Ultrazvuková príprava vzoriek C. elegans

C. elegans, červ háďatko, je široko používaný modelový organizmus v biológii. Príprava vzorky pred analýzou vyžaduje lýzu, extrakciu proteínov a lipidov, ako aj fragmentáciu RNA, ktorú je možné spoľahlivo vykonať pomocou sonikácie. Ultrazvukové disruptory buniek sú spoľahlivé, sofistikované a ľahko použiteľné zariadenia na rýchlu prípravu vzoriek C. elegans.

Ultrazvuková príprava vzoriek C. elegans

C. elegans sú škrkavky, ktoré sú široko používané vo výskumných laboratóriách na skúmanie genomiky, vývojovej biológie a chorôb. Mnoho génov v genóme C. elegans má funkčné náprotivky u ľudí. Červ háďatko je tak mimoriadne užitočným modelom pre ľudské choroby. Ďalšími výhodami pre široké využitie C. elegans sú jeho jednoduché a lacné pestovanie na tanieroch obsahujúcich baktérie (napr. E. coli), priehľadnosť, pohodlná manipulácia, ako aj možnosť zmraziť a skladovať červy na dlhšie obdobie.
Analýza bielkovín a lipidov je pravidelná procedúra v laboratóriách a ultrazvuková príprava vzoriek je zavedenou metódou na lýzu háďatka C. elegans v každom vývojovom štádiu (t. j. embryá, larvy L1-L4, dospelí). Keďže C. elegans sa používa aj ako expresný systém proteínov na nadmernú expresiu cieľových proteínov, je potrebná spoľahlivá, reprodukovateľná metóda lýzy a extrakcie bielkovín, ktorá poskytuje vysoké výťažky bielkovín. Ultrazvukové systémy na narušenie a extrakciu buniek sú k dispozícii ako homogenizátory sondového typu a ako ultrazvukové ultrazvuky s viacerými vzorkami. Spoločnosť Hielscher Ultrasonics, ktorá poskytuje pohodlnú prípravu vzoriek a všetky druhy veľkostí vzoriek, má ideálny ultrazvukový disruptor buniek pre váš laboratórny postup.

Ultrazvukové protokoly pre narušenie a lýzu C. elegans

Ultrazvukovú homogenizáciu a lýzu C. elegans a následnú extrakciu proteínov a lipidov je možné vykonať pomocou rôznych postupov s použitím rôznych homogenizačných a lýznych pufrov atď. Všetky protokoly lýzy majú spoločné to, že vzorky sa musia nepretržite uchovávať na ľade, aby sa zabránilo degradácii bielkovín. Nižšie vám predstavujeme niekoľko spoľahlivých a rýchlych ultrazvukových lýznych a extrakčných protokolov na prípravu vysokokvalitných vzoriek C. elegans obsahujúcich proteíny alebo lipidy.

Výhody ultrazvukovej lýzy C. elegans

• Spoľahlivý
• Reprodukovateľné
• presneteplotne riadené
• spoľahlivé riadenie procesov
• Jemná metóda
• jednoduchá aplikácia
• Bezpečný

Ultrazvuková extrakcia proteínov zo vzoriek C. elegans

Ultrazvukovú lýzu a extrakciu bielkovín červov C. elegans je možné vykonať pomocou rôznych protokolov. Nižšie vám uvádzame niekoľko spoľahlivých a rýchlych protokolov lýzy pre reprodukovateľné výsledky extrakcie bielkovín.

Rýchla príprava cytosolického extraktu z červov C. elegans sonikáciou

Pomocou nasledujúceho protokolu môžete pripraviť lyzáty C. elegans za menej ako 30 minút.
Zbierka C. elegans
Vyberte požadované červy C. elegans do 1,5 ml skúmavky s fosfátovým pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS) alebo ich umyte z taniera s 1,5 ml PBS. Odstredivujte 1 minútu pri 2000 ot./min na pelety. Vzorky uchovávajte vždy na ľade.
Potom červy dvakrát umyte PBS.
Potom červy dvakrát umyte ddH₂O.
Resuspendujte červy v najmenej 500 ul homogenizačného pufra (HB). Vzorky červov sú teraz pripravené na ultrazvukovú lýzu.
Pre vyššiu kvalitu proteínových extraktov možno budete chcieť znížiť bakteriálnu kontamináciu umývaním červov po dobu 5 minút v PBS a sterilnej, ultračistej vode (ddH)₂O) alebo vykonať plávanie sacharózy. Vzorky červov uchovávajte nepretržite na ľade.

