Ultrazvuková extrakcia proteínov z tkanivových a bunkových kultúr
- Extrakcia proteínov je základným krokom prípravy vzorky v proteomike.
- Bielkoviny je možné extrahovať z rastlinných a živočíšnych tkanív, kvasiniek a mikroorganizmov.
- Sonikácia je spoľahlivá a účinná metóda extrakcie bielkovín, ktorá poskytuje vysoké výťažky bielkovín v krátkom čase extrakcie.
Extrakcia bielkovín z tkanív a buniek
Extrakcia proteínov z tkanív a kultivovaných buniek je základným krokom prípravy vzorky, ktorý sa vykonáva počas mnohých biochemických a analytických techník, ako sú ELISA, PAGE, Western blotting, hmotnostná spektrometria alebo purifikácia proteínov. Ultrazvukové narušenie, lýza a extrakcia buniek je presne kontrolovateľná, netepelná technika na zabezpečenie vysokých výťažkov bielkovín.
Extrakcia bielkovín z buniek pomocou ultrazvuková sonda UP200St
- Rýchly
- vysoké výnosy
- Vysoko efektívny
- Presná kontrola nad parametrami
- reprodukovateľné výsledky
- lineárna škálovateľnosť
Všeobecné pokyny pre ultrazvukovú lýzu a extrakciu bielkovín
- Regulácia teploty: Aby sa zabezpečil vysoký výťažok bielkovín bez tepelnej denaturácie, musí sa počas extrakcie regulovať teplota. Najmodernejšie ultrazvukové homogenizátory Hielscher – tiež nazývaný ultrazvukový dezintegrátor alebo ultrasonizátor – sú presne ovládateľné. Dodávajú sa so zásuvným snímačom teploty. V možnostiach nastavenia ultrazvukového homogenizátora je možné nastaviť maximálnu teplotu. Keď sa dosiahne táto maximálna teplota, ultrazvuk sa automaticky zastaví, kým sample vychladne.
- Nárazník: Výber vhodného pufra a správny objem pufra sa líši od tkaniva k tkanivu a musí sa zistiť testovaním pokus-omyl.
- Izolácia / čistenie: Proteínové lyzáty môžu obsahovať prebytok biomolekúl, ako je DNA alebo sacharidy, ktoré môžu byť odstránené zrážaním bielkovín (kyselina deoxycholát-trichlóroctová) alebo výmenou pufru.
Chittapalo a Noomhorm (2009) vo svojej štúdii uviedli, že výťažok bielkovín sa zvýšil pomocou sonikácie a že proces homogenizácie a lýzy ultrazvukového tkaniva môže výrazne zlepšiť existujúce extrakčné procesy – umožnenie nových komerčných príležitostí na ťažbu.
Ultrazvukový CupHorn na súčasnú, vysoko účinnú prípravu viacerých vzoriek za rovnakých podmienok na izoláciu proteínov a fragmentáciu DNA.
Extrakcia bielkovín zo živočíšneho tkaniva
Na prípravu tkaniva celej veľkosti (napr. obličiek, srdca, pľúc, svalov atď.) by sa tkanivo malo rozpreparovať na veľmi malé kúsky čistými nástrojmi, najlepšie na ľade a čo najrýchlejšie, aby sa zabránilo degradácii proteázami (napr. lyzačný pufr, ako je RIPA, alebo hypotonický lyzačný pufr obsahujúci proteázu a kokteil inhibítorov fosfatázy). Po pitve sa vzorka ponorí do kvapalného dusíka na rýchle zmrazenie. Vzorka sa môže skladovať pri teplote -80 °C na neskoršie použitie alebo sa môže uchovávať na ľade na okamžitú homogenizáciu. Bezprostredne pred ultrazvukovou extrakciou sa do skúmavky na vzorku rýchlo pridá ľadovo studený lýzny pufr (s inhibítormi proteázy DTT, leupeptínom a aprotinínom) (na ~10 mg tkaniva sa odporúča približne ~ 600 μl pufra). Približne 20-60 mg tkaniva sa odporúča na skúmavku na vzorku.
Ultrazvuková homogenizácia, lýza a extrakcia sa vykonáva pomocou ultrazvukového homogenizátora, ako je UP100H alebo UP200Ht, vybaveného sonotródou s mikrohrotom. Trvanie sonikácie je 60-90 sekúnd v režime ultrazvukového cyklu 15 sekúnd sonikácie a 10 sekúnd odpočinku. Vzorka by sa mala neustále uchovávať v ľade.
Po ultrazvukovej homogenizácii / extrakcii sa lyzát odstredí pri 27 000 g po dobu cca. 20 min. Potom sa supernatent zhromažďuje, takže koncentráciu bielkovín je možné určiť pomocou proteínového testu, ako je Pierceov proteínový test BCA.
Extrakcia proteínov z krvného séra
Pre homogénnu zmes séra a fosfátového pufra sa vzorka najskôr víruje pred ultrazvukovou lýzou buniek. Na ultrazvukovú lýzu sa vzorka sonikuje ultrazvukovým laboratórnym homogenizátorom, ako je UP100H, počas 8 cyklov pri 20% amplitúde, pre cykly každých 5 sekúnd zapnutých a 15 sekúnd vypnutých. Extrakcia proteínov sa vykonáva sonikáciou v cykloch (pulzačný režim) a umiestnením vzorky na ľad, aby sa zabránilo prehriatiu a tepelnej degradácii vzorky. Keďže sérum obsahuje veľké množstvo proteínov s vysokou molekulovou hmotnosťou (ako je albumín, α1-antitrypsín, transferín, haptoglobulín, imunoglobulín G a imunoglobulín A), ktoré interferujú s separáciou proteínov s nízkou molekulovou hmotnosťou počas IEF, odporúča sa ich vyčerpať zo séra pomocou depléčnej kolóny.
Extrakcia bielkovín z rastlinného tkaniva
Čerstvé, mäkké rastlinné tkanivo, napr. mach atď., možno ľahko narušiť jednoduchým umiestnením nasekaného vzorkového materiálu do lyzačného pufra na sonikáciu. Tvrdé, ligenózne rastlinné tkanivá, ako sú semená, jedľové ihličie atď., by mali byť mleté nasucho. Niektoré tvrdé drevité rastlinné materiály musia byť pred extrakciou sonikáciou zmrazené a rozomleté v tekutom dusíku. V prípade suspenzií rastlinných bunkových kultúr väčšinou postačuje ultrazvukové ošetrenie medzi 30 a 150 sekundami v lýznom pufri. Tvrdší materiál, ako sú tekvicové semienka, vyžaduje intenzívnejšiu sonikaciu, ako je opísané nižšie.
Protokol pre ultrazvukovú extrakciu albumínu z tekvicových semien
Na ultrazvukovú extrakciu proteínu albumínu z jemne mletého prášku z tekvicových semien sa do sklenenej kadičky s objemom 250 ml pridá 10 g odtučneného prášku z tekvicových semien a 100 ml deionizovanej vody ako rozpúšťadlo. Extrakcia proteínu pozostáva z dvoch krokov: Po prvé, vzorka sa sonikuje ultrazvukový ultrazvuk sondového typu UP400St (400W, 24kHz) vybavený sonotródou S24d7. Sklenená kadička sa počas ultrazvukovej homogenizácie umiestni do studeného vodného kúpeľa. Zásuvný snímač teploty a nastavenia regulácie teploty ultrazvuku UP400St zaisťujú, že teplota vzorky je vždy udržiavaná pod 30 °C. Presnou reguláciou teploty počas sonikácie sa zabráni denaturácii albumínu. Po druhé, extrakcia sa vykonávala mixérom pri otáčkach 200 ot./min a pri 30 °C. Potom sa kadička prenesie do termostatickej trepačky. Globulín sa odstraňuje dialýzou destilovanou vodou. Po odstránení globulínu sa môže odobrať vzorka proteínového extraktu na stanovenie albumínového profilu a následne sa upraví na pI=3,0 s použitím 0,1 M HCl na koaguláciu albumínu. Pevná fáza sa oddelí centrifugáciou pri 5000 g, 20 °C a znovu sa rozpustí v deionizovanej vode. Koagulácia albumínu sa vykonáva dvakrát, aby sa zvýšil pomer bielkovín v albumínovom koncentráte.
Ultrazvuková extrakcia alkalických proteínov na prípravu proteínového koncentrátu z ryžových otrúb ukazuje, že ultrazvukové ošetrenie vedie k vyššiemu výťažku bielkovín pri výrazne kratšom čase extrakcie – v porovnaní s konvenčnými metódami extrakcie.
Protokol o príprave vzoriek pre funkčný enzým iNOS
Na získanie plne funkčného enzýmu iNOS (napr. na skríning liekov) sa odporúča nasledujúci protokol: Bunková suspenzia by sa mala umiestniť na ľad a sonikovať UP100H pri amplitúde 10 μm v cyklickom režime 5 sekúnd sonikácie a 25 sekúnd odpočívať na ľade. Postup by sa mal opakovať cca. 3-krát. Čas odpočinku medzi sonikačnými cyklami znižuje nárast teploty, a preto znižuje riziko denaturácie.
ultrazvuková rozpustnosť proteínov
Sonikácia môže urýchliť proces solubilizácie bielkovín, ktorý zvyčajne vyžaduje niekoľko hodín. Aby sa vzorka neprehriala a zabránilo sa degradácii bielkovín a modifikáciám v roztokoch obsahujúcich močovinu, ultrazvukové výbuchy by nemali trvať dlhšie ako niekoľko sekúnd.
Ultrazvuk UP200Ht s 2 mm mikrošpičkou S26d2 na sonikáciu malých vzoriek.
Ultrazvukové zariadenie na extrakciu bielkovín
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka širokú škálu ultrazvukových homogenizátorov na rozpad buniek, tkanív, baktérií, mikroorganizmov, kvasiniek a spór.
Laboratórne ultrazvuky Hielscher sú výkonné a ľahko ovládateľné. Sú navrhnuté pre prevádzku 24 hodín denne, 7 dní v týždni a sú navrhnuté ako robustné a efektívne laboratórne a stolové zariadenia. Pre všetky zariadenia je možné presne regulovať energetický výkon a amplitúdu. Široká ponuka príslušenstva otvára ďalšie možnosti nastavenia. Digitálne ultrazvukové prístroje ako VialTweeter, UP200Ht, UP200St a UP400St majú integrovanú reguláciu teploty a vstavanú SD kartu pre automatické zaznamenávanie údajov.
Pre nepriamu, bez krížovej kontaminácie a súčasnú sonikaciu viacerých vzoriek ponúkame VialTweeter alebo ultrazvukový CupHorn.
Nasledujúca tabuľka poskytuje prehľad našich ultrazvukových prístrojov na prípravu vzoriek, narušenie buniek a extrakciu. Kliknutím na typ zariadenia získate ďalšie informácie o každom ultrazvukovom homogenizátore. Náš dobre vyškolený technický personál s dlhoročnými skúsenosťami vám rád pomôže s výberom najvhodnejšieho ultrazvuku pre prípravu vašich vzoriek!
| Objem dávky | Prietok | Odporúčané zariadenia |
|---|---|---|
| až 10 injekčných liekoviek alebo skúmaviek | N.A. | VialTweeter |
| Viacjamkové / mikrotitračné platne | N.A. | UIP400MTP |
| Viaceré rúrky / nádoby | N.A. | Cuphorn |
| 1 až 500 ml | 10 až 200 ml/min | UP100H |
| 10 až 1000 ml | 20 až 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min | UP400St |
V závislosti od vašej aplikácie, materiálu a objemu vzorky vám odporučíme najvhodnejšie nastavenie pre prípravu vzoriek. Kontaktujte nás ešte dnes!
Kontaktujte nás! / Opýtajte sa nás!
Digitálne ultrazvukové prístroje Hielscher sú vybavené diaľkovým ovládaním prehliadača a automatickým protokolovaním údajov na integrovanej SD karte.
VialTweeter na nepriamu sonikaciu.
Fakty, ktoré stoja za to vedieť
proteomika
Proteomika je oblasť výskumu, ktorá skúma proteíny a proteóm. Bielkoviny napĺňajú širokú škálu životne dôležitých funkcií v organizmoch. Proteóm je celý súbor proteínov exprimovaných genómom, bunkou, tkanivom alebo organizmom v určitom čase. Proteóm sa mení s časom a odlišnými požiadavkami alebo stresmi, ktorým bunka alebo organizmus podstupuje. Presnejšie povedané, je to súbor exprimovaných proteínov v danom type bunky alebo organizmu v danom čase za definovaných podmienok. Tento termín je zmesou bielkovín a genómu. Proteomika je štúdium proteómu.
bielkovina
Proteíny sú veľké biomolekuly, takzvané makromolekuly – ktoré sú zložené z jedného alebo viacerých dlhých reťazcov aminokyselinových zvyškov. Bielkoviny sú prítomné vo všetkých organizmoch rastlinného aj živočíšneho pôvodu a sú kľúčové pre väčšinu biologických funkcií. Keďže proteíny obsahujú veľa biologických informácií, extrahujú sa na analytické účely, napr. na proteomický výskum. Medzi najdôležitejšie funkcie, ktoré vykonávajú proteíny, patrí katalýza metabolických reakcií, replikácia DNA, reakcia na podnety a transport molekúl z jedného miesta na druhé. Proteíny sa od seba líšia predovšetkým sekvenciou aminokyselín, ktorá je diktovaná nukleotidovou sekvenciou ich génov a ktorá zvyčajne vedie k zloženiu proteínu do špecifickej trojrozmernej štruktúry, ktorá určuje jeho aktivitu. Bielkoviny sú – okrem peptidov – jedna z kľúčových zložiek jedla. Preto je proteomika mocným nástrojom v potravinárskej vede na optimalizáciu procesov, bezpečnosti potravín a hodnotenia výživy.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je predanalytický postup na separáciu a predbežnú koncentráciu analyzovaných látok. V kombinácii s ultrazvukom je možné zintenzívniť extrakciu bodu zákalu, čím sa proces stáva efektívnejším, rýchlejším a šetrnejším k životnému prostrediu. Pri ultrazvuku je extrakcia bodu zákalu podstatne efektívnejšou metódou prípravy analytu. Prečítajte si viac o ultrazvukom asistovanej extrakcii bodu zákalu!Gélová elektroforéza
Gélová elektroforéza je hlavnou metódou separácie a analýzy makromolekúl, ako sú DNA, RNA a proteíny, ako aj ich fragmentov, na základe ich veľkosti a náboja. Používa sa v klinickej chémii na oddelenie proteínov podľa náboja a/alebo veľkosti (IEF agaróza, v podstate nezávislá od veľkosti) a v biochémii, molekulárnej biológii a proteomike na oddelenie zmiešanej populácie fragmentov DNA a RNA podľa dĺžky, na odhad veľkosti fragmentov DNA a RNA alebo na oddelenie proteínov podľa náboja.
Bunkové kultúry
Bunková kultúra je kontrolovaný proces rastu, pri ktorom sa bunky kultivujú za kontrolovaných podmienok. Podmienky bunkovej kultúry sa líšia pre každý typ bunky. Vo všeobecnosti prostredie bunkovej kultúry pozostáva z vhodnej nádoby (napr. Petriho misky) so substrátom alebo médiom, ktoré dodáva základné živiny (aminokyseliny, sacharidy, vitamíny, minerály), rastové faktory, hormóny a plyny (CO2, O2) a reguluje fyzikálno-chemické prostredie (pH pufer, osmotický tlak, teplota). Väčšina buniek potrebuje povrchový alebo umelý substrát, zatiaľ čo iné bunkové kultúry je možné kultivovať voľne plávajúce v kultivačnom médiu (suspenzná kultúra, bunková suspenzia).
Masové kultúry živočíšnych bunkových línií sa používajú pri priemyselnej výrobe vírusových vakcín a iných biotechnologicky odvodených produktov. Ľudské kmeňové bunky sa kultivujú, aby sa rozšíril počet buniek a diferencovali bunky na rôzne typy somatických buniek na účely transplantácie.
Vzorky tkanív
Pojem tkanivo opisuje bunkový medziprodukt, kde bunkový materiál je na organizačnej úrovni medzi bunkami a celým orgánom. V tkanive sú zostavené podobné bunky rovnakého pôvodu, ktoré spolu vykonávajú špecifickú funkciu. Funkčným zoskupením viacerých tkanív sa vytvárajú zložité štruktúry orgánov.
Vzorky tkaniva sa odoberajú na výskum v biológii, histológii/histopatológii, parazitológii, biochémii, imunohistochémii, ako aj na kultiváciu a extrakciu DNA. Dá sa rozlíšiť medzi živočíšnym (podčlenenie: tkanivo cicavcov) a rastlinným tkanivom. Živočíšne tkanivá sú zoskupené do štyroch základných typov spojivového, svalového, nervového a epiteliálneho tkaniva. Rastlinné tkanivo sa delí na nasledujúce tri tkanivové systémy: epidermis, zemné tkanivo a cievne tkanivo.
Vzorky tkanív sa môžu pripraviť zo živočíšnych alebo rastlinných častí, napr. kostí, svalov, listov atď.
Telesné tekutiny
Krv, sérum, plazma, mozgovomiechový mok, sliny a synoviálna tekutina sú telesné tekutiny, ktoré sú skvelým zdrojom diagnosticky relevantných informácií. Preto je dôležitá sofistikovaná príprava vzoriek telesných tekutín na analýzu. Prvý problém je spojený so širokým dynamickým rozsahom zložiek prítomných v telesných tekutinách.
Stanovenie koncentrácie bielkovín
Bradfordov test, Lowryho test a test kyseliny bicinchoninovej (BCA) sú bežné testy na stanovenie koncentrácie proteínov. Hovädzí sérový albumín (BSA) je jedným z najčastejšie používaných bielkovinových štandardov.
Lyzačný pufer
Lyzačný pufr sa musí zvoliť v súlade s bunkovým materiálom alebo tkanivom (tkanivová kultúra, rastlina, baktérie, huby atď.) a podľa toho, či sú bunky v štruktúre a typu štruktúry. Široká škála lýznych pufrov na extrakciu bielkovín, membrán a organel je formulovaná s jedným alebo viacerými detergentmi. Prací prostriedok sa zvyčajne vyberá prostredníctvom testov pokus-omyl alebo – ak je k dispozícii – podľa existujúceho protokolu extrakcie bielkovín. Prací prostriedok musí byť kompatibilný so zdrojom tkaniva a bielkovinami. Vo všeobecnosti sa najjemnejší prací prostriedok, ktorý funguje na konkrétne tkanivo / proteín, vyberá tak, aby sa zachovala maximálna funkčnosť extraktu. Okrem toho v prípade extrakcie membrán a organel udržuje jemný čistiaci prostriedok membránu neporušenú. Bežne používané čistiace prostriedky v lýznych pufroch sú väčšinou neiónové alebo zwitterionové, napr. CHAPS, deoxycholát, Triton™ X-100, NP40 a Tween 20.
Napríklad tkanivá ako mozog, pečeň, črevá, obličky, slezina atď. môžu byť jednoducho pufrované pomocou RIPA – mali by sa však zahrnúť inhibítory proteázy a DTT (napr. na gélovú elektroforézu).
Lyzačný pufr pre tkanivo kostrového svalstva (ľadovo studený): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol doplnený kokteilom inhibítorov proteázy a fosfatázy
Tabuľka bežných pufrov a ich rozsah pH. Vo všeobecnosti sa tieto pufre bežne používajú v koncentráciách 20-50 mM.
| nárazník | Rozsah pH |
|---|---|
| Kyselina citrónová – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Citrát sodný – Kyselina citrónová | 3.0 – 6.2 |
| Octan sodný – kyselina octová | 3.6 – 5.6 |
| Sodná soľ kyseliny kakodylovej – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Dihydrogénfosforečnan sodný – hydrogenfosforečnan disodný | 5.8 – 8.0 |
| Imidazol – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| MOPY – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanolamín hydrochlorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Tetraboritan sodný – kyselina boritá | 7.6 – 9.2 |
| Bicín – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glycín – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Väčšina pufrov vykazuje závislosť pH od teploty. To platí najmä pre vyrovnávacie pamäte Tris. PKa sa mení z 8,06 pri 25 °C na 8,85 pri 0 °C.
(pH a pKa pufra: pH meria koncentráciu vodíkových iónov vo vodnom roztoku. pKa (= disociačná konštanta kyseliny) je príbuzné, ale špecifickejšie meradlo, pretože pomáha predpovedať, ako bude molekula pôsobiť pri špecifickej hodnote pH.)
TRIzol
TRIzol je chemický roztok používaný na extrakciu RNA/DNA/proteínu počas extrakcie guanidíniumtiokyanátu-fenol-chloroformu. Použitie ultrazvukom asistovanej extrakcie TRIzolu vedie k vysokým výťažkom DNA, RNA a proteínov z tej istej vzorky a vyniká tým inými extrakčnými metódami.
Literatúra/Referencie
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.