Hielscher Ultrazvukové technológie

Ultrazvuková extrakcia proteínov z tkanivových a bunkových kultúr

  • Extrakcia bielkovín je nevyhnutným krokom na prípravu vzorky proteomiky.
  • Bielkoviny môžu byť extrahované z rastlinných a živočíšnych tkanív, kvasiniek a mikroorganizmov.
  • Ultrazvukom je spoľahlivá, efektívna metóda extrakcie bielkovín dáva vysoký proteín výnosy v krátkom čase extrakcie.

 

Extrakcia bielkovín z tkanív a buniek

Extrakcia bielkovín z tkanív a kultivovaných buniek je základným prípravkom na prípravu vzoriek, ktorý sa vykonáva počas mnohých biochemických a analytických techník, ako je ELISA, PAGE, Západné blotu, hmotnostnej spektrometrie alebo čistenia bielkovín. Ultrazvukové prerušenia buniek, rozpadu a extrakcie je presne kontrolovateľné techniku na zabezpečenie vysokého výťažku bielkovín.

Extrakcia bielkovín zo živočíšnych tkanív

Na prípravu celého tkaniva (napr. obličky, srdce, pľúca, sval atď.), tkanivo by malo byť rozrezané na veľmi malé kúsky s čistými nástrojmi, na ľad prednostne, a čo najrýchlejšie, aby sa zabránilo degradácii proteáz (napr. Alebo hypotonický tlmivý roztok obsahujúci proteázu a inhibítor fosfatázy). Po rozrezaní sa vzorka ponorí do kvapalného dusíka na prichytenie. Vzorka sa môže skladovať pri teplote-80 ° c pre neskoršie použitie alebo byť keept na ľade pre okamžitú homogenizáciu. Bezprostredne pred ultrazvukovou extrakciou sa (s inhibítormi proteáz DTT, leupeptin a aprotinín) rýchlo pridá do vzorkovnej trubice (na ~ 10 mg tkaniva približne ~ 600 μL tlmivého roztoku). Približne 20-60mg tkaniva sa odporúča na vzorkovacia trubica.
Ultrazvuková homogenizácia, lýza a extrakcia sa vykonáva s ultrazvukovým homogenizérom, ako je UP200Ht alebo UP200St, vybavený mikro-tip sonotrode. Trvanie ultrazvukom je 60-90 sec. v ultrazvukovom cykle režime 15 sec. ultrazvukom a 10 sec. odpočinku. Vzorka by mala byť držaná v ľade po celú dobu.
Po ultrazvukovom homogenizácii/extrakcii sa lysát odstredí na 27 000 g cca 20 min. potom sa odoberí inkubovali tak, aby sa koncentrácia bielkovín mohla určiť bielkovinou, ako je napríklad test Pierce proteínu BCA.

Proteínový ultrazvukom je dôležitou metódou prípravy vzoriek

Ultrazvuková extrakcia proteínov z buniek s UP200St

Žiadosť o informácie





Extrakcia bielkovín z krvného séra

Pre homogénnu zmes séra a fosforečnanu, vzorka je najprv vortexovány pred ultrazvukovou bunkou rozpadu. Pre ultrazvukovú lýzu je vzorka sonicated s ultrazvukovým laboratórnemu homogenizérom, ako je UP100H 8 cyklov pri 20% amplitúdy, pre cykly každých 5 sekúnd a 15 sekúnd. Sonocation sa vykonáva sonicationg v cykloch a umiestnením vzorky na ľad tak, aby sa zabránilo prehriatiu a tepelnej degradácii vzorky. Keďže sérum obsahuje veľké množstvo proteínov s vysokou molekulovou hmotnosťou (ako je albumín, α1-antitrypsín, transferrin, haptoglobulín, imunoglobulín G a imunoglobulín a), ktoré narúšajú separáciu proteínov s nízkou molekulovou hmotnosťou počas IEF, je odporúča sa ich vyčerpať z séra pomocou kolóny odbúravania.

Extrakcia bielkovín z rastlinných tkanív

Čerstvé, mäkké rastlinné tkanivo, napríklad Moss atď., možno ľahko narušiť jednoduchým umiestnením nasekanej vzorky materiálu do tlmivého roztoku pre sonikáciu. Tvrdé, ligénne rastlinné tkanivá, ako sú semená, jedľa atď., by mali byť mleté suché. Niektoré tvrdé, drevnaté rastlinné materiály musia byť zmrazené a mleté v tekutom dusíku pred extrahovaním ultrazvukom. Pre suspenzie rastlinných bunkových kultúr je väčšinou dostatočná ultrazvuková liečba medzi 30 a 150 sekundami v tlmivom roztoku. Tvrdšie materiál, ako sú tekvicové semená vyžadujú intenzívnejšiu ultrazvukom, ako je popísané nižšie.

Protokol pre ultrazvukovú ťažbu albumínu z tekvicových semien

Ultrazvukový tkanivo homogenizátor UP400St s S24d40-pre ťažbu bielkovín z rastlinných a živočíšnych tkanív (kliknite pre zväčšenie!)Pre Ultrazvukový proteín extrakcie albumínu z jemného mletého tekvicového osiva prášok, 10 g odtučnený tekvicové semeno prášok a 100 mL deionizovanej vody ako rozpúšťadlo sa pridávajú do 250mL sklenenej kadičky. Extrakcia bielkovín pozostáva z dvoch krokov: po prvé, vzorka je sonicated s sondou typu ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) s namontovanej sonotrode S24d7. Sklenená Kadička je umiestnená v studenom vodnom kúpeli počas ultrazvukového homogenizácie. Nastavenie ultrasonicator UP400St s plugable teplotným snímačom zabezpečiť, aby sa teplota vzorky vždy udržala pod 30 ° c. Presným ovládaním teploty počas ultrazvukom sa zabráni denaturácii albumínu. Po druhé, extrakcia bola vykonaná s miešačkou pri rýchlosti 200 otáčok a pri 30 ° c. Potom sa kadička prenesie do termostatickej trepačke. Globulín sa odstráni cez dialýzu s destilovanou vodou. Po odstránení globulínu sa bielkovinový extrakt môže odobrať na stanovenie profilu albumínu a následne sa upraví na pI = 3,0 s použitím 0,1 M HCl na koaguláciu albumínu. Tuhá fáza sa oddelí odstregovaním pri 5000g, 20 ° c a rozpustenej v deionizovanej vode. Zrážka albumínu sa vykonáva dvakrát, aby sa zvýšil pomer bielkovín v koncentráte albumínu.

Ultrazvukový alkalické proteín extrakcie na prípravu proteínového koncentrátu z ryžových otrúb ukazuje, že ultrazvukové ošetrenie vedie k vyššiemu výnosu bielkovín v podstatne kratšom čase extrakcie – v porovnaní s konvenčnými metódami extrakcie.

Ultrazvukové zariadenie VialTweeter na extrakciu bielkovín z tkanív vzoriek (kliknite pre zväčšenie!)

VialTweeter pre nepriame ultrazvukom.

Výhody

  • Rýchle
  • vysoké výnosy
  • vysoko efektívny
  • Presná kontrola parametrov
  • Reprodukovateľné výsledky
  • Lineárna škálovateľnosť

Protokol na prípravu vzoriek pre funkčný enzým iNOS

Na získanie plne funkčného enzýmu iNOS (napr. pri skríningu lieku) sa odporúča nasledujúci protokol: suspenzia bunky by mala byť umiestnená na ľad a Sonikujte s UP100H na 10μm amplitúdy v cykle režime 5 sec. ultrazvukom a 25 sec. odpočinok na ľade. Postup sa opakuje približne 3-krát. Doba odpočinku medzi ultrazvukom cyklov znižuje nárast teploty, a preto sa zníži riziko denaturácie.

Ultrazvukový proteín Rozpustilization

Ultrazvukom môže urýchliť proteín rozpustilization proces, ktorý zvyčajne vyžaduje niekoľko hodín. Aby nedošlo k prehriatiu vzorky a zabrániť degradácii bielkovín a modifikáciám v riešeniach obsahujúcich močovinu, ultrazvukové výbuchy by nemali trvať dlhšie ako niekoľko sekúnd.

Všeobecné pokyny

Regulácia teploty: Na zabezpečenie vysokého výťažku bielkovín bez tepelnej denaturácie musí byť teplota počas extrakcie kontrolovaná. Hielscher je stav-of-Art ultrazvukové homogenizers – tiež volal Ultrazvukový desintegrátorem alebo sonificator – sú presne kontrolovateľné. Dodávajú sa s plugable teplotný senzor. V možnosti nastavenia Ultrazvukový homogenizér, môže byť nastavená maximálna teplota. Keď sa dosiahne táto teplota max, ultrasonicator automaticky zastaví, kým sa vzorka ochladí.
Medzipamäte: Voľba vhodného tlmivého roztoku a správny objem tlmivého roztoku sa líši od tkaniva k tkanivu a musí sa vykonať skúškou pokusov a omylov.
Izolácia/čistenie: Bielkovinové lyzáty môžu obsahovať prebytok biomolekúl, ako sú DNA alebo sacharidy, ktoré môžu byť odstránené bielkovinami zrážkami (deoxycholát-trichlóroctová kyselina) alebo výmena medzipamäte.

Chittapalo a Noomhorm (2009) hlásené, že proteín výnos zvýšil pomocou ultrazvukom a že ultrazvukové tkanivo homogenizácia a rozpadu proces môže zvýšiť existujúce extrakčné procesy výrazne – nových komerčných ťažobné príležitosti.

Ochrana zvuku s zvukovým krytom Hielscher SPB-L a ultrazvukovým zariadením UP200St. (Kliknite pre zväčšenie!)

Ultrazvukový tkanivové homogenizátor UP200St pre efektívnu extrakciu bielkovín

Presná kontrola ultrazvukovej liečby (kliknite pre zväčšenie!)

Ovládanie prehliadača pre presnú prevádzku a monitorovanie procesu ultrazvukom

Ultrazvukové zariadenia pre ťažbu bielkovín

Hielscher ultrazvukom ponúkajú širokú škálu ultrazvukových homogenizers pre rozpad buniek, tkanív, baktérií, mikroorganizmov, kvasiniek a spóry.
Hielscher laboratórne ultrasonicators sú výkonné a ľahko ovládateľný. Postavené pre 24/7 prevádzku, sú navrhnuté ako robustné a efektívne laboratórne a lavica-top zariadenia. Pre všetky zariadenia je možné presne regulovať energetický výkon a amplitúdu. Široká škála príslušenstvo Otvorí ďalšie možnosti nastavenia. Digitálne zariadenia, ako sú VialTweeter, UP200Ht, UP200St, a UP400St majú integrovanú reguláciu teploty a vstavanú SD kartu na automatické zaznamenávanie údajov.
V prípade nepriamej, krížovej kontaminácie a súčasnej ultrazvukom viacnásobných vzoriek ponúkame VialTweeter alebo Ultrazvukový CupHorn,
V závislosti od vašej aplikácie, materiálu a objemu vzorky vám odporúčame najvhodnejšie nastavenie pre vzorku prípravka. Kontaktujte nás ešte dnes!

Kontaktuj nás! / Opýtajte sa nás!

Ak chcete požiadať o dodatočné informácie o homogenizácii ultrazvukom, použite nižšie uvedený formulár. Radi Vám ponúkame ultrazvukový systém spĺňajúci Vaše požiadavky.









Vezmite prosím na vedomie naše Zásady ochrany osobných údajov,


Literatúra / Referencie

  • Chittapalo T, noomhorm a (2009): Ultrazvukový asistovanej alkalickej extrakcii bielkovín z odtučnenom ryžové otruby a vlastnosti proteínových koncentrátov. Int J Food sci technol 44:1843 – 1849.
  • Simões, André E. S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D ' Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): účinné zotavenie proteínov z viacerých zdrojových vzoriek po extrakcii trizol alebo trizol LS RNA a dlhodobého skladovania. BMC genomika 2013, 14:181.


Fakty stojí za to vedieť

Proteomiky

Proteomika je výskumné pole, ktoré skúma proteíny a proteóm. Proteíny fullfile obrovské množstvo životne dôležitých funkcií v organizmoch. Proteóm je celá sada proteínov vyjadrená genómom, bunkou, tkanivom alebo organizmom v určitom čase. Proteóm sa líši v závislosti od času a odlišných požiadaviek, alebo zdôrazňuje, že bunka alebo organizmus prechádza. Presnejšie povedané, je to súbor vyjadrených bielkovín v danom type bunky alebo organizmu, v danom čase za definovaných podmienok. Termín je zmes bielkovín a genómu. Proteomika je štúdia proteómu.

Bielkovín

Proteíny sú veľké Biomolecules, takzvané makromolekuly – ktoré sú zložené z jedného alebo viacerých dlhých reťazcov rezíduí aminokyselín. Bielkoviny sú prítomné vo všetkých organizmoch vegetálneho aj živočíšneho pôvodu a sú rozhodujúce pre väčšinu biologických funkcií. Keďže bielkoviny obsahujú množstvo biologických informácií, sú extrahované na analytické účely, napríklad na proteomický výskum. Najdôležitejšou funkciou, ktorú vykonávajú bielkoviny, sú katalýza metabolických reakcií, replikácia DNA, reakcia na podnety a preprava molekúl z jedného miesta na druhé. Bielkoviny sa líšia od seba predovšetkým v ich sekvencii aminokyselín, ktorý je diktovaný nukleotide sekvencie ich génov, a ktoré zvyčajne vedie k proteín skladanie do konkrétnej trojrozmerný štruktúru, ktorá určuje jeho činnosť. Bielkoviny sú – Okrem peptidov – jednou z kľúčových zložiek potravín. Preto je proteomika silným nástrojom v oblasti potravinárovej vedy na optimalizáciu procesov, bezpečnosti potravín a nutričného hodnotenia.

Gél elektroforéza

Gélová elektroforéza je hlavnou metódou separácie a analýzy makromolekúl, ako je DNA, RNA a bielkovín, ako aj ich fragmenty, na základe ich veľkosti a nabitia. Používa sa v klinickej chémii na oddeľovanie bielkovín podľa poplatku a/alebo veľkosti (IEF agarose, v podstate nezávislá od veľkosti) a biochémie, molekulárnej biológie a proteomiky na oddelenie zmiešanej populácie fragmentov DNA a RNA podľa dĺžky, na odhad veľkosti DNA a RNA fragmentov alebo oddeliť proteíny.

Bunkové kultúry

Bunková kultúra je riadený rastúci proces, ktorým sa bunky pestujú za kontrolovaných podmienok. Podmienky bunkovej kultúry sa líšia pre každý typ bunky. Všeobecne platí, že prostredie bunkovej kultúry pozostáva z vhodného plavidla (napr. Petriho misky) so substrátom alebo médiom, ktoré dodáva základné živiny (aminokyseliny, sacharidy, vitamíny, minerály), rastové faktory, hormóny a plyny (CO2O2), a reguluje fyzikálno-chemické prostredie (pH buffer, osmotický tlak, teplota). Väčšina buniek potrebuje povrch alebo umelý substrát, zatiaľ čo iné bunkové kultúry môžu byť pestované voľne plávajúce v kultivačné médium (pozastavenie kultúry, bunkovej suspenzie).
Masové kultúry živočíšnych bunkových línií sa používajú pri priemyselnej výrobe vírusových vakcín a iných biotechnologicky odvodených produktov. Ľudské kmeňové bunky sú kultivované na rozšírenie počtu buniek a odlíšenie buniek do rôznych typov somatických buniek na účely transplantácie.

Vzorky tkanív

Termín tkanivo opisuje bunkový medziprodukt, kde je bunka materiál na organizačnej úrovni medzi bunkami a kompletného orgánu. V tkanive, podobné bunky, z rovnakého pôvodu, ktoré spoločne vykonávajú špecifickú funkciu, sú zostavené. Funkčnou zoskupením viacerých tkanív sa vytvárajú komplexné štruktúry orgánov.
Tkanivo sa odoberajú na výskum v oblasti biológie, histológie/histopatológie, parazitológie, biochémie, imunohistochémie, ako aj na kultiváciu a extrakciu DNA. To môže byť odlíšené medzi zvieraťom (delenie: cicavce tkanivo) a rastlinné tkanivo. Živočíšne tkanivá sú zoskupené do štyroch základných typov spojivového, svalového, nervového a epiteliálneho tkaniva. Rastlinné tkanivo je rozdelená do nasledujúcich troch tkanivových systémov: epidermis, pozemné tkanivo, a cievne tkanivo.
Vzorky tkanív sa môžu pripravovať zo živočíšnych alebo rastlinných častí, napríklad z kostí, svalov, listov atď.

Telesné tekutiny

Krv, sérum, plazma, cerebrospinálna tekutina, sliny a synoviálnej tekutiny sú telesné tekutiny, ktoré ponúkajú veľký zdroj diagnosticky relevantných informácií. Preto je dôležitá sofistikovaná príprava vzoriek telesných tekutín na analýzu. Prvá obtiažnosť je spojená so širokým dynamickým rozsahom zložiek prítomných v telesných tekutinách.

Stanovenie koncentrácie bielkovín

Bradford test, Lowry test a kyselina bicinchontínová (BCA) skúška sú spoločné testy na určenie koncentrácie bielkovín. Hovädzí sérový albumín (BSA) je jedným z najčastejšie používaných proteínových štandardov.

Medzipamäť rozpadu

Tlmivý roztok sa musí vybrat v súlade s bunkovou surovinou alebo tkanivom (tkanivová kultúra, rastlina, baktérie, huby atď.) a či sú bunky v štruktúre a typu konštrukcie. Široká škála tlmivých vankúšov na extrakciu proteínov, membrán a organely sú formulované s jedným alebo viacerými čistiacimi prostriedkami. Čistiaci prostriedok sa zvyčajne vyberie pomocou skúšok a chýb – Ak je k dispozícii – podľa existujúceho protokolu extrakcie bielkovín. Čistiaci prostriedok musí byť kompatibilný so zdrojom tkaniva a bielkovinami. Vo všeobecnosti je vybraný najmiernejší čistiaci prostriedok, ktorý pracuje pre špecifickú tkanivovú/bielkovinu, aby sa zachovala Maximálna funkčnosť extraktu. Okrem toho, v prípade extrakcie membrán a organely, jemný čistiaci prostriedok udržiava membrány neporušené. Bežne používané detergenty v tlmivých nárazoch sú väčšinou neiónové alebo zwitterionic, napríklad CHAPS, deoxycholát, Triton™ X-100, NP40, a Tween 20.
Napríklad, tkanivá, ako je mozog, pečeň, črevo, obličky, slezina atď môže byť jednoducho pufrovaným s Ripa – mali by sa však zahrnúť inhibítory proteázy a DTT (napr. na gélové elektroforéza).
Tlmivý roztok pre kostrové svalové tkanivo (ľadovo studený): 20 mM tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2% Triton X-100, 10% (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiothreitol doplnený proteázou a inhibítorom fosfatázy koktail
Tabuľka spoločných nárazníkov a ich rozsah pH. Vo všeobecnosti sa tieto nárazníky bežne používajú pri koncentráciách 20-50 mM.

Medzipamäte rozsah pH
Kyselina citrónová – Naoh 2,2 – 6,5
Citrónan sodný – Kyselina citrónová 3,0 – 6,2
Octan sodný – kyselina octová 3,6 – 5,6
Kyselina cacodylic sodná soľ – Hcl 5,0 – 7,4
Mes – Naoh 5,6 – 6,8
Dihydrogenfosforečnan sodný – Hydrogenfosforečnan sodný 5,8 – 8,0
Imidazolu – Hcl 6,2 – 7,8
Mopy – Koh 6,6 – 7,8
Trietanolamín hydrochlorid – Naoh 6,8 – 8,8
Tris – Hcl 7,0 – 9,0
HEPESOVHO – Naoh 7,2 – 8,2
Tricine – Naoh 7,6 – 8,6
Tetraborát sodný – kyselina boritej 7,6 – 9,2
Bicine – Naoh 7,7 – 8,9
Glycine – Naoh 8,6 – 10,6

Väčšina nárazníkov ukazuje pH-závislosť s teplotou. Platí to najmä pre nárazníky tris. PKa sa mení z 8,06 pri teplote 25 ° c na 8,85 pri 0 ° c.
(pH a pKa medzipamäte: pH meria koncentráciu vodíkových iónov vo vodnom roztoku. pKa (= kyselina disociácia konštanta) je príbuzný, ale konkrétnejšie opatrenia, v tom, že pomáha predpovedať, ako molekula bude pôsobiť na konkrétnu hodnotu pH.)

TRIzol

TRIzol je chemický roztok, ktorý sa používa na extrakciu RNA/DNA/proteínu počas extrakcie guanidinium tiokyanátu-fenolu-chloroformu. Použitie Rozpúšťadle pomáha TRIzol extrakcie výsledky vo vysokej DNA, RNA, a proteín výnosy z rovnakej vzorky a vyniká tým ďalšie metódy extrakcie.