Extrakcia proteínov z nádorového tkaniva za pomoci sonikácie – protokol

Tento protokol opisuje metódu extrakcie proteínov z nádorového tkaniva za pomoci sonikácie, ktorá zdokonaľuje štandardný pracovný postup lýzy močovinou podľa CPTAC pridaním riadeného kroku sonikácie sondou počas rozrušovania tkaniva. Táto úprava vychádza zo zavedenej stratégie prípravy vzoriek na hĺbkovú analýzu proteómu a fosfoproteómu podľa CPTAC, zlepšuje rozrušovanie buniek a subcelulárnych štruktúr, znižuje viskozitu vzorky a zlepšuje uvoľňovanie proteínov, ktoré sa samotnou lýzou močovinou zvyčajne získavajú ťažšie, najmä proteínov viazaných na membrány a proteínov viažucich DNA alebo asociovaných s jadrom. V štúdii, z ktorej tento protokol vychádza, pracovný postup so sonikáciou zvýšil detekciu proteínov aj fosfopeptidov pri zachovaní kompatibility s nadväzujúcimi krokmi štiepenia podľa CPTAC, značenia TMT, frakcionácie, obohacovania fosfopeptidov a analýzy LC-MS/MS.

Extrakcia proteínov z nádorového tkaniva za pomoci sonikácie na hĺbkovú proteomickú a fosfoproteomickú analýzu

Nasledujúci protokol je optimalizovaný na extrakciu proteínov z kryogénne rozomletého nádorového tkaniva v lyzačnom pufri s 8 M močovinou: Pridaný krok sonikácie sondou zlepšuje výťažnosť ťažko extrahovateľných tried proteínov, najmä proteínov asociovaných s membránami a s DNA/jadrom, pred štiepením a následnou analýzou LC-MS/MS. V štúdii Li et al. (2025), z ktorej tento protokol vychádza, pridanie sonikácie zvýšilo detekciu proteínov asociovaných s membránami a jadrom a v rámci použitého pracovného postupu umožnilo hĺbkové pokrytie >12 000 proteínov a >25 000 fosfopeptidov.

Oblasť použitia protokolu

Tento postup použite pre:

• čerstvo zmrazené, kryogénne rozomleté nádorové tkanivo
• bunkové pelety alebo iné biologické vzorky, pri ktorých je extrakcia na báze močoviny už zavedená
• pracovné postupy globálnej proteomiky a fosfoproteomiky využívajúce tryptické štiepenie a voliteľné značenie TMT

Štúdia Li et al. (2025) uvádza, že pracovný postup je použiteľný aj pre iné typy vzoriek, ako sú bunkové línie, krv a moč, môže však byť potrebná optimalizácia podľa typu vzorky.

Optimalizovaný pracovný postup prípravy vzoriek so zaradeným krokom sonikácie. Optimalizovaný pracovný postup a experimentálny dizajn vychádzajú z protokolu prípravy vzoriek podľa CPTAC na globálnu proteomickú a fosfoproteomickú analýzu.
Štúdia a schéma: ©Li et al., 2025

Princíp fungovania

Pôvodná štúdia pridala sonikáciu do štandardného pracovného postupu lýzy močovinou podľa CPTAC a zistila zlepšenie detekcie proteínov asociovaných s membránami a jadrami. Autori uvádzajú, že parametre sonikácie sa musia presne doladiť vzhľadom na veľkosť/koncentráciu vzorky – voľbou veľkosti sonotródy, privedenej energie a časovania impulzov.

Napríklad pre Hielscher UP200Ht a UP200St to znamená:

• používajte amplitúdu a impulzný režim ako hlavné riadiace premenné
• udržiavajte vzorky počas celého postupu v chlade (t. j. na ľade)
• začnite s konzervatívnymi nastaveniami
• optimalizujte podľa čírosti vzorky, teploty, výťažku proteínov a kvality peptidov v nadväzujúcich krokoch

 
Oba modely sonikátorov Hielscher s výkonom 200 wattov, UP200Ht a UP200St, sú navrhnuté pre malé a stredné objemy vzoriek a majú nastaviteľnú amplitúdu a impulzy; oba ultrazvukové homogenizátory poskytujú digitálne ovládanie dotykovou obrazovkou na presné nastavenie parametrov, automatizovaný záznam údajov, pripojiteľný teplotný snímač, diaľkové ovládanie a osvetlenie vzorky.
 

Reagencie na extrakciu proteínov za pomoci sonikácie

Lyzačný pufer s močovinou

Pripravte čerstvý bezprostredne pred použitím:

• 8 M močovina
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinín
• 10 µg/mL leupeptín
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Močovina musí byť pred pridaním prísad úplne rozpustená; inhibítory by sa mali pridať bezprostredne pred použitím; pufer by sa mal uchovávať na ľade; po pridaní prísad sa odporúča premiešavanie krúživým pohybom namiesto intenzívneho miešania na vortexovom miešači.
 

Ďalšie reagencie:

• Reagencie na stanovenie proteínov metódou BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jódacetamid
• LysC
• Trypsín
• Kyselina mravčia
• Reagencie TMT, ak sa používa multiplexná kvantitatívna proteomika
• Reagencie IMAC, ak sa vykonáva obohacovanie fosfopeptidov

Vybavenie na extrakciu proteínov s podporou sonikácie

Potrebné vybavenie

Odporúčaný výber sondy

Pri vzorkách s objemom približne 200–1000 µL použite sonotródu s malým priemerom vhodnú na priame spracovanie malých objemov s vysokou intenzitou. Hielscher ponúka sonotródy s rôznymi priemermi, pričom menšie priemery hrotov poskytujú vyššiu intenzitu na hrote.

Praktická poznámka: Použite najmenšiu sondu, ktorá zabezpečuje účinné miešanie bez nadmerného penenia alebo kontaktu so stenou nádoby.

Ak pracujete s viacerými vzorkami súčasne, môžete zvážiť sonikátor VialTweeter na viacero skúmaviek alebo sonikátor UIP400MTP na mikrotitračné platničky!

Pokyny krok za krokom: Postup extrakcie proteínov s podporou sonikácie

A. Predchladenie a príprava

1. Ochlaďte centrifúgu na 4°C.
2. Pripravte čerstvý lyzačný pufor s močovinou a uchovávajte ho na ľade.
3. Umiestnite UP200Ht alebo UP200St na stojan do protihlukového krytu.
4. Pripravte dostatočne veľký ľadový kúpeľ, aby v ňom skúmavky so vzorkami stáli zvislo a stabilne.

Príprava čerstvého pufra a manipulácia za chladu sú kľúčové.

B. Počiatočná extrakcia močovinou

1. Kryogénne rozomleté tkanivo uchovávajte na ľade.
2. Pridajte 200 µL vychladeného lyzačného pufra s močovinou na 50 mg vlhkého tkaniva.
3. Miešajte na vortexovom mixéri pri vysokých otáčkach 5–10 s.
4. Inkubujte 15 min pri 4°C.
5. Krok miešania na vortexovom mixéri s následnou inkubáciou zopakujte ešte raz.
6. Centrifugujte pri 20 000g počas 10 min pri 4°C.
7. Preneste lyzát/supernatant do čistej skúmavky s nízkou adsorpciou.

C. Sonikácia pomocou UP200Ht alebo UP200St

Počiatočné podmienky sonikácie

• Amplitúda: začnite pri 20–30%
• Dĺžka impulzu: 5 s so zapnutým ultrazvukom
• Chladenie: 2 min na ľade medzi impulzmi
• Počet cyklov: 4 cykly
• Celkový čas aktívnej sonikácie: 20 s
• Celkový čas procesu vrátane chladenia: približne 8–10 min