Ultrazvukový protokol lýzy C. elegans

• Uistite sa, že ste ultrazvukový homogenizátor pripravili vopred, aby bol ultrazvukový homogenizátor pripravený na použitie (namontovaná sonda, prednastavený program sonikácie).

Ak je váš ultrazvuk namontovaný na stojane, umiestnite ľadový kúpeľ so skúmavkami na vzorky pod ultrazvukovú sondu a vložte ultrazvukovú sondu do 1.5 ml skúmavky.

• Pri lýze C. elegans s UP200St alebo UP200Ht by sa ultrazvuk mal vykonať pomocou mikrohrotu (napr. 2 mm sonda S26d2; pozri obrázok vľavo) pri 40 % amplitúde po dobu 1 sekundy s 30 sekundovými prestávkami medzi nimi. 5 sonikačných cyklov na každú 1 sekundu s 30-sekundovými prestávkami je ideálnych pre lýzu C. elegans. Ak vykonávate lýzu prvýkrát, môžete pomocou mikroskopu skontrolovať priebeh lýzy v malých alikvotách vzorky po každom impulze.
• Lýza je úspešne dokončená, keď sú červy narušené. Nadmerná sonikácia má za následok rozbitie jadier a stane sa viditeľnou, keď sa vzorka stane viskóznou alebo pení. Aby ste zabránili degradácii vzorky, v prípade potreby použite viac impulzov. Nepredlžujte čas každého ultrazvukového pulzného cyklu, aby ste získali vysokokvalitné proteínové extrakty.
• Číry bunkový lyzát odstredením ultrazvukovo lyzovaných červov pri 14 000 ot./min počas 10 minút pri 4 °C.
• Potom preneste supernatant do čerstvej skúmavky a pripravte sa na imunoprecipitaciu alebo iné testy.

Poznámka pre homogenizačný pufer: Pripravte homogenizačný pufor pre vyššie uvedený protokol ultrazvukovej lýzy nasledovne:

Vysokovýkonná lýza C. elegans v 96-jamkových platniach pomocou UIP400MTP Plate Sonicator

C. elegans Lysis (dospelé háďatká)
UIP400MTP 80 % amplitúda, 20 cyklov (každý sonikačný cyklus: 30 sekúnd zapnuté, 30 sekúnd vypnuté)
Lyzový pufer:

• Možnosť 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Možnosť 2) pre koimunoprecipitaciu (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (kompletný kokteil inhibítorov proteinázy)

Vysokovýkonná fragmentácia DNA
C. elegans (dospelé háďatká) DNA 200-300 bp: UIP400MTP doštičkový sonikátor – nastavte 80% amplitúdu, 30 impulzov – každých 30 sekúnd zapnutých, 30 sekúnd vypnutých

UIP400MTP Plate Sonicator na vysokovýkonnú prípravu vzoriek rovnomerne sonikuje vzorky vo viacjamkových, mikrotitračných platniach a 96-jamkových platniach

Ultrazvuková lýza C. elegans pre kvantitatívne testy čistenia afinity

Embryá C. elegans (∼2 milióny na replikát) boli čerstvo zozbierané v biologickom trojnásobnom vyhotovení bielením mladých gravidných hermafroditov a sonikované na ľade (cyklus: 0,5 s, amplitúda: 40–45 %, 5 ťahov/sedenie, 5 sedení, interval medzi sedeniami: 30 s; Ultrazvukový procesor UP200S s mikrohrotom S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) v lyzačnom pufri (celkový objem: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, zmes inhibítorov proteázy, 0,1% náhrada Nonidet P-40). Po sonikácii sa substitucia Nonidet P-40 pridal až do 1 % a lyzáty sa inkubovali s rotáciou hlavy nad chvostom pri 4 °C počas 30 minút, po ktorej nasledovala centrifugácia pri 20 000 × g počas 20 minút pri 4 °C. Vyčistený lyzát sa potom odsával bez narušenia hornej lipidovej vrstvy a rozdelil sa na polovicu buď na anti-GFP agarózové guľôčky alebo zablokované kontrolné guľôčky (40–50 μl). Po rotácii hlavy nad chvostom pri 4 °C počas 60 – 90 minút sa guľôčky raz premyli lyzačným pufrom obsahujúcim 0,1 % náhrady Nonidet P-40, po ktorom nasledovalo dvakrát premytie buď v tlmivom roztoku I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) alebo tlmivom roztoku II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) alebo oboje. Pre sťahovacie systémy GFP:MBK-2 sa uskutočnili dva samostatné experimenty s použitím rôznych podmienok prania. Proteíny boli eluované orbitálnym trepaním v 50 μl 6 m močoviny/2 M tiomočoviny pri izbovej teplote. Pri sťahovacích experimentoch MBK-1::GFP boli proteíny eluované dvakrát pretrepaním v 50 μl 8 m guanidíniumchloridu pri 90 °C, po ktorom nasledovalo zrážanie etanolu. Elutované vzorky proteínu sa potom strávili v roztoku.
(porovnaj Chen a kol., 2016)

