Ultrazvuková extrakcia proteínov z tkanivových a bunkových kultúr

  • Extrakcia bielkovín je nevyhnutným krokom na prípravu vzorky proteomiky.
  • Bielkoviny môžu byť extrahované z rastlinných a živočíšnych tkanív, kvasiniek a mikroorganizmov.
  • Ultrazvukom je spoľahlivá, efektívna metóda extrakcie bielkovín dáva vysoký proteín výnosy v krátkom čase extrakcie.

Extrakcia bielkovín z tkanív a buniek

Extrakcia proteínov z tkanív a kultivovaných buniek je základným krokom prípravy vzorky, ktorý sa vykonáva počas mnohých biochemických a analytických techník, ako sú ELISA, PAGE, Western blotting, hmotnostná spektrometria alebo čistenie proteínov. Ultrazvukové bunkové narušenie, lýza a extrakcia je presne kontrolovateľná, netepelná technika na zabezpečenie vysokých výnosov proteínov.

Žiadosť o informácie





Ultrasonicators typu sondy, ako je UP200St sú spoľahlivé tkanivové homogenizátory a široko používané na prípravu vzoriek v genetickom a proteomickom výskume.

Extrakcia proteínov z buniek pomocou ultrazvuková sonda UP200St

Výhody ultrazvukovej lýzy a extrakcie proteínov
 

  • Rýchle
  • vysoké výnosy
  • vysoko efektívny
  • Presná kontrola parametrov
  • Reprodukovateľné výsledky
  • Lineárna škálovateľnosť

Všeobecné pokyny pre ultrazvukovú lýzu a extrakciu proteínov

  • Regulácia teploty: Na zabezpečenie vysokého výťažku bielkovín bez tepelnej denaturácie musí byť teplota počas extrakcie kontrolovaná. Hielscher je stav-of-Art ultrazvukové homogenizers – Tiež nazývaný ultrazvukový dezintegrátor alebo ultrasonifikátor – sú presne kontrolovateľné. Dodávajú sa s plugable teplotný senzor. V možnosti nastavenia Ultrazvukový homogenizér, môže byť nastavená maximálna teplota. Keď sa dosiahne táto teplota max, ultrasonicator automaticky zastaví, kým sa vzorka ochladí.
  • Medzipamäte: Voľba vhodného tlmivého roztoku a správny objem tlmivého roztoku sa líši od tkaniva k tkanivu a musí sa vykonať skúškou pokusov a omylov.
  • Izolácia/čistenie: Bielkovinové lyzáty môžu obsahovať prebytok biomolekúl, ako sú DNA alebo sacharidy, ktoré môžu byť odstránené bielkovinami zrážkami (deoxycholát-trichlóroctová kyselina) alebo výmena medzipamäte.

Chittapalo a Noomhorm (2009) uviedli vo svojej štúdii, že výťažok proteínov sa zvýšil pomocou ultrazvukom a že ultrazvuková tkanivová homogenizácia a lýza proces môže významne zvýšiť existujúce extrakčné procesy – nových komerčných ťažobné príležitosti.
 

Ultrazvukový CupHorn pre súčasnú prípravu vzoriek viacerých vzoriek za rovnakých podmienok na izoláciu proteínov a fragmentáciu DNA.

Ultrazvukový CupHorn na súčasnú, vysoko účinnú prípravu vzoriek z viacerých vzoriek za rovnakých podmienok na izoláciu proteínov a fragmentáciu DNA.