Kroky sonikácie

1. Preneste lyzát do skúmavky vhodnej na sonikáciu. Použite úzku tenkostennú skúmavku, ktorá umožňuje dobrú výmenu tepla a bezpečné ponorenie sondy.
2. Vložte skúmavku do ľadového kúpeľa. V článku sa chladenie počas sonikácie označuje za kľúčové na zabránenie tepelnému poškodeniu.
3. Ponorte hrot sondy do vzorky. Hrot udržiavajte dostatočne ponorený na zabezpečenie stabilnej kavitácie, ale nedovoľte, aby sa dotýkal steny alebo dna skúmavky.
4. Spustite jeden 5 s impulz pri počiatočnej amplitúde.
5. Vzorku ihneď opäť úplne uložte do ľadu na 2 min.
6. Opakujte, kým nebudú dokončené 4 cykly.
7. Po cykle skontrolujte lyzát.
8. Pokračujte len v prípade potreby, vždy po jednom ďalšom 5 s impulze, po ktorom vždy nasleduje úplné ochladenie.
9. Ukončite sonikáciu, keď sa lyzát stane homogénnejším a menej ťahavým/viskóznym.
   Koncovým bodom je priesvitnejší lyzát, ktorý tvorí kvapky namiesto súvislého viskózneho prúdu.
10. Centrifugujte pri približne 16 000g počas 15 min pri 4°C.
11. Preneste vyčírený supernatant do novej skúmavky a zmerajte koncentráciu proteínov.

Porovnanie globálnej proteomiky a fosfoproteomiky medzi sonikovanými a nesonikovanými vzorkami.
a. Počet identifikovaných proteínov (globálna proteomika) vo všetkých nádorových tkanivách PDX so sonikáciou alebo bez nej. b. Počet identifikovaných fosfopeptidov (obohacovanie pomocou IMAC) vo všetkých nádorových tkanivách PDX so sonikáciou alebo bez nej. Započítali sa iba proteíny a fosfopeptidy s pomerom abundancie vyšším alebo rovným 25. percentilu. Pomer abundancie sa vypočítal medzi rovnakými typmi vzoriek.
Štúdia a grafy: ©Li et al., 2025

Následné štiepenie a analýza

Po sonikácii a vyčírení pokračujte podľa pôvodného pracovného postupu v štýle CPTAC:

1. Zrieďte lyzát v pomere 1:3 (v/v) roztokom 50 mM Tris-HCl s pH 8,0, aby sa koncentrácia močoviny znížila na <2 M.
2. Pridajte LysC v množstve 1 mAU na 50 µg proteínu a inkubujte 2 h pri 25°C.
3. Pridajte trypsín v pomere enzým:substrát 1:49 (w/w) a nechajte štiepiť cez noc pri 25°C.
4. Zastavte reakciu pridaním kyseliny mravčej na konečnú koncentráciu 1%.
5. Podľa potreby pokračujte odsoľovaním, značením TMT, frakcionáciou, obohacovaním fosfopeptidov a analýzou LC-MS/MS.

Diferenciálna expresia fosfopeptidov z MS so značením TMT.
a. Bazálny podtyp so zvýraznením niektorých ľudských fosfopeptidov (začiatok a koniec proteínovej sekvencie) so zvýšenou expresiou v sonikovaných vzorkách v porovnaní s nesonikovanými vzorkami. b. Luminálny podtyp so zvýraznením niektorých ľudských fosfopeptidov (začiatok a koniec proteínovej sekvencie) so zvýšenou expresiou v sonikovaných vzorkách v porovnaní s nesonikovanými vzorkami. c. Obohatené dráhy KEGG na základe proteínov, z ktorých pochádzajú fosfopeptidy so zvýšenou expresiou v sonikovaných vzorkách bazálneho podtypu nádorov. d. Obohatené dráhy KEGG na základe proteínov, z ktorých pochádzajú fosfopeptidy so zvýšenou expresiou v sonikovaných vzorkách luminálneho podtypu nádorov.
Štúdia a grafy: ©Li et al., 2025

Návrh, výroba a poradenstvo – kvalita vyrobená v Nemecku

Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojimi najvyššími štandardmi kvality a dizajnu. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných prevádzok. Ultrazvukové prístroje Hielscher ľahko zvládajú drsné podmienky a náročné prostredia.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje, ktoré sa vyznačujú najmodernejšou technológiou a jednoduchým používaním. Samozrejme, ultrazvukové prístroje Hielscher sú v súlade s požiadavkami CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.

Literatúra / Referencie

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.