Extrakcia proteínov z nádorového tkaniva pomocou sonikácie – protokol

Tento protokol opisuje metódu extrakcie proteínov z nádorového tkaniva s asistenciou sonikácie, ktorá zdokonaľuje štandardný pracovný postup lýzy močovinou CPTAC pridaním kontrolovaného kroku sonikácie počas rozrušovania tkaniva. Táto modifikácia, ktorá vychádza zo zavedenej stratégie prípravy proteómu a fosfoproteómu CPTAC v hĺbkovom meradle, zlepšuje narušenie bunkovej a subcelulárnej štruktúry, znižuje viskozitu vzorky a zlepšuje uvoľňovanie proteínov, ktoré sa zvyčajne ťažšie obnovujú len pomocou močovinovej lýzy, najmä proteínov viazaných na membrány a DNA alebo proteínov súvisiacich s jadrom. V základnej štúdii pracovný postup s podporou sonikácie zvýšil detekciu proteínov aj fosfopeptidov pri zachovaní kompatibility s následným štiepením v štýle CPTAC, značením TMT, frakcionáciou, obohacovaním fosfopeptidov a postupom analýzy LC-MS/MS.

Extrakcia proteínov z nádorového tkaniva za pomoci sonikácie na hĺbkovú proteomickú a fosfoproteomickú analýzu

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Oblasť použitia protokolu

Tento postup použite na:

• čerstvo zmrazené, kryopulverizované nádorové tkanivo
• bunkové pelety alebo iné biologické vzorky, pri ktorých je už zavedená extrakcia na báze močoviny
• globálne proteomické a fosfoproteomické pracovné postupy s použitím tryptického trávenia a voliteľného značenia TMT

V štúdii Li et al. (2025) sa uvádza, že pracovný postup je použiteľný aj pre iné typy vzoriek, ako sú bunkové línie, krv a moč, avšak môže byť potrebná optimalizácia podľa typu vzorky.

Optimalizovaný pracovný postup prípravy vzorky so zavedeným krokom sonikácie. Optimalizovaný pracovný postup a experimentálny dizajn vychádzajú z protokolu prípravy vzoriek CPTAC pre globálnu proteomickú a fosfoproteomickú analýzu.
Štúdia a schéma: ©Li et al., 2025

Pracovný princíp

V pôvodnej štúdii sa do štandardného pracovného postupu lýzy močovinou CPTAC pridala sonikácia a zistila sa lepšia detekcia proteínov spojených s membránami a jadrami. Autori uvádzajú, že parametre sonikácie musia byť presne nastavené vzhľadom na veľkosť/koncentráciu vzorky – výberom veľkosti sonotródy, príkonu energie a časovania impulzov.

Napríklad pre Hielscher UP200Ht a UP200St to znamená:

• ako hlavné riadiace veličiny použiť amplitúdu a režim impulzov
• udržiavať vzorky v chlade (t. j. na ľade).
• začať s konzervatívnymi nastaveniami
• optimalizácia vzhľadom na čistotu vzorky, teplotu, výťažok proteínov a kvalitu peptidov

 
Oba modely sonikátorov Hielscher 200 W UP200Ht a UP200St sú určené pre malé a stredné objemy vzoriek, s nastaviteľnou amplitúdou a nastavením impulzov; oba ultrazvukové homogenizátory poskytujú digitálne dotykové ovládanie na presné nastavenie parametrov, automatické zaznamenávanie údajov, pripojiteľný teplotný senzor, diaľkové ovládanie, osvetlenie vzorky.
 

Činidlá na extrakciu proteínov pomocou sonikácie

Močovinový lyzačný tlmivý roztok

Pripravte čerstvé bezprostredne pred použitím:

• 8 M močoviny
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/ml aprotinínu
• 10 µg/ml leupeptínu
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Koktail inhibítorov fosfatázy 2, 1:100 (v/v)
• Koktail inhibítorov fosfatázy 3, 1:100 (v/v)

Pred pridaním aditív sa musí močovina úplne rozpustiť, inhibítory sa pridávajú bezprostredne pred použitím, pufr sa uchováva na ľade a po pridaní aditív sa odporúča skôr vírenie ako prudké premiešavanie.
 

Ďalšie činidlá:

• Reagencie na stanovenie bielkovín BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoacetamid
• LysC
• trypsín
• Kyselina mravčia
• činidlá TMT, ak sa používa multiplexovaná kvantitatívna proteomika
• činidlá IMAC, ak sa vykonáva obohacovanie fosfopeptidov

Zariadenia na extrakciu proteínov pomocou sonikácie

Požadované

Odporúčaný výber sondy

Pri vzorkách s objemom približne 200-1000 µl použite sonotródu s malým priemerom vhodnú na priame spracovanie malých objemov s vysokou intenzitou. Spoločnosť Hielscher ponúka viacero priemerov sonotród a menšie priemery hrotov poskytujú vyššiu intenzitu na hrote.

Praktická poznámka: Použite najmenšiu sondu, ktorá zabezpečí účinné miešanie bez nadmerného penenia alebo kontaktu so stenou nádoby.

Ak pracujete s viacerými vzorkami súčasne, môžete zvážiť viacrúrkový sonikátor VialTweeter alebo sonikátor mikrotitračných platní UIP400MTP!

Pokyny krok za krokom: Postup extrakcie proteínov pomocou sonikácie

A. Predchladenie a príprava

1. Odstredivku ochlaďte na 4 °C.
2. Pripravte si čerstvý lyzačný pufr močoviny a uchovávajte ho na ľade.
3. Zariadenie UP200Ht alebo UP200St postavte na stojan vo vnútri zvukovej skrine.
4. Pripravte si dostatočne veľký ľadový kúpeľ, aby sa skúmavky so vzorkami udržali vo vzpriamenej a stabilnej polohe.