Extrakcia bielkovín zo živočíšnych tkanív

Ultrasonicator UP100H je laboratórny homogenizátor, ktorý sa často používa na prípravu vzoriek dosiek bunkových kultúr.Na prípravu celého tkaniva (napr. obličky, srdce, pľúca, sval atď.), tkanivo by malo byť rozrezané na veľmi malé kúsky s čistými nástrojmi, na ľad prednostne, a čo najrýchlejšie, aby sa zabránilo degradácii proteáz (napr. Alebo hypotonický tlmivý roztok obsahujúci proteázu a inhibítor fosfatázy). Po rozrezaní sa vzorka ponorí do kvapalného dusíka na prichytenie. Vzorka sa môže skladovať pri teplote-80 ° c pre neskoršie použitie alebo byť keept na ľade pre okamžitú homogenizáciu. Bezprostredne pred ultrazvukovou extrakciou sa (s inhibítormi proteáz DTT, leupeptin a aprotinín) rýchlo pridá do vzorkovnej trubice (na ~ 10 mg tkaniva približne ~ 600 μL tlmivého roztoku). Približne 20-60mg tkaniva sa odporúča na vzorkovacia trubica.
Ultrazvuková homogenizácia, lýza a extrakcia sa vykonáva ultrazvukovým homogenizátorom, ako je UP100H alebo UP200Ht, vybavený mikro-hrotom sonotródy. Trvanie ultrazvukom je 60-90 sekúnd. v režime ultrazvukového cyklu 15 sek. ultrazvukom a 10 sekúnd. čas odpočinku. Vzorka by sa mala uchovávať v ľade po celú dobu.
Po ultrazvukovom homogenizácii/extrakcii sa lysát odstredí na 27 000 g cca 20 min. potom sa odoberí inkubovali tak, aby sa koncentrácia bielkovín mohla určiť bielkovinou, ako je napríklad test Pierce proteínu BCA.

Extrakcia bielkovín z krvného séra

Pre homogénnu zmes séra a fosfátového tlmivého roztoku sa vzorka najprv vyvíri pred lýzou ultrazvukových buniek. Pre ultrazvukovú lýzu je vzorka sonikovaná ultrazvukovým laboratórnym homogenizátorom, ako je UP100H pre 8 cyklov s 20% amplitúdou, pre cykly každých 5 sekúnd zapnuté a 15 sekúnd vypnuté. Extrakcia proteínov sa uskutočňuje ultrazvukom v cykloch (pulzačný režim) a umiestnením vzorky na ľad tak, aby sa zabránilo prehriatiu a tepelnej degradácii vzorky. Keďže sérum obsahuje veľké množstvo proteínov s vysokou molekulovou hmotnosťou (ako je albumín, α1-antitrypsín, transferín, haptoglobulín, imunoglobulín G a imunoglobulín A), ktoré interferujú so separáciou proteínov s nízkou molekulovou hmotnosťou počas IEF, odporúča sa ich vyčerpať zo séra pomocou vypínacej kolóny.

Extrakcia bielkovín z rastlinných tkanív

Čerstvé, mäkké rastlinné tkanivo, napríklad Moss atď., možno ľahko narušiť jednoduchým umiestnením nasekanej vzorky materiálu do tlmivého roztoku pre sonikáciu. Tvrdé, ligénne rastlinné tkanivá, ako sú semená, jedľa atď., by mali byť mleté suché. Niektoré tvrdé, drevnaté rastlinné materiály musia byť zmrazené a mleté v tekutom dusíku pred extrahovaním ultrazvukom. Pre suspenzie rastlinných bunkových kultúr je väčšinou dostatočná ultrazvuková liečba medzi 30 a 150 sekundami v tlmivom roztoku. Tvrdšie materiál, ako sú tekvicové semená vyžadujú intenzívnejšiu ultrazvukom, ako je popísané nižšie.
 

Tento návod vysvetľuje, aký typ ultrazvukom je najlepší pre vaše úlohy prípravy vzoriek, ako je lýza, narušenie buniek, izolácia proteínov, fragmentácia DNA a RNA v laboratóriách, analýza a výskum. Vyberte si ideálny typ ultrazvukom pre vašu aplikáciu, objem vzorky, počet vzoriek a priepustnosť. Hielscher Ultrasonics má ideálny ultrazvukový homogenizátor pre vás!

Ako nájsť perfektný sonikátor pre narušenie buniek a extrakciu bielkovín vo vede a analýze

Miniatúra videa

 

Protokol pre ultrazvukovú ťažbu albumínu z tekvicových semien

Ultrazvukový tkanivo homogenizátor UP400St s S24d40-pre ťažbu bielkovín z rastlinných a živočíšnych tkanív (kliknite pre zväčšenie!)Na ultrazvukovú extrakciu proteínu albumínu z jemne mletého prášku tekvicových semien sa do 250 ml sklenenej kadičky pridá 10 g odtučneného prášku z tekvicových semien a 100 ml deionizovanej vody ako rozpúšťadla. Extrakcia proteínov pozostáva z dvoch krokov: Po prvé, vzorka je sonikovaná s sondový ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) vybavený sonotrode S24d7. Sklenená kadička sa počas ultrazvukovej homogenizácie umiestni do studeného vodného kúpeľa. Pripojiteľný snímač teploty a nastavenia regulácie teploty ultrasonicator UP400St zabezpečujú, že teplota vzorky je vždy udržiavaná pod 30 ° C. Presnou reguláciou teploty počas ultrazvukom sa zabráni denaturácii albumínu. Po druhé, extrakcia sa uskutočnila miešačkou pri otáčkach 200 ot / min a pri 30 ° C. Potom sa kadička prenesie do termostatickej trepačky. Globulín sa odstráni dialýzou s destilovanou vodou. Po odstránení globulínu sa proteínový extrakt môže odobrať na stanovenie albumínového profilu a následne sa upraví na pI = 3,0 použitím 0,1 M HCl na koaguláciu albumínu. Tuhá fáza sa oddelí centrifugáciou pri 5000 g, 20 °C a znovu sa rozpustí v deionizovanej vode. Koagulácia albumínu sa uskutočňuje dvakrát, aby sa zvýšil pomer bielkovín v koncentráte albumínu.

Ultrazvukový alkalické proteín extrakcie na prípravu proteínového koncentrátu z ryžových otrúb ukazuje, že ultrazvukové ošetrenie vedie k vyššiemu výnosu bielkovín v podstatne kratšom čase extrakcie – v porovnaní s konvenčnými metódami extrakcie.

Tento videoklip ukazuje Hielscher ultrazvukový homogenizátor UP100H, ultrazvukom široko používaný na prípravu vzoriek v laboratóriách.

Ultrazvukový homogenizátor UP100H

Miniatúra videa

Protokol na prípravu vzoriek pre funkčný enzým iNOS

Na získanie plne funkčného enzýmu iNOS (napr. na skríning liekov) sa odporúča nasledujúci protokol: Bunková suspenzia by mala byť umiestnená na ľade a je sonikovaná s UP100H pri amplitúde 10 μm v režime cyklu 5 sek. ultrazvukom a 25 sekúnd. odpočívať na ľade. Postup by sa mal opakovať cca. 3 krát. Doba odpočinku medzi cyklami ultrazvukom znižuje zvýšenie teploty, a preto zníži riziko denaturácie.

Ultrazvukový proteín Rozpustilization

Ultrazvukom môže urýchliť proteín rozpustilization proces, ktorý zvyčajne vyžaduje niekoľko hodín. Aby nedošlo k prehriatiu vzorky a zabrániť degradácii bielkovín a modifikáciám v riešeniach obsahujúcich močovinu, ultrazvukové výbuchy by nemali trvať dlhšie ako niekoľko sekúnd.

VialTweeter je unikátny Ultrazvukový systém pre simultánne ultrazvukom až 10 injekčných liekoviek za presne rovnakých podmienok bez krížovej kontaminácie.

UP200St s VialTweeter na Sonikáciu uzavretých injekčných liekoviek

Miniatúra videa

Ultrasonicator UP200Ht s mikrotipom S26d2 pre ultrazvukovú lýzu biologických vzoriek

Ultrasonicator UP200Ht s 2mm mikrotipom S26d2 pre ultrazvukom malých vzoriek.

Ultrazvukové zariadenia pre ťažbu bielkovín

Hielscher ultrazvukom ponúkajú širokú škálu ultrazvukových homogenizers pre rozpad buniek, tkanív, baktérií, mikroorganizmov, kvasiniek a spóry.
Hielscher laboratórne ultrasonicators sú výkonné a ľahko ovládateľné. Sú skonštruované pre prevádzku 24 hodín denne, 7 dní v týždni a sú navrhnuté ako robustné a efektívne laboratórne a stolové zariadenia. Pre všetky zariadenia je možné presne regulovať energetický výstup a amplitúdu. Široká škála príslušenstva otvára ďalšie možnosti nastavenia. Digitálne ultrazvukové prístroje ako VialTweeter, UP200Ht, UP200St a UP400St majú integrovanú reguláciu teploty a vstavanú kartu SD pre automatické zaznamenávanie údajov.
Pre nepriamu, krížovú kontamináciu bez krížovej kontaminácie a súčasnú ultrazvukom viacerých vzoriek ponúkame VialTweeter alebo ultrazvukový CupHorn.
Nižšie uvedená tabuľka vám poskytuje prehľad o našich ultrasonicators pre prípravu vzoriek, prerušenie buniek a extrakciu. Kliknutím na typ zariadenia získate viac informácií o každom ultrazvukovom homogenizátore. Náš dobre vyškolený a dlhoročné skúsenosti technický personál vám rád pomôže pri výbere najvhodnejšieho ultrasonicator pre vašu prípravu vzoriek!
 

Objem šarže prietok Odporúčané Devices
až 10 injekčných liekoviek alebo skúmaviek neuv VialTweeter
multiwell / mikrotiterové platne neuv UIP400MTP (UIP400MTP)
viac rúrok / nádob neuv CupHorn
1 až 500mL 10 až 200mL/min UP100H
10 až 1000 ml 20 až 200 ml/min UP200Ht, UP200St
10 až 2000mL 20 až 400mL/min UP400St

V závislosti od vašej aplikácie, materiálu a objemu vzorky vám odporúčame najvhodnejšie nastavenie pre vzorku prípravka. Kontaktujte nás ešte dnes!

Kontaktuj nás! / Opýtajte sa nás!

Požiadajte o ďalšie informácie

Použite nižšie uvedený formulár a požiadajte o ďalšie informácie o ultrazvukových homogenizátoroch, aplikáciách v biotechnológii a proteomike, ako aj o cenách. Radi s vami prediskutujeme vaše bunkové narušenie a proces extrakcie bielkovín a ponúkneme vám ultrasonicator spĺňajúci vaše požiadavky!









Vezmite prosím na vedomie naše Zásady ochrany osobných údajov,


 

Video ukazuje ultrazvukový systém prípravy vzoriek UIP400MTP, ktorý umožňuje spoľahlivú prípravu vzoriek akýchkoľvek štandardných multi-well dosiek pomocou ultrazvuku s vysokou intenzitou. Typické aplikácie UIP400MTP zahŕňajú bunkovú lýzu, DNA, RNA a strihanie chromatínu, ako aj extrakciu bielkovín.

Ultrasonicator UIP400MTP pre multi-well dosky ultrazvukom

Miniatúra videa

Hielscher ultrasonicators môžu byť diaľkovo ovládané prostredníctvom ovládania prehliadača. Parametre ultrazvukom je možné monitorovať a presne prispôsobiť požiadavkám procesu.

Hielscher digitálne ultrasonicators majú prehliadač diaľkové ovládanie a automatické protokolovanie údajov na integrovanej SD karte.

Ultrazvukové zariadenie VialTweeter na extrakciu bielkovín z tkanív vzoriek (kliknite pre zväčšenie!)

VialTweeter pre nepriame ultrazvukom.



Fakty stojí za to vedieť

Proteomiky

Proteomika je výskumné pole, ktoré skúma proteíny a proteóm. Proteíny fullfile obrovské množstvo životne dôležitých funkcií v organizmoch. Proteóm je celá sada proteínov vyjadrená genómom, bunkou, tkanivom alebo organizmom v určitom čase. Proteóm sa líši v závislosti od času a odlišných požiadaviek, alebo zdôrazňuje, že bunka alebo organizmus prechádza. Presnejšie povedané, je to súbor vyjadrených bielkovín v danom type bunky alebo organizmu, v danom čase za definovaných podmienok. Termín je zmes bielkovín a genómu. Proteomika je štúdia proteómu.

Bielkovín

Proteíny sú veľké Biomolecules, takzvané makromolekuly – ktoré sú zložené z jedného alebo viacerých dlhých reťazcov rezíduí aminokyselín. Bielkoviny sú prítomné vo všetkých organizmoch vegetálneho aj živočíšneho pôvodu a sú rozhodujúce pre väčšinu biologických funkcií. Keďže bielkoviny obsahujú množstvo biologických informácií, sú extrahované na analytické účely, napríklad na proteomický výskum. Najdôležitejšou funkciou, ktorú vykonávajú bielkoviny, sú katalýza metabolických reakcií, replikácia DNA, reakcia na podnety a preprava molekúl z jedného miesta na druhé. Bielkoviny sa líšia od seba predovšetkým v ich sekvencii aminokyselín, ktorý je diktovaný nukleotide sekvencie ich génov, a ktoré zvyčajne vedie k proteín skladanie do konkrétnej trojrozmerný štruktúru, ktorá určuje jeho činnosť. Bielkoviny sú – Okrem peptidov – jednou z kľúčových zložiek potravín. Preto je proteomika silným nástrojom v oblasti potravinárovej vedy na optimalizáciu procesov, bezpečnosti potravín a nutričného hodnotenia.

Cloud Point Extraction

Cloud Point Extraction je predanalytický postup na separáciu a predbežnú koncentráciu analyzovaných látok. V kombinácii s ultrazvukom, extrakcia cloudových bodov môže byť zintenzívnená, čím sa proces stáva efektívnejším, rýchlejším a šetrnejším k životnému prostrediu. Pri ultrazvukom je extrakcia cloudových bodov výrazne efektívnejšou metódou prípravy analytu. Prečítajte si viac o ultrazvukovo asistovanej extrakcii bodov cloudu!

Gél elektroforéza

Gélová elektroforéza je hlavnou metódou separácie a analýzy makromolekúl, ako je DNA, RNA a bielkovín, ako aj ich fragmenty, na základe ich veľkosti a nabitia. Používa sa v klinickej chémii na oddeľovanie bielkovín podľa poplatku a/alebo veľkosti (IEF agarose, v podstate nezávislá od veľkosti) a biochémie, molekulárnej biológie a proteomiky na oddelenie zmiešanej populácie fragmentov DNA a RNA podľa dĺžky, na odhad veľkosti DNA a RNA fragmentov alebo oddeliť proteíny.

Bunkové kultúry

Bunková kultúra je riadený rastúci proces, ktorým sa bunky pestujú za kontrolovaných podmienok. Podmienky bunkovej kultúry sa líšia pre každý typ bunky. Všeobecne platí, že prostredie bunkovej kultúry pozostáva z vhodného plavidla (napr. Petriho misky) so substrátom alebo médiom, ktoré dodáva základné živiny (aminokyseliny, sacharidy, vitamíny, minerály), rastové faktory, hormóny a plyny (CO2O2), a reguluje fyzikálno-chemické prostredie (pH buffer, osmotický tlak, teplota). Väčšina buniek potrebuje povrch alebo umelý substrát, zatiaľ čo iné bunkové kultúry môžu byť pestované voľne plávajúce v kultivačné médium (pozastavenie kultúry, bunkovej suspenzie).
Masové kultúry živočíšnych bunkových línií sa používajú pri priemyselnej výrobe vírusových vakcín a iných biotechnologicky odvodených produktov. Ľudské kmeňové bunky sú kultivované na rozšírenie počtu buniek a odlíšenie buniek do rôznych typov somatických buniek na účely transplantácie.

Vzorky tkanív

Termín tkanivo opisuje bunkový medziprodukt, kde je bunka materiál na organizačnej úrovni medzi bunkami a kompletného orgánu. V tkanive, podobné bunky, z rovnakého pôvodu, ktoré spoločne vykonávajú špecifickú funkciu, sú zostavené. Funkčnou zoskupením viacerých tkanív sa vytvárajú komplexné štruktúry orgánov.
Tkanivo sa odoberajú na výskum v oblasti biológie, histológie/histopatológie, parazitológie, biochémie, imunohistochémie, ako aj na kultiváciu a extrakciu DNA. To môže byť odlíšené medzi zvieraťom (delenie: cicavce tkanivo) a rastlinné tkanivo. Živočíšne tkanivá sú zoskupené do štyroch základných typov spojivového, svalového, nervového a epiteliálneho tkaniva. Rastlinné tkanivo je rozdelená do nasledujúcich troch tkanivových systémov: epidermis, pozemné tkanivo, a cievne tkanivo.
Vzorky tkanív sa môžu pripravovať zo živočíšnych alebo rastlinných častí, napríklad z kostí, svalov, listov atď.

Telesné tekutiny

Krv, sérum, plazma, cerebrospinálna tekutina, sliny a synoviálnej tekutiny sú telesné tekutiny, ktoré ponúkajú veľký zdroj diagnosticky relevantných informácií. Preto je dôležitá sofistikovaná príprava vzoriek telesných tekutín na analýzu. Prvá obtiažnosť je spojená so širokým dynamickým rozsahom zložiek prítomných v telesných tekutinách.

Stanovenie koncentrácie bielkovín

Bradford test, Lowry test a kyselina bicinchontínová (BCA) skúška sú spoločné testy na určenie koncentrácie bielkovín. Hovädzí sérový albumín (BSA) je jedným z najčastejšie používaných proteínových štandardov.

Medzipamäť rozpadu

Tlmivý roztok sa musí vybrat v súlade s bunkovou surovinou alebo tkanivom (tkanivová kultúra, rastlina, baktérie, huby atď.) a či sú bunky v štruktúre a typu konštrukcie. Široká škála tlmivých vankúšov na extrakciu proteínov, membrán a organely sú formulované s jedným alebo viacerými čistiacimi prostriedkami. Čistiaci prostriedok sa zvyčajne vyberie pomocou skúšok a chýb – Ak je k dispozícii – podľa existujúceho protokolu extrakcie bielkovín. Čistiaci prostriedok musí byť kompatibilný so zdrojom tkaniva a bielkovinami. Vo všeobecnosti je vybraný najmiernejší čistiaci prostriedok, ktorý pracuje pre špecifickú tkanivovú/bielkovinu, aby sa zachovala Maximálna funkčnosť extraktu. Okrem toho, v prípade extrakcie membrán a organely, jemný čistiaci prostriedok udržiava membrány neporušené. Bežne používané detergenty v tlmivých nárazoch sú väčšinou neiónové alebo zwitterionic, napríklad CHAPS, deoxycholát, Triton™ X-100, NP40, a Tween 20.
Napríklad, tkanivá, ako je mozog, pečeň, črevo, obličky, slezina atď môže byť jednoducho pufrovaným s Ripa – mali by sa však zahrnúť inhibítory proteázy a DTT (napr. na gélové elektroforéza).
Tlmivý roztok pre kostrové svalové tkanivo (ľadovo studený): 20 mM tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2% Triton X-100, 10% (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiothreitol doplnený proteázou a inhibítorom fosfatázy koktail
Tabuľka spoločných nárazníkov a ich rozsah pH. Vo všeobecnosti sa tieto nárazníky bežne používajú pri koncentráciách 20-50 mM.
 

Medzipamäte rozsah pH
Kyselina citrónová – Naoh 2,2 – 6,5
Citrónan sodný – Kyselina citrónová 3,0 – 6,2
Octan sodný – kyselina octová 3,6 – 5,6
Kyselina cacodylic sodná soľ – Hcl 5,0 – 7,4
Mes – Naoh 5,6 – 6,8
Dihydrogenfosforečnan sodný – Hydrogenfosforečnan sodný 5,8 – 8,0
Imidazolu – Hcl 6,2 – 7,8
Mopy – Koh 6,6 – 7,8
Trietanolamín hydrochlorid – Naoh 6,8 – 8,8
Tris – Hcl 7,0 – 9,0
HEPESOVHO – Naoh 7,2 – 8,2
Tricine – Naoh 7,6 – 8,6
Tetraborát sodný – kyselina boritej 7,6 – 9,2
Bicine – Naoh 7,7 – 8,9
Glycine – Naoh 8,6 – 10,6

Väčšina nárazníkov ukazuje pH-závislosť s teplotou. Platí to najmä pre nárazníky tris. PKa sa mení z 8,06 pri teplote 25 ° c na 8,85 pri 0 ° c.
(pH a pKa medzipamäte: pH meria koncentráciu vodíkových iónov vo vodnom roztoku. pKa (= kyselina disociácia konštanta) je príbuzný, ale konkrétnejšie opatrenia, v tom, že pomáha predpovedať, ako molekula bude pôsobiť na konkrétnu hodnotu pH.)

TRIzol

TRIzol je chemický roztok, ktorý sa používa na extrakciu RNA/DNA/proteínu počas extrakcie guanidinium tiokyanátu-fenolu-chloroformu. Použitie Rozpúšťadle pomáha TRIzol extrakcie výsledky vo vysokej DNA, RNA, a proteín výnosy z rovnakej vzorky a vyniká tým ďalšie metódy extrakcie.

Literatúra / Referencie

Radi prediskutujeme váš proces.

Poďme sa skontaktovať.