Ultrazvuková príprava vzoriek C. elegans

C. elegans je hlísta, ktorá sa v biológii široko využíva ako modelový organizmus. Príprava vzoriek pred analýzou vyžaduje lýzu, extrakciu proteínov a lipidov, ako aj fragmentáciu RNA, ktoré možno spoľahlivo vykonať sonikáciou. Ultrazvukové dezintegrátory buniek sú spoľahlivé, sofistikované a ľahko použiteľné zariadenia na rýchlu prípravu vzoriek C. elegans.

Ultrazvuková príprava vzoriek C. elegans

Caenorhabditis elegans sú hlísty, ktoré sa vo výskumných laboratóriách široko využívajú na skúmanie genomiky, vývinovej biológie a chorôb. Mnohé gény v genóme C. elegans majú u ľudí funkčné náprotivky. Táto hlísta je preto mimoriadne užitočným modelom ľudských chorôb. Ďalšími výhodami, ktoré prispievajú k širokému využívaniu C. elegans, sú jednoduchá a lacná kultivácia na platniach obsahujúcich baktérie (napr. E. coli), priehľadnosť, jednoduchá manipulácia, ako aj možnosť hlísty zmraziť a skladovať dlhší čas.
Analýzy proteínov a lipidov sú v laboratóriách bežnými postupmi a ultrazvuková príprava vzoriek je zavedenou metódou lýzy hlíst C. elegans v každom vývinovom štádiu (t. j. embryá, larvy L1–L4, dospelé jedince). Keďže sa C. elegans využíva aj ako systém na expresiu proteínov na nadmernú expresiu cieľových proteínov, je potrebná spoľahlivá a reprodukovateľná metóda lýzy a extrakcie proteínov, ktorá poskytuje vysoké výťažky proteínov. Ultrazvukové systémy na dezintegráciu buniek a extrakciu sú dostupné ako sondové homogenizátory a ako ultrazvukové zariadenia na súčasné spracovanie viacerých vzoriek. Hielscher Ultrasonics ponúka ideálny ultrazvukový dezintegrátor buniek pre váš laboratórny postup, ktorý umožňuje pohodlnú prípravu vzoriek všetkých veľkostí a v akomkoľvek počte.

Protokoly ultrazvukovej dezintegrácie a lýzy C. elegans

Ultrazvukovú homogenizáciu a lýzu C. elegans a následnú extrakciu proteínov a lipidov možno vykonať rôznymi postupmi s použitím rôznych homogenizačných a lyzačných pufrov atď. Všetky protokoly lýzy majú spoločné to, že vzorky sa musia nepretržite uchovávať na ľade, aby sa zabránilo degradácii proteínov. Nižšie uvádzame niekoľko spoľahlivých a rýchlych protokolov ultrazvukovej lýzy a extrakcie na prípravu vysokokvalitných vzoriek C. elegans obsahujúcich proteíny alebo lipidy.

Výhody ultrazvukovej lýzy C. elegans

• spoľahlivá
• reprodukovateľná
• s presne regulovanou teplotou
• spoľahlivé riadenie procesu
• šetrná metóda
• jednoduché použitie
• bezpečná

Ultrazvuková extrakcia proteínov zo vzoriek C. elegans

Ultrazvukovú lýzu a extrakciu proteínov z hlíst C. elegans možno vykonať podľa rôznych protokolov. Nižšie uvádzame niekoľko spoľahlivých a rýchlych protokolov lýzy na dosiahnutie reprodukovateľných výsledkov extrakcie proteínov.

Rýchla príprava cytosolového extraktu z hlíst C. elegans sonikáciou

Pomocou nasledujúceho protokolu môžete pripraviť lyzáty C. elegans za menej ako 30 minút.
Odber C. elegans
Vyberte požadované hlísty C. elegans do skúmavky s objemom 1,5ml s fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS) alebo ich zmyte z platne pomocou 1,5ml PBS. Centrifugujte 1min pri 2000rpm, aby sa vytvoril pelet.  Vzorky neustále uchovávajte na ľade.
Potom hlísty dvakrát premyte PBS.
Následne hlísty dvakrát premyte ddH₂O.
Resuspendujte hlísty v najmenej 500ul homogenizačného pufra (HB). Vzorky hlíst sú teraz pripravené na ultrazvukovú lýzu.
Na dosiahnutie vyššej kvality proteínového extraktu môžete znížiť bakteriálnu kontamináