Ultrazvuková extrakcia bielkovín z tkanív a bunkových kultúr
- Extrakcia bielkovín je základným krokom prípravy vzoriek v proteomike.
- Bielkoviny možno extrahovať z rastlinných a živočíšnych tkanív, kvasiniek a mikroorganizmov.
- Sonikácia je spoľahlivá a účinná metóda extrakcie bielkovín, ktorá poskytuje vysoké výťažky bielkovín za krátky čas extrakcie.
Extrakcia bielkovín z tkanív a buniek
Extrakcia bielkovín z tkanív a kultivovaných buniek je základným krokom prípravy vzoriek, ktorý sa vykonáva pri mnohých biochemických a analytických technikách, ako sú ELISA, PAGE, Western blotting, hmotnostná spektrometria alebo purifikácia bielkovín. Ultrazvukové rozrušovanie buniek, lýza a extrakcia predstavujú presne regulovateľnú netepelnú techniku na zabezpečenie vysokých výťažkov bielkovín.
Extrakcia bielkovín z buniek pomocou ultrazvukovej sondy UP200St
- Rýchlosť
- Vysoké výťažky
- Vysoká účinnosť
- Presná regulácia parametrov
- Reprodukovateľné výsledky
- Lineárna škálovateľnosť
Všeobecné pokyny na ultrazvukovú lýzu a extrakciu bielkovín
- Regulácia teploty: Na zabezpečenie vysokého výťažku bielkovín bez tepelnej denaturácie sa musí teplota počas extrakcie regulovať. Najmodernejšie ultrazvukové homogenizátory Hielscher – nazývané aj ultrazvukové dezintegrátory alebo sonikátory – sú presne regulovateľné. Dodávajú sa s pripojiteľným snímačom teploty. V nastaveniach ultrazvukového homogenizátora možno nastaviť maximálnu teplotu. Po dosiahnutí tejto maximálnej teploty sa sonikátor automaticky zastaví, kým vzorka nevychladne.
- Pufor: Výber vhodného pufra a jeho správneho objemu sa líši podľa tkaniva a musí sa určiť skúšaním metódou pokusu a omylu.
- Izolácia / purifikácia: Proteínové lyzáty môžu obsahovať nadbytok biomolekúl, ako sú DNA alebo sacharidy, ktoré možno odstrániť zrážaním bielkovín (deoxycholát – kyselina trichlóroctová) alebo výmenou pufra.
Chittapalo a Noomhorm (2009) vo svojej štúdii uviedli, že použitím sonikácie sa zvýšil výťažok bielkovín a že proces ultrazvukovej homogenizácie a lýzy tkanív môže výrazne zlepšiť existujúce extrakčné procesy – čím otvára nové možnosti komerčnej extrakcie.
Ultrazvukový CupHorn na súčasnú, vysoko účinnú prípravu viacerých vzoriek za rovnakých podmienok na izoláciu bielkovín a fragmentáciu DNA.
Extrakcia bielkovín zo živočíšnych tkanív
Pri príprave celých tkanív (napr. obličky, srdca, pľúc, svalu atď.) by sa tkanivo malo čistými nástrojmi rozrezať na veľmi malé kúsky, podľa možnosti na ľade a čo najrýchlejšie, aby sa zabránilo degradácii proteázami (napr. lyzačný pufor, ako je RIPA, alebo hypotonický lyzačný pufor obsahujúci zmes inhibítorov proteáz a fosfatáz). Po rozrezaní sa vzorka ponorí do kvapalného dusíka na prudké zmrazenie. Vzorku možno skladovať pri -80°C na neskoršie použitie alebo ju uchovávať na ľade na okamžitú homogenizáciu. Bezprostredne pred ultrazvukovou extrakciou sa do skúmavky so vzorkou rýchlo pridá ľadovo studený lyzačný pufor (s inhibítormi proteáz DTT, leupeptínom a aprotinínom) (na ~10 mg tkaniva sa odporúča približne ~600 μL pufra). Na jednu skúmavku so vzorkou sa odporúča približne 20–60mg tkaniva.
Ultrazvuková homogenizácia, lýza a extrakcia sa vykonávajú pomocou ultrazvukového homogenizátora, ako je UP100H alebo UP200Ht, vybaveného sonotródou s mikrohrotom. Sonikácia trvá 60–90 sec. v režime ultrazvukových cyklov s 15 sec. sonikácie a 10 sec. prestávky. Vzorka by sa mala po celý čas uchovávať v ľade.
Po ultrazvukovej homogenizácii / extrakcii sa lyzát centrifuguje pri 27 000g približne 20 min. Následne sa odoberie supernatant, aby sa koncentrácia bielkovín mohla stanoviť pomocou testu na stanovenie bielkovín, ako je test Pierce BCA.
Extrakcia bielkovín z krvného séra
Na dosiahnutie homogénnej zmesi séra a fosfátového pufra sa vzorka pred ultrazvukovou lýzou buniek najprv premieša na vortexovom miešadle. Pri ultrazvukovej lýze sa vzorka sonikuje ultrazvukovým laboratórnym homogenizátorom, napríklad UP100H, počas 8 cyklov pri 20% amplitúde, pričom každý cyklus pozostáva z 5 sekúnd sonikácie a 15 sekúnd prestávky. Extrakcia proteínov sa vykonáva sonikáciou v cykloch (pulzný režim), pričom je vzorka umiestnená na ľade, aby sa zabránilo jej prehriatiu a tepelnej degradácii. Keďže sérum obsahuje veľké množstvo proteínov s vysokou molekulovou hmotnosťou (ako sú albumín, α1-antitrypsín, transferín, haptoglobulín, imunoglobulín G a imunoglobulín A), ktoré narúšajú separáciu proteínov s nízkou molekulovou hmotnosťou počas IEF, odporúča sa odstrániť ich zo séra pomocou deplečnej kolóny.
Extrakcia proteínov z rastlinného tkaniva
Čerstvé, mäkké rastlinné tkanivo, napr. mach a pod., možno ľahko rozrušiť jednoduchým vložením nasekaného materiálu vzorky do lyzačného pufra a následnou sonikáciou. Tuhé, zdrevnatené rastlinné tkanivá, ako sú semená, jedľové ihličie a pod., by sa mali pomlieť nasucho. Niektoré tvrdé, drevnaté rastlinné materiály sa musia pred extrakciou sonikáciou zmraziť a pomlieť v kvapalnom dusíku. Pri suspenziách rastlinných bunkových kultúr väčšinou postačuje ultrazvukové ošetrenie v lyzačnom pufri počas 30 až 150 sekúnd. Tuhší materiál, napríklad tekvicové semená, vyžaduje intenzívnejšiu sonikáciu, ako je opísané nižšie.
Protokol ultrazvukovej extrakcie albumínu z tekvicových semien
Na ultrazvukovú extrakciu proteínu albumínu z jemne pomletého prášku z tekvicových semien sa do sklenenej kadičky s objemom 250mL pridá 10 g odtučneného prášku z tekvicových semien a 100 mL deionizovanej vody ako rozpúšťadla. Extrakcia proteínov pozostáva z dvoch krokov: Najprv sa vzorka sonikuje pomocou sondového sonikátora UP400St (400W, 24kHz) vybaveného sonotródou S24d7. Sklenená kadička sa počas ultrazvukovej homogenizácie umiestni do studeného vodného kúpeľa. Pripojiteľný snímač teploty a nastavenia regulácie teploty sonikátora UP400St zabezpečujú, že teplota vzorky sa vždy udržiava pod 30°C. Presnou reguláciou teploty počas sonikácie sa predchádza denaturácii albumínu. V druhom kroku sa extrakcia vykonala pomocou miešadla pri rýchlosti 200 rpm a teplote 30°C. Potom sa kadička prenesie do termostatovanej trepačky. Globulín sa odstráni dialýzou s destilovanou vodou. Po odstránení globulínu možno z proteínového extraktu odobrať vzorku na stanovenie albumínového profilu a následne sa extrakt upraví na pI=3,0 pomocou 0,1 M HCl na koaguláciu albumínu. Pevná fáza sa oddelí centrifugáciou pri 5000g a 20°C a opätovne sa rozpustí v deionizovanej vode. Koagulácia albumínu sa vykonáva dvakrát, aby sa zvýšil podiel proteínov v albumínovom koncentráte.
Ultrazvuková alkalická extrakcia proteínov na prípravu proteínového koncentrátu z ryžových otrúb ukazuje, že ultrazvukové ošetrenie vedie k vyššiemu výťažku proteínov za výrazne kratší čas extrakcie – v porovnaní s konvenčnými extrakčnými metódami.
Protokol prípravy vzorky na získanie funkčného enzýmu iNOS
Na získanie plne funkčného enzýmu iNOS (napr. na skríning liečiv) sa odporúča nasledujúci protokol: Bunková suspenzia by sa mala umiestniť na ľad a sonikovať pomocou UP100H pri amplitúde 10µm v cyklickom režime pozostávajúcom z 5 sekúnd sonikácie a 25 sekúnd prestávky na ľade. Postup by sa mal zopakovať približne 3-krát. Prestávka medzi sonikačnými cyklami obmedzuje nárast teploty, a tým znižuje riziko denaturácie.
Ultrazvuková solubilizácia proteínov
Sonikácia môže urýchliť proces solubilizácie proteínov, ktorý zvyčajne trvá niekoľko hodín. Aby sa zabránilo prehriatiu vzorky, degradácii a modifikáciám proteínov v roztokoch obsahujúcich močovinu, ultrazvukové impulzy by nemali trvať dlhšie ako niekoľko sekúnd.
Sonikátor UP200Ht s mikrohrotom S26d2 s priemerom 2mm na sonikáciu malých vzoriek.
Ultrazvukové zariadenia na extrakciu proteínov
Hielscher Ultrasonics ponúka široký sortiment ultrazvukových homogenizátorov na dezintegráciu buniek, tkanív, baktérií, mikroorganizmov, kvasiniek a spór.
Laboratórne ultrazvukové prístroje Hielscher sú výkonné a ľahko sa obsluhujú. Sú skonštruované na nepretržitú prevádzku 24/7 ako robustné a účinné laboratórne a stolové zariadenia. Pri všetkých zariadeniach možno presne regulovať výstupnú energiu a amplitúdu. Široký sortiment príslušenstva poskytuje ďalšie možnosti zostavenia konfigurácie. Digitálne ultrazvukové prístroje, ako sú VialTweeter, UP200Ht, UP200St a UP400St, majú integrovanú reguláciu teploty a zabudovanú SD kartu na automatické zaznamenávanie údajov.
Na nepriamu a súčasnú sonikáciu viacerých vzoriek bez krížovej kontaminácie ponúkame VialTweeter alebo ultrazvukový CupHorn.
Nasledujúca tabuľka poskytuje prehľad našich ultrazvukových prístrojov na prípravu vzoriek, rozrušovanie buniek a extrakciu. Kliknutím na typ zariadenia získate ďalšie informácie o jednotlivých ultrazvukových homogenizátoroch. Náš dôkladne vyškolený technický personál s dlhoročnými skúsenosťami vám rád pomôže vybrať najvhodnejší ultrazvukový prístroj na prípravu vašich vzoriek!
| Objem dávky | Prietok | Odporúčané zariadenia |
|---|---|---|
| až 10 liekoviek alebo skúmaviek | n.a. | VialTweeter |
| viacjamkové / mikrotitračné platničky | n.a. | UIP400MTP |
| viacero skúmaviek / nádob | n.a. | CupHorn |
| 1 až 500mL | 10 až 200mL/min | UP100H |
| 10 až 1000mL | 20 až 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 až 2000mL | 20 až 400mL/min | UP400St |
V závislosti od vašej aplikácie, materiálu a objemu vzorky vám odporučíme najvhodnejšiu konfiguráciu na prípravu vašich vzoriek. Kontaktujte nás ešte dnes!
Kontaktujte nás! / Opýtajte sa nás!
Digitálne ultrazvukové prístroje Hielscher sú vybavené diaľkovým ovládaním cez prehliadač a automatickým zaznamenávaním údajov na integrovanú SD kartu.
VialTweeter na nepriamu sonikáciu.
Užitočné informácie
Proteomika
Proteomika je oblasť výskumu, ktorá skúma proteíny a proteóm. Proteíny plnia v organizmoch širokú škálu životne dôležitých funkcií. Proteóm je úplný súbor proteínov exprimovaných genómom, bunkou, tkanivom alebo organizmom v určitom čase. Proteóm sa mení v čase a v závislosti od konkrétnych požiadaviek alebo stresov, ktorým je bunka alebo organizmus vystavený. Presnejšie ide o súbor exprimovaných proteínov v danom type bunky alebo organizmu v danom čase za definovaných podmienok. Tento termín vznikol spojením slov proteín a genóm. Proteomika je štúdium proteómu.
Proteín
Proteíny sú veľké biomolekuly, takzvané makromolekuly – ktoré sa skladajú z jedného alebo viacerých dlhých reťazcov aminokyselinových zvyškov. Proteíny sú prítomné vo všetkých organizmoch rastlinného aj živočíšneho pôvodu a sú kľúčové pre väčšinu biologických funkcií. Keďže proteíny obsahujú množstvo biologických informácií, extrahujú sa na analytické účely, napr. na proteomický výskum. Medzi najdôležitejšie funkcie proteínov patrí katalýza metabolických reakcií, replikácia DNA, reakcia na podnety a transport molekúl z jedného miesta na druhé. Proteíny sa navzájom líšia predovšetkým sekvenciou aminokyselín, ktorá je určená nukleotidovou sekvenciou ich génov a ktorá zvyčajne vedie k zloženiu proteínu do špecifickej trojrozmernej štruktúry určujúcej jeho aktivitu. Proteíny sú – popri peptidoch – jednou z kľúčových zložiek potravy. Proteomika je preto účinným nástrojom v potravinárskej vede na optimalizáciu procesov, bezpečnosti potravín a hodnotenia výživovej hodnoty.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je predanalytický postup na separáciu a predkoncentráciu analytov. V kombinácii s ultrazvukovým pôsobením možno extrakciu pri bode zákalu zintenzívniť, čím sa proces stáva účinnejším, rýchlejším a šetrnejším k životnému prostrediu. Pri použití ultrazvuku je extrakcia pri bode zákalu výrazne účinnejšou metódou prípravy analytov. Prečítajte si viac o ultrazvukom asistovanej extrakcii pri bode zákalu!
Gélová elektroforéza
Gélová elektroforéza je hlavnou metódou separácie a analýzy makromolekúl, ako sú DNA, RNA a proteíny, ako aj ich fragmentov, na základe ich veľkosti a náboja. Používa sa v klinickej chémii na separáciu proteínov podľa náboja a/alebo veľkosti (IEF v agaróze, v podstate nezávislá od veľkosti) a v biochémii, molekulárnej biológii a proteomike na separáciu zmiešanej populácie fragmentov DNA a RNA podľa dĺžky, na odhad veľkosti fragmentov DNA a RNA alebo na separáciu proteínov podľa náboja.
Bunkové kultúry
Bunková kultivácia je riadený proces rastu, pri ktorom sa bunky kultivujú za kontrolovaných podmienok. Podmienky bunkovej kultivácie sa líšia pre každý typ buniek. Prostredie bunkovej kultúry vo všeobecnosti pozostáva z vhodnej nádoby (napr. Petriho misky) so substrátom alebo médiom, ktoré dodáva základné živiny (aminokyseliny, sacharidy, vitamíny, minerály), rastové faktory, hormóny a plyny (CO2, O2) a reguluje fyzikálno-chemické prostredie (pufor na udržiavanie pH, osmotický tlak, teplotu). Väčšina buniek potrebuje povrch alebo umelý substrát, zatiaľ čo iné bunkové kultúry možno kultivovať voľne rozptýlené v kultivačnom médiu (suspenzná kultúra, bunková suspenzia).
Veľkoobjemové kultúry živočíšnych bunkových línií sa používajú pri priemyselnej výrobe vírusových vakcín a ďalších produktov získavaných biotechnologickými postupmi. Ľudské kmeňové bunky sa kultivujú s cieľom zvýšiť počet buniek a diferencovať ich na rôzne typy somatických buniek na transplantačné účely.
Vzorky tkanív
Pojem tkanivo označuje bunkový medzistupeň, pri ktorom sa bunkový materiál nachádza na organizačnej úrovni medzi bunkami a celým orgánom. V tkanive sú zoskupené podobné bunky rovnakého pôvodu, ktoré spoločne vykonávajú určitú funkciu. Funkčným zoskupením viacerých tkanív vznikajú zložité štruktúry orgánov.
Tkanivo sa odoberá na výskum v biológii, histológii/histopatológii, parazitológii, biochémii a imunohistochémii, ako aj na kultiváciu a extrakciu DNA. Rozlišuje sa živočíšne tkanivo (podskupina: tkanivo cicavcov) a rastlinné pletivo. Živočíšne tkanivá sa členia na štyri základné typy: spojivové, svalové, nervové a epitelové tkanivo. Rastlinné pletivá sa členia na tieto tri pletivové sústavy: pokožku, základné pletivo a vodivé pletivo.
Vzorky tkanív a pletív možno pripraviť z častí živočíchov alebo rastlín, napr. z kostí, svalov, listov atď.
Telesné tekutiny
Krv, sérum, plazma, mozgovomiechový mok, sliny a synoviálna tekutina sú telesné tekutiny, ktoré predstavujú bohatý zdroj diagnosticky relevantných informácií. Preto je dôležitá dôkladná príprava vzoriek telesných tekutín na analýzu. Prvá ťažkosť súvisí so širokým dynamickým rozsahom zložiek prítomných v telesných tekutinách.
Stanovenie koncentrácie proteínov
Bradfordova metóda, Lowryho metóda a metóda s kyselinou bicinchonínovou (BCA) sú bežné metódy na stanovenie koncentrácie proteínov. Hovädzí sérový albumín (BSA) je jedným z najčastejšie používaných proteínových štandardov.
Lyzačný pufor
Lyzačný tlmivý roztok sa musí zvoliť podľa bunkového materiálu alebo tkaniva (tkanivová kultúra, rastlina, baktérie, huby atď.) a podľa toho, či sú bunky usporiadané v štruktúre a o aký typ štruktúry ide. Široká škála lyzačných tlmivých roztokov na extrakciu proteínov, membrán a organel sa pripravuje s jedným alebo viacerými detergentmi. Detergent sa zvyčajne vyberá skúškami metódou pokusu a omylu alebo – ak je k dispozícii – podľa existujúceho protokolu extrakcie proteínov. Detergent musí byť kompatibilný so zdrojovým tkanivom a proteínmi. Vo všeobecnosti sa volí najšetrnejší detergent, ktorý je účinný pre konkrétne tkanivo / proteín, aby sa zachovala maximálna funkčnosť extraktu. Okrem toho pri extrakcii membrán a organel šetrný detergent zachováva membránu neporušenú. Bežne používané detergenty v lyzačných tlmivých roztokoch sú prevažne neiónové alebo zwitteriónové, napr. CHAPS, deoxycholát, Triton™ X-100, NP40 a Tween 20.
Napríklad tkanivá ako mozog, pečeň, črevo, oblička, slezina atď. možno jednoducho pufrovať roztokom RIPA – mali by sa však pridať inhibítory proteáz a DTT (napr. na gélovú elektroforézu).
Lyzačný tlmivý roztok pre tkanivo kostrového svalstva (ľadovo studený): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol s prídavkom zmesi inhibítorov proteáz a fosfatáz
Tabuľka bežných tlmivých roztokov a ich rozsahu pH. Vo všeobecnosti sa tieto tlmivé roztoky bežne používajú v koncentráciách 20–50 mM.
| Tlmivý roztok | Rozsah pH |
|---|---|
| Kyselina citrónová – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Citrát sodný – kyselina citrónová | 3,0 – 6,2 |
| Octan sodný – kyselina octová | 3,6 – 5,6 |
| Sodná soľ kyseliny kakodylovej – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Dihydrogenfosforečnan sodný – hydrogenfosforečnan disodný | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Hydrochlorid trietanolamínu – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricín – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Tetraboritan sodný – kyselina boritá | 7,6 – 9,2 |
| Bicín – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glycín – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Pri väčšine tlmivých roztokov závisí pH od teploty. Platí to najmä pre tlmivé roztoky Tris. Hodnota pKa sa mení z 8,06 pri 25°C na 8,85 pri 0°C.
(pH a pKa tlmivého roztoku: pH vyjadruje koncentráciu vodíkových iónov vo vodnom roztoku. pKa (= kyselinová disociačná konštanta) je súvisiaca, ale špecifickejšia veličina, pretože pomáha predpovedať, ako sa bude molekula správať pri konkrétnej hodnote pH.)
TRIzol
TRIzol je chemický roztok používaný na extrakciu RNA/DNA/proteínov počas extrakcie guanidíniumtiokyanátom, fenolom a chloroformom. Použitie ultrazvukom asistovanej extrakcie pomocou TRIzolu vedie k vysokým výťažkom DNA, RNA a proteínov z tej istej vzorky, čím prekonáva iné extrakčné metódy.
Literatúra/Referencie
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.