Príprava čerstvého pufru a manipulácia s chladom sú veľmi dôležité.

B. Počiatočná extrakcia močoviny

1. Kryopulverizované tkanivo uchovávajte v ľade.
2. Pridajte 200 µl vychladeného lyzačného pufru močoviny na 50 mg vlhkého tkaniva.
3. Vír 5-10 s pri vysokej rýchlosti.
4. Inkubujte 15 minút pri 4 °C.
5. Zopakujte krok vortex plus inkubácia ešte raz.
6. Odstreďujte pri 20 000 g počas 10 minút pri 4 °C.
7. Lyzát/supernatant preneste do čistej skúmavky s nízkou väzbou.

C. Sonikácia pomocou UP200Ht alebo UP200St

Východiskové podmienky pre sonikáciu

• Amplitúda: začína na 20-30 %
• Dĺžka impulzu: 5 s ON
• Chladenie: 2 minúty na ľade medzi pulzmi
• Počet cyklov: 4 cykly
• Celkový čas aktívnej sonikácie: 20 s
• Celkový čas procesu vrátane chladenia: približne 8-10 min.

Kroky sonikácie

1. Lyzát preneste do skúmavky vhodnej na sonikáciu. Použite úzku, tenkostennú skúmavku, ktorá umožňuje dobrú výmenu tepla a bezpečné ponorenie sondy.
2. Vložte skúmavku do ľadového kúpeľa. V dokumente sa uvádza, že chladenie počas sonikácie je rozhodujúce, aby sa zabránilo poškodeniu teplom.
3. Ponorte hrot sondy do vzorky. Udržujte hrot ponorený dostatočne, aby bola kavitácia stabilná, ale nedovoľte, aby sa dotýkal steny alebo dna skúmavky.
4. Vykonajte jeden 5-sekundový impulz s počiatočnou amplitúdou.
5. Okamžite vráťte vzorku úplne na ľad na 2 minúty.
6. Opakujte, kým sa neukončia 4 cykly.
7. Po ukončení cyklu skontrolujte lyzát.
8. Pokračujte len v prípade potreby, pričom použite vždy jeden ďalší 5-sekundový impulz, po ktorom vždy nasleduje úplné ochladenie.
9. Zastavte, keď sa lyzát stane rovnomernejším a menej vláknitým/viskóznym.
   Konečným bodom je priesvitnejší lyzát, ktorý tvorí skôr kvapky ako súvislý viskózny tok.
10. Odstreďujte pri približne 16 000 g počas 15 minút pri 4 °C.
11. Preveďte vyčírený supernatant do čerstvej skúmavky a zmerajte koncentráciu bielkovín.

Porovnanie globálnej proteomiky a fosfoproteomiky medzi sonikovanými a nesonikovanými vzorkami.
a. Počet identifikovaných proteínov (globálna proteomika) vo všetkých nádorových tkanivách PDX so sonikáciou alebo bez nej. b. Počet identifikovaných fosfopeptidov (obohatenie IMAC) vo všetkých nádorových tkanivách PDX so sonikáciou alebo bez nej. Počítali sa len proteíny a fosfopeptidy s pomerom abundancie väčším alebo rovným 25. percentilu. Pomer abundancie sa vypočítal medzi rovnakými typmi vzoriek.
Štúdia a grafy: ©Li et al., 2025

Následná digescia a analýza

Po sonikácii a čírení postupujte podľa pôvodného pracovného postupu v štýle CPTAC:

1. Lyzát zrieďte v pomere 1:3 (v/v) s 50 mM Tris-HCl pH 8,0, aby sa močovina zredukovala na <2 M.
2. Pridajte LysC v množstve 1 mAU na 50 µg proteínu a inkubujte 2 h pri 25 °C.
3. Pridajte trypsín v pomere 1:49 enzým:substrát (w/w) a trávte cez noc pri 25 °C.
4. Chlaďte kyselinou mravčou na konečnú koncentráciu 1 %.
5. Pokračujte v odsoľovaní, značení TMT, frakcionácii, obohacovaní fosfopeptidov a LC-MS/MS podľa potreby.

Diferenciálna expresia fosfopeptidov z MS značených TMT.
a. Bazálny podtyp, zvýraznenie niektorých ľudských fosfopeptidov (začiatok a koniec proteínovej sekvencie) regulovaných v sonikovaných vzorkách v porovnaní s nonsonikovanými vzorkami. b. Luminálny podtyp, zvýraznenie niektorých ľudských fosfopeptidov (začiatok a koniec proteínovej sekvencie) regulovaných v sonikovaných vzorkách v porovnaní s nonsonikovanými vzorkami. c. Obohatené dráhy KEGG na základe proteínov upregulovaných fosfopeptidov v sonikovaných bazálnych podtypoch nádorov. d. Obohatené dráhy KEGG na základe proteínov upregulovaných fosfopeptidov v sonikovaných luminálnych podtypoch nádorov.
Štúdia a grafy: ©Li et al., 2025

Dizajn, výroba a poradenstvo – Kvalita vyrobená v Nemecku

Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojou najvyššou kvalitou a dizajnovými štandardmi. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných zariadení. Drsné podmienky a náročné prostredie ľahko zvládnu ultrazvukové prístroje Hielscher.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a užívateľskou prívetivosťou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.

Literatúra / Referencie