Ultrazvuková homogenizácia a lýza červov

Pre procedúru lýzy C.elegans a extrakcie proteínov sa na vzorku odozbieralo 30 000 nemotodov príslušného stupňa a premylo sa v ľadovo studenom S-bazalu, koncentrovalo sa centrifugáciou pri 1500 ot./min počas 2 minút, šesťkrát sa premylo ľadovo studeným S-bazalom, aby sa odstránili zvyšky baktérií, a potom sa uložilo na ľad, kým nie je pripravené na použitie. Na extrakciu bielkovín sa dospelým červom nechalo vytvoriť kompaktnú peletu po poslednom S-bazálnom premývaní. Červí pelety sa potom resuspendovali v 1 ml ľadovo studeného extrakčného pufra [20 mM fosforečnan draselný, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibítory proteázy (Sigma P2714)] a okamžite sa spracovali.
∼30 000 dospelých gravidných červov (čo zodpovedá ∼100 mg mokrej hmotnosti) bolo sonikovaných na ľade pomocou ultrazvukového ultrazvuku typu sondy (napr. UP50H s mikrošpičkou MS2) pri 40% amplitúde počas 10 cyklov po 3 sekundy zapnuté, 30 sekúnd vypnuté, v 1 ml ľadovo studeného extrakčného pufra. (porovnaj Baskharan et al. 2012)

Ultrazvuková extrakcia lipidov z C. elegans

V lipidomike, odvetví metabolomiky, sa charakterizuje a analyzuje lipidový komplement biologických systémov. C. elegans sú široko používané v lipidomike na skúmanie interakcie metabolických lipidov a ich účinkov na zdravie a dĺžku života.
Ultrazvuková lýza a extrakcia sa používa na uvoľňovanie lipidov, ako sú sfingolipidy, z embryí C. elegans, lariev a dospelých červov. Ultrazvuk sa používa na prípravu červových homogenátov a následne na extrakciu lipidov zo vzorky.
Protokol pre ultrazvukovú extrakciu lipidov z C. elegans
Peletu C. elegans rozmrazte na ľade a resuspendujte 0,5 ml ultravody. 
Sonikujte vzorky C. elegans v 1,5 ml skúmavkách, pričom vzorky uchovávajte nepretržite na ľade.
Sonikáciu je možné vykonať pomocou sondy-ultrazvuku, ako je UP200Ht, ultrazvuková jednotka na prípravu vzoriek VialTweeter (súčasná sonikácia 10 vzoriek) alebo UIP400MTP (na sonikáciu viacjamkových platní, ako sú 96-jamkové platničky). Na ultrazvukovú lýzu pomocou UP200Ht použite mikrohrot S26d2. Prednastavte režim ultrazvukového cyklu v digitálnom menu. Nastavte amplitúdu na 10 % a režim sonikačného cyklu 2 sekundové impulzy po 20 cyklov s pauzou 30 sekúnd medzi každým ultrazvukovým pulzačným výbuchom.
Supernatanty preneste do sklenených skúmaviek so skrutkovacím uzáverom. 
Vykonajte Folchovu extrakciu pridaním 1 ml ultravody do každej sklenenej skúmavky a potom pridaním 6 ml zmesi chloroform/metanol (pomer = 2:1) do každej sklenenej skúmavky.
Každú sklenenú trubicu 4-krát prevírte na 30 sekúnd. 
Skúmavky odstreďujte pri 1 258 x g po dobu 15 minút (Eppendorf, 5810 R), aby ste ešte viac zlepšili oddelenie fáz. 
Spodnú hydrofóbnu frakciu preneste do čistej sklenenej trubice sklenenou Pasteurovou pipetou. 
Spodnú hydrofóbnu frakciu vysušte pod prúdom dusíka vo výparníku dusíka. 
Sušené pelety skladujte v mrazničke s teplotou -80 °C až do použitia.

Ultrazvuková príprava červových lyzátov

Červový lyzát: Červy v štádiu L4 boli zozbierané a trikrát premyté tlmivým roztokom M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl a 0,87 mM MgSO₄), aby sa odstránili všetky baktérie. Po odstránení čo najväčšieho množstva tlmivého roztoku M9 boli červy resuspendované v lýznom pufri: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM fosfát β-glycerol, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorid sodný, 1 mM ortovanadičnan sodný, 5 mM pyrofosforečnan sodný, 0,2 mM fenylmetánsulfonylfluorid a inhibítor proteázy. Červy boli zmrazené v tekutom dusíku a trikrát rozmrazené pri 37 °C, potom boli červy sonikované na suchom ľade pomocou ultrazvukovej jednotky VialTweeter na súčasnú prípravu 10 skúmaviek na vzorky. Sonikácia sa uskutočňovala pri 50% amplitúde v 10 cykloch po 2 sekundách s 30-sekundovou pauzou medzi sonikáciou. Potom sa vzorky odstredili pri 12000 ot./min pri 4 °C počas 15 minút. Supernatant sa zbieral a skladoval pri teplote -70 °C. Na kvantifikáciu proteínov sa použila alikvotná časť pomocou Bradfordovho testu.
Stanovenie celkového glutatiónu, GSH a GSSG: Na kvantifikáciu glutatiónu sa lyzáty a stanovenie vykonali v ten istý deň. Larvy L4 kŕmené glukózou a kontrolné larvy boli zozbierané a trikrát premyté tlmivým roztokom M9. Po odstránení čo najväčšieho množstva pufra M9 boli červy resuspendované v ľadovo studenej kyseline metafosforečnej (5% w/v), potom boli červy sonikované v ľade ultrazvukovým VialTweeterom pri 50% amplitúde v desiatich sonikačných cykloch po 2 sekundách s 30-sekundovou pauzou medzi každým cyklom. Potom sa odstreďuje pri 12000 ot./min pri 4 ̊C po dobu 15 minút.
(porovnaj Alcántar-Fernández a kol., 2018)

Príprava vzorky C. elegans pred imunoprecipitáciou a Western Blottingom

Stručne povedané, pre embryonálne extrakty sa larvy C. elegans L1 pestovali vo veľkých tekutých kultúrach S-medium až do dospelosti. Embryá boli odobraté pomocou štandardnej bieliacej metódy a suspendované v lyzačnom pufri (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7 % glycerolu, 0,05 % NP-40, 1 kokteil inhibítora proteázy a kokteil inhibítora fosfatázy I a II 1 - fosfatázy), rýchlo zmrazené v tekutom dusíku a lyzované ultrazvukovým narušením buniek pomocou ultrazvukového ultrazvuku s mikrohrotom, ako je UP200Ht s S26d2 pre 10 impulzov počas 10 s pri 30% amplitúde. Ak je potrebné pripraviť väčší počet vzoriek, ultrazvuk VialTweeter alebo MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP pre jamkové platničky. Po sonikácii boli extrakty vopred vyčistené odstreďovaním pri 30 000 g počas 20 minút pri 4 °C. Vopred vyčistený extrakt (300 μg celkového proteínu) bol inkubovaný so 40 μ- ΰ� g anti-CDC-25.1 afinitne purifikovanej protilátky (táto štúdia) zosieťovanej s proteínom A-agarózou, alebo ako kontrola bolo použité podobné množstvo králičieho imunoglobulínu (Ig)G zosieťovaného s proteínom A-agarózou v celkovom objeme 200 μl lýzneho pufra obsahujúceho 1% NP-40, ktorého zahrnutie znížilo nešpecifickú väzbu proteínov na matricu. Vzorky sa striedali 1 hodinu pri 4 °C, guľôčky sa trikrát premyli lýznym pufrom a eluovali sa 30 μl glycínu/HCl a 200 mM NaCl, pH 2,2. Po imunoprecipitacii sa eluáty zriedili v 30 μ���l pufra vzorky SDS, zahriali sa na 95 °C počas 4 minút a zvyčajne sa 3 % z celkového množstva pre vstup a 30 % pre eluáty aplikovali na SDS-PAGE, po ktorom nasledovalo Western blotting s anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubikvitín (1:1000), anti-GSK3- (1:500) alebo anti---β-aktín (1:2000). Ak extrakty neboli podrobené imunoprecipitacii, rovnaké množstvo celkových bielkovín získaných z týchto extraktov bolo resuspendované v tlmivom roztoku vzorky SDS, zahrievané na 95 °C a potom priamo aplikované na SDS-PAGE a analyzované Western blottingom. (porovnaj Segref a kol. 2020)

Ultrazvuková lýza pod presnou reguláciou teploty

Presná a spoľahlivá regulácia teploty je rozhodujúca pri manipulácii s biologickými vzorkami. Vysoké teploty iniciujú tepelne indukovanú degradáciu proteínov vo vzorkách.
Ako všetky techniky mechanickej prípravy vzoriek, aj sonikácia vytvára teplo. Teplotu vzoriek je však možné dobre kontrolovať pri použití VialTweeter. Predstavujeme vám rôzne možnosti monitorovania a kontroly teploty vašich vzoriek pri ich príprave pomocou VialTweeter a VialPress na analýzu.

1. Monitorovanie teploty vzorky: Ultrazvukový procesor UP200St, ktorý poháňa VialTweeter, je vybavený inteligentným softvérom a zásuvným snímačom teploty. Zapojte snímač teploty do UP200St a vložte hrot snímača teploty do jednej zo skúmaviek na vzorky. Prostredníctvom digitálneho farebného dotykového displeja môžete v ponuke UP200St nastaviť špecifický teplotný rozsah pre sonikáciu vzorky. Ultrazvuk sa automaticky zastaví po dosiahnutí maximálnej teploty a pozastaví sa, kým sample teplota klesne na nižšiu hodnotu nastavenej teploty ∆. Potom sa sonikácia spustí automaticky znova. Táto inteligentná funkcia zabraňuje degradácii spôsobenej teplom.
2. Blok VialTweeter je možné predchladiť. Vložte blok VialTweeter (iba sonotrode bez prevodníka!) do chladničky alebo mrazničky, aby sa titánový blok predchladil, pomáha oddialiť nárast teploty vo vzorke. Ak je to možné, samotná vzorka môže byť tiež predchladená.
3. Počas sonikácie použite suchý ľad na ochladenie. Použite plytký podnos naplnený suchým ľadom a umiestnite VialTweeter na suchý ľad, aby sa teplo mohlo rýchlo rozptýliť.

Nájdite optimálny ultrazvukový disruptor buniek pre vašu aplikáciu lýzy

Hielscher Ultrasonics je dlhoročný skúsený výrobca vysokovýkonných ultrazvukových disruptorov buniek a homogenizátorov pre laboratóriá, stolové a priemyselné systémy. Veľkosť bakteriálnej bunkovej kultúry, váš výskumný alebo výrobný cieľ a objem bunky na spracovanie za hodinu alebo deň sú základnými faktormi na nájdenie správneho ultrazvukového disruptora buniek pre vašu aplikáciu.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne riešenia pre súčasnú sonikáciu viacerých vzoriek (až 10 injekčných liekoviek), ako aj hromadných vzoriek (t. j. mikrotitračné platničky / 96-jamkové platničky), klasický laboratórny ultrazvukový ultrazvuk sondového typu s rôznymi úrovňami výkonu od 50 do 400 wattov až po plne priemyselné ultrazvukové procesory s výkonom až 16 000 wattov na jednotku pre komerčné narušenie buniek a extrakciu proteínov vo veľkej výrobe. Všetky ultrazvukové prístroje Hielscher sú skonštruované pre prevádzku 24/7/365 pri plnom zaťažení. Robustnosť a spoľahlivosť sú základnými vlastnosťami našich ultrazvukových prístrojov.
Všetky digitálne ultrazvukové homogenizátory sú vybavené inteligentným softvérom, farebným dotykovým displejom a automatickým protokolovaním údajov, vďaka čomu sa ultrazvukové zariadenie stáva pohodlným pracovným nástrojom v laboratóriu a výrobných zariadeniach.
Dajte nám vedieť, aký druh buniek, aký objem, s akou frekvenciou a s akým cieľom máte na spracovanie svojich biologických vzoriek. Odporučíme vám najvhodnejší disruptor ultrazvukových buniek pre vaše procesné požiadavky.

Nasledujúca tabuľka vám poskytuje približnú kapacitu spracovania našich ultrazvukových systémov od kompaktných ručných homogenizátorov a ultrazvukových procesorov MultiSample až po priemyselné ultrazvukové procesory pre komerčné aplikácie: