odvisno od vrste in velikosti tkiva. Pomembno je, da lahko fiksativ temeljito prodre v tkivo. Vendar lahko čezmerna fiksacija povzroči navzkrižno povezovanje, ki otežuje razkrivanje antigenov, nezadostna fiksacija pa lahko povzroči slabo ohranjenost tkiva. - Obrezovanje tkiva
Kot drugo tkivo obrežite na debelino približno 3–5 mm, da omogočite ustrezno prodiranje fiksativa. Zagotovite pravilno orientacijo tkiva, da zajamete ustrezne histološke strukture. To olajša postopek ekstrakcije, ko se tkivo pozneje uporabi za analizo. - Obdelava fiksiranega vzorca
Zdaj je treba fiksirano tkivo dehidrirati: po fiksaciji je treba tkivo dehidrirati, da se zagotovi temeljito prodiranje parafinskega voska. Tkivo prenesite skozi zaporedje naraščajočih koncentracij etanola (70%, 80%, 90% in 100%), da odstranite vodo.
Bistrenje s ksilenom: parafinski vosek ni topen v vodi, je pa topen v ksilenu. Zato je treba vodo v tkivu nadomestiti s ksilenom. Vendar ksilen sam ni topen v vodi, temveč v alkoholu, zato je potreben vmesni korak, pri katerem se voda najprej nadomesti z alkoholom. Tkivo potopite v ksilen ali nadomestek ksilena, da odstranite etanol in pripravite tkivo za infiltracijo s parafinom.
Infiltracija s parafinom: tkivo vklopite v staljen parafinski vosek in zagotovite popolno infiltracijo. Ta korak običajno vključuje več menjav parafina, da se zagotovi temeljita impregnacija. - Vklapljanje tkiva
V tem koraku se tkivo oblikuje v tkivni blok: tkivo položite v kalup v želeni orientaciji in ga prelijte s staljenim parafinom. Pustite, da se parafin strdi z ohlajanjem pri sobni temperaturi ali na hladni plošči. - Rezanje in nameščanje rezin
Mikrotomija: za rezanje vklopljenega tkiva uporabite mikrotom, s katerim iz parafinskega bloka odrežete tanke rezine (običajno 4–5 mikrometrov). Nato vzorec namestite tako, da rezine položite na objektna stekelca za nadaljnje barvanje in mikroskopsko analizo.
Na koncu preverite kakovost histološkega preparata: prve rezine preglejte pod mikroskopom, da zagotovite ustrezno fiksacijo in obdelavo. Protokole po potrebi prilagodite glede na vrsto tkiva in opaženo kakovost.
Tkiva FFPE se lahko uporabljajo za pridobivanje RNA, DNA in beljakovin ter za odkrivanje znakov raka ali drugih bolezni. Shranjevati jih je mogoče več let in so bistven del uporabe tkivnih vzorcev pri raziskovalcih in zdravnikih za diagnostiko in raziskave.
Katere so pogoste težave in izzivi pri tkivih FFPE?
Vzorci tkiv, fiksiranih s formalinom in vklopljenih v parafin (FFPE), se pogosto uporabljajo v raziskavah in diagnostiki, vendar prinašajo več izzivov in pogostih težav:
- Razgradnja biomolekul: Dolgotrajna fiksacija lahko povzroči razgradnjo DNA, RNA in beljakovin, kar otežuje ekstrakcijo visokokakovostnih nukleinskih kislin ali beljakovin za nadaljnje aplikacije. Pravilna fiksacija (izogibanje nezadostni in čezmerni fiksaciji) je bistvena za ohranjanje tkiva.
- Zakritje antigenov: Postopek fiksacije lahko zakrije antigenska mesta, kar zmanjša učinkovitost vezave protiteles pri imunohistokemiji in drugih imunoloških testih. Zato je pogosto potrebno razkrivanje antigenov, postopek, s katerim se odpravi zakritje epitopa in ponovno vzpostavi vezava med epitopom in protitelesom. Vendar popolne antigenosti morda ni vedno mogoče obnoviti.
- Spremenljiva kakovost fiksacije: Razlike v časih in pogojih fiksacije lahko povzročijo neenotno kakovost vzorcev, kar vpliva na ponovljivost in primerljivost rezultatov. Uporabljajte zanesljive protokole fiksacije ter se izogibajte nezadostni in čezmerni fiksaciji.
- Poškodbe in fragmentacija DNA: Fiksacija vzorcev FFPE s formalinom lahko povzroči različne vrste poškodb DNA, vključno z deaminacijo citozina (mutacije C v T), oksidativnimi poškodbami (npr. 8-okso-gvanin, ki povzroča mutacije G v T) ter fizičnimi poškodbami, kot so enoverižne prekinitve, vrzeli in abazična mesta, ki ovirajo aktivnost DNA-polimeraze. Postopek fiksacije s formalinom lahko povzroči fragmentacijo DNA, kar otežuje genetske in genomske analize, kot sta PCR in sekvenciranje.
- Kakovost RNA: RNA, ekstrahirana iz tkiv FFPE, je pogosto fragmentirana in kemijsko modificirana, kar otežuje izvajanje visokokakovostnih transkriptomskih analiz.
- Modifikacije beljakovin: Formalin lahko povzroči kemijske modifikacije beljakovin, ki vplivajo na njihovo strukturo in funkcijo, kar lahko ovira proteomske analize.
- Artefakti pri obdelavi vzorcev: Med postopkom vklapljanja in rezanja lahko mehanske obremenitve in toplota povzročijo artefakte in dodatne poškodbe tkiva.
- Variabilnost med serijami: Razlike v protokolih fiksacije in vklapljanja med različnimi serijami lahko povzročijo znatno variabilnost rezultatov, kar otežuje primerjave med študijami.
- Težave pri shranjevanju: Dolgotrajno shranjevanje blokov FFPE lahko sčasoma povzroči dodatno razgradnjo in izgubo celovitosti nukleinskih kislin, kar vpliva na uporabnost arhivskih vzorcev za retrospektivne študije.
Navzkrižno povezovanje: Fiksacija s formalinom povzroča navzkrižno povezovanje beljakovin in nukleinskih kislin, kar lahko ovira molekularno analizo in vpliva na natančnost imunohistokemije in drugih testov.
Uporaba optimiziranih protokolov, skrbno ravnanje z vzorci in uporaba naprednih tehnik pomagajo izboljšati kakovost in zanesljivost podatkov, pridobljenih iz tkiv FFPE.
Kakšna je razlika med tkivom FFPE in zamrznjenim tkivom?
Tkivo FFPE (fiksirano s formalinom in vklopljeno v parafin) se konzervira s fiksacijo s formalinom in nato vklopi v parafinski vosek, kar omogoča dolgotrajno shranjevanje pri sobni temperaturi ob ohranjanju morfologije tkiva. Nasprotno se zamrznjeno tkivo hitro konzervira z zamrzovanjem, kar bolje ohranja celovitost nukleinskih kislin in beljakovin, vendar zahteva shranjevanje pri zelo nizkih temperaturah.
Katere kemikalije se uporabljajo za vklapljanje FFPE?
Kemikalije, ki se običajno uporabljajo za vklapljanje FFPE, vključujejo formalin za fiksacijo in parafinski vosek za vklapljanje. Pri vklapljanju FFPE se tkiva običajno fiksirajo z 10% (v/v) nevtralno pufriranim formalinom (FA) ali s sveže pripravljeno 4% (w/v) raztopino formaldehida (PFA), pripravljeno iz paraformaldehidnega prahu. Formalin, ki je raztopina formaldehida v vodi, je pufriran na nevtralen pH, da ohranja morfologijo tkiva in preprečuje čezmerno navzkrižno povezovanje. Raztopina na osnovi paraformaldehida prav tako zagotavlja učinkovito fiksacijo z navzkrižnim povezovanjem beljakovin, s čimer stabilizira strukturo tkiva za nadaljnje vklapljanje v parafinski vosek. Te kemikalije so bistvene za ohranjanje celovitosti in morfologije tkiva med postopkom fiksacije in vklapljanja.
Kako se parafin odstrani iz vzorcev FFPE?
Za odstranjevanje parafina iz vzorcev FFPE se tkivne rezine običajno večkrat izperejo s ksilenom, čemur sledi rehidracija skozi zaporedje padajočih koncentracij alkoholov in nazadnje z vodo. Ker je ksilen zelo strupen in predstavlja zdravstvena tveganja, kot so težave z dihanjem, draženje kože in morebitni dolgoročni učinki pri ponavljajoči se izpostavljenosti, se ultrazvočno odstranjevanje parafina v številnih laboratorijih uveljavlja kot obetavna alternativa. Ta metoda uporablja intenzivne ultrazvočne valove za učinkovito in varno odstranjevanje parafina brez potrebe po strupenih topilih, kot je ksilen, s čimer zmanjšuje tveganje za laboratorijsko osebje in ustvarja varnejše delovno okolje.
Kako dolgo je treba fiksirati tkiva za dobro kakovost vzorcev FFPE?
Splošna priporočila glede trajanja fiksacije običajno predlagajo fiksacijo tkivnih vzorcev v formalinu od 24 do 48 ur. To trajanje na splošno zadošča za ohranjanje morfologije tkiva in celičnih struktur, hkrati pa zmanjšuje čezmerno fiksacijo, ki lahko povzroči čezmerno navzkrižno povezovanje ter razgradnjo nukleinskih kislin in beljakovin. Vendar se lahko optimalni čas fiksacije razlikuje glede na velikost in vrsto tkiva, pri čemer manjši ali občutljivejši vzorci zahtevajo krajše čase fiksacije. Ključno je zagotoviti ustrezno fiksacijo, da se preprečita avtoliza in razgradnja tkiva, hkrati pa se izogniti dolgotrajni fiksaciji, ki bi lahko otežila nadaljnje molekularne analize.