Ultrazvuková solubilizácia proteínových peliet

V proteomike nie je príprava vzoriek nikdy zanedbateľným detailom. Je základom, na ktorom stoja presnosť identifikácie, spoľahlivosť kvantifikácie a reprodukovateľnosť. Jednou z najpretrvávajúcejších výziev pri príprave proteínových vzoriek je účinné opätovné rozpustenie proteínových peliet po krokoch zrážania alebo zahusťovania. Práve tu nadobúda ultrazvuková solubilizácia proteínových peliet čoraz väčší význam. Použitím riadenej sonikácie môžu laboratóriá zvýšiť výťažnosť proteínov, urýchliť rozpúšťanie peliet a účinnejšie pripraviť vzorky na následnú hmotnostnú spektrometriu a biochemickú analýzu.

Solubilizácia proteínov: prečo je sonikácia dôležitá v modernej proteomike

Proteínové pelety často vznikajú pri zrážaní acetónom, etanolom, zmesou metanolu a chloroformu, síranom amónnym alebo TCA. Tieto pracovné postupy sa vo veľkej miere používajú na odstránenie kontaminantov, zahustenie proteínov a čistenie extraktov pred analýzou. Po dokončení zrážania však môže byť ťažké výslednú peletu opätovne solubilizovať. Husté agregáty, hydrofóbne domény, proteíny asociované s membránami a silne interagujúce proteínové komplexy často odolávajú bežnému miešaniu alebo vortexovaniu. Neúplná solubilizácia potom môže viesť k strate vzorky, skreslenému zastúpeniu proteínov a nízkej reprodukovateľnosti medzi experimentmi.
Sonikácia rieši práve toto úzke miesto. Vytváraním mechanickej energie v kvapalnom prostredí narúša kompaktné štruktúry peliet, podporuje prenikanie pufra a disperguje agregovaný materiál do roztoku. Výsledkom je rýchlejšia a často úplnejšia rekonštitúcia proteínov, čo je obzvlášť cenné pri práci s obmedzeným množstvom vzoriek, komplexnými lyzátmi alebo náročnými proteomickými cieľmi.

Prečo sa proteínové pelety ťažko solubilizujú

Zrážanie proteínov je účinné, pretože spôsobuje ich vylúčenie z roztoku. Ten istý proces, vďaka ktorému je zrážanie užitočné, však zároveň vytvára problém opätovného získavania proteínov z peliet. Po vytvorení pelety sa proteíny môžu tesne zoskupiť a čiastočne denaturovať. Hydrofóbne interakcie sa môžu zintenzívniť, medzimolekulová väzba sa môže zosilniť a niektoré proteíny môžu zachytávať soli, lipidy, nukleové kyseliny alebo iné zložky matrice. Aj pri použití silného solubilizačného pufra je pasívna resuspenzia často pomalá a neúplná.
V proteomike je to dôležité, pretože neúplné rozpustenie pelety neznižuje len celkový výťažok. Môže selektívne vylúčiť určité triedy proteínov, najmä membránové proteíny, štruktúrne proteíny alebo proteíny náchylné na agregáciu. To znamená, že konečný analytický výsledok už nemusí odrážať skutočné zloženie pôvodnej vzorky. V proteomike s vysokým rozlíšením, kde môžu byť jemné rozdiely v zastúpení proteínov alebo v posttranslačných modifikáciách biologicky rozhodujúce, predstavuje takéto skreslenie pri príprave závažné obmedzenie.

Ako sonikácia zlepšuje solubilizáciu proteínových peliet

Ultrazvukové spracovanie zlepšuje solubilizáciu vnášaním vysokofrekvenčnej mechanickej energie do vzorky. Táto energia pomáha rozrušovať kompaktný materiál pelety a zvyšuje kontakt medzi solubilizačným pufrom a proteínmi zachytenými v pelete. Namiesto spoliehania sa len na difúziu a ručné miešanie tento proces aktívne disperguje peletu na menšie frakcie, ktoré sa ľahšie rozpúšťajú.

Praktický účinok je významný. Sonikácia môže:

• urýchliť rozpúšťanie hustých alebo ťažko rozpustných proteínových peliet
• zlepšiť výťažnosť slabo rozpustných a agregovaných proteínov
• skrátiť čas prípravy v proteomických pracovných postupoch
• prispieť k vyššej homogenite vzoriek na štiepenie a analýzu

Táto zlepšená dispergácia je obzvlášť užitočná, keď sa pelety resuspendujú v pufroch obsahujúcich močovinu, tiomočovinu, detergenty, chaotropné látky alebo iné činidlá bežne používané v proteomike. Sonikácia pomáha týmto zložkám účinnejšie preniknúť k pelete a solubilizovať ju, čím vzniká rovnomernejší roztok vzorky.

Výhody ultrazvukovej solubilizácie v proteomike

Hlavnou výhodou ultrazvukovej solubilizácie je, že premieňa často podceňovaný krok prípravy na kontrolovateľný a účinný proces. V proteomike to má priame dôsledky pre analýzu.

1. Po prvé, zlepšená solubilizácia zvyšuje pravdepodobnosť, že vzorka vstupujúca do enzymatického štiepenia bude reprezentatívna pre celú populáciu proteínov. Napríklad štiepenie trypsínom závisí od toho, či sú proteíny dostatočne rozvinuté a prístupné v roztoku. Ak časti pelety zostanú nerozpustené, tieto proteíny sú v podstate vylúčené z tvorby peptidov, a teda aj z detekcie.
2. Po druhé, sonikácia môže zlepšiť reprodukovateľnosť. Manuálna resuspenzia peliet je zo svojej podstaty variabilná, najmä ak sa na nej podieľajú rôzni pracovníci alebo sa líšia veľkosti peliet či matrice vzoriek. Riadené ultrazvukové spracovanie štandardizuje fyzikálnu energiu dodávanú do vzorky, čo môže znížiť variabilitu medzi jednotlivými prípravami a zlepšiť konzistentnosť v následných pracovných postupoch využívajúcich LC-MS alebo gély.
3. Po tretie, ultrazvukové spracovanie je veľmi cenné pri vzorkách s malým množstvom vstupného materiálu a pri vzácnych vzorkách. Klinická proteomika, objavovanie biomarkerov, experimenty s bunkovými kultúrami a štúdie tkanív často využívajú obmedzené množstvo materiálu. Akákoľvek strata proteínov počas solubilizácie znižuje informačnú hodnotu vzorky. Účinné opätovné rozpúšťanie ultrazvukom pomáha zachovať čo najväčšie množstvo analytu.
4. Napokon sonikácia podporuje rýchlosť pracovného postupu. Proteomické laboratóriá spracúvajúce viacero vzoriek potrebujú robustné a časovo efektívne metódy prípravy. Peleta, ktorá sa rýchlo a úplne rozpustí, neprináša len pohodlie; skracuje zdržania, znižuje riziko chýb pri manipulácii a zvyšuje počet spracovaných vzoriek za jednotku času.

Sonikácia v porovnaní s konvenčnými metódami resuspenzie

Tradičné metódy resuspenzie peliet zvyčajne zahŕňajú pipetovanie, miešanie, vortexovanie, predĺženú inkubáciu alebo opakované kroky zahrievania. Hoci tieto techniky môžu fungovať pri voľne zhutnených peletách, pri vysoko kompaktnom alebo hydrofóbnom proteínovom materiáli často narážajú na obmedzenia. Samotné mechanické miešanie nemusí úplne rozrušiť štruktúru pelety, takže zostávajú viditeľné častice alebo neviditeľné nerozpustné frakcie.
Sonikácia poskytuje aktívnejší a cielenejší prístup. Namiesto spoliehania sa na pomalú difúziu pufra fyzicky rozrušuje peletu a podporuje rýchlu homogenizáciu. Tým sa neodstraňuje potreba vhodného resuspenzného pufra, ale podstatne sa zvyšuje jeho účinnosť.
V porovnaní s čisto manuálnymi metódami ultrazvuková solubilizácia často ponúka lepšiu kontrolu procesu, vyššiu účinnosť a lepšiu vhodnosť pre náročné proteomické aplikácie. Pre laboratóriá, ktoré požadujú kvalitu analýzy aj prevádzkovú spoľahlivosť, je preto sonikácia presvedčivou voľbou.

Najvhodnejšie aplikácie ultrazvukovej solubilizácie proteínových peliet

Ultrazvuková solubilizácia je obzvlášť prínosná v pracovných postupoch zahŕňajúcich:

• precipitáciu proteínov pred hmotnostnou spektrometriou,
• rekonštitúciu peliet z bunkových lyzátov alebo tkanivových extraktov,
• získavanie proteínov bohatých na membrány alebo náchylných na agregáciu,
• a prípravu vzoriek na kvantitatívnu proteomiku, kde je reprodukovateľnosť nevyhnutná.

Je tiež veľmi dôležitá v prípadoch, keď boli pelety skladované, nadmerne vysušené alebo pripravené z komplexných biologických matríc. V takýchto prípadoch môže byť pasívna resuspenzia obzvlášť neúčinná, zatiaľ čo sonikácia pomáha obnoviť použiteľnosť vzorky s menším množstvom manuálnych zásahov.

Nájdite najlepší sonikátor pre svoj pracovný postup solubilizácie proteínov!

Pre laboratóriá pracujúce so vzácnymi vzorkami, malým množstvom východiskového materiálu alebo v oblasti proteomiky s vysokou kapacitou spracovania vzoriek ponúka portfólio Hielscher niekoľko foriem sonikácie, ktoré možno presne prispôsobiť pracovnému postupu.
Či už si vyberiete sondový sonikátor Hielscher, VialTweeter Multi-Tube Sonicator alebo UIP400MTP Microplate Sonicator – každý model ultrazvukového prístroja je určený pre iný scenár prípravy vzoriek, pričom všetky majú rovnakú hlavnú výhodu: reprodukovateľnú ultrazvukovú energiu na účinné a kontrolované spracovanie vzoriek.

Sondové sonikátory

Ultrazvukové sondy, ako je UP200Ht, sú obzvlášť vhodné na priamu sonikáciu jednotlivých vzoriek. Pre proteomické laboratóriá je UP200Ht výbornou voľbou, keď proteínové pelety vyžadujú intenzívnu resuspenziu v malých až stredných objemoch, najmä tam, kde je dôležitá kontrola metódy a opakovateľnosť. Priama sonikácia sondou môže rýchlo narušiť kompaktný materiál pelety a pomôcť solubilizačným pufrom preniknúť k proteínom, ktoré by inak zostali čiastočne nerozpustené.
Prehľad všetkých sondových sonikátorov!
 
 
 

VialTweeter Multi-Tube Sonicator

Tam, kde sa musí viacero uzavretých liekoviek spracovať za rovnakých podmienok, ponúka Multi-Tube Sonicator VialTweeter výraznú výhodu. VialTweeter umožňuje intenzívnu sonikáciu malých objemov sonikáciou viacerých uzavretých liekoviek za sterilných podmienok. Súčasná príprava vzoriek vo viacerých skúmavkách za rovnakých podmienok, ako aj znížené riziko krížovej kontaminácie, straty vzorky a tvorby aerosólov pri spracovaní v uzavretých liekovkách robia z prístroja VialTweeter spoľahlivý nástroj na prípravu vzoriek. V proteomike je to veľmi dôležité pri manipulácii s cennými peletami z viacerých replikátov alebo klinických vzoriek, kde je rozhodujúca konzistentnosť medzi skúmavkami.
Zistite viac o prístroji VialTweeter!

Microplate Sonicator UIP400MTP

Pre laboratóriá s vysokou kapacitou spracovania vzoriek rozširuje sonikátor mikrotitračných platničiek UIP400MTP výhody sonikácie na pracovné postupy využívajúce platničky. UIP400MTP ako sonikátor mikrotitračných a viacjamkových platničiek na rovnomerné ultrazvukové spracovanie v celom rozsahu štandardných platničiek vrátane 96-jamkových formátov a zdôrazňuje svoju vhodnosť na automatizovanú prípravu vzoriek v oblastiach, ako sú proteomika, diagnostika a objavovanie liečiv. Platforma je navrhnutá na súčasné spracovanie mnohých vzoriek a ponúka výhody, ako sú znížené riziko krížovej kontaminácie, nižšia prácnosť, vyššia výťažnosť vzoriek a integrácia do automatizovaných pracovných postupov.
V praktickej proteomike to znamená, že rozsah solubilizácie peliet, lýzy buniek, extrakcie a súvisiacich krokov prípravy možno zväčšovať oveľa efektívnejšie. Namiesto spracovania vzoriek po jednej môžu laboratóriá sonikovať celé platničky s konzistentným prísunom energie. To je cenné vždy, keď pracovné postupy musia spájať vysokú kapacitu spracovania vzoriek s analytickou dôslednosťou, napríklad pri skríningových štúdiách, kvantitatívnej proteomike alebo štandardizovaných postupoch prípravy vzoriek. UIP400MTP preto nie je len nástrojom na uľahčenie práce; je to platforma, ktorá podporuje širší trend smerom k automatizácii, reprodukovateľnosti a robustnej proteomike s vysokou kapacitou spracovania vzoriek.
Zistite viac o prístroji UIP400MTP Microplate Sonicator!

Návrh, výroba a poradenstvo – kvalita vyrobená v Nemecku

Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojimi najvyššími štandardmi kvality a konštrukčného vyhotovenia. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných prevádzok. Ultrazvukové prístroje Hielscher ľahko zvládajú drsné podmienky a náročné prostredia.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť certifikovaná podľa ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje, ktoré sa vyznačujú najmodernejšou technológiou a používateľskou prívetivosťou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.

Literatúra / Referencie

• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
• Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
• Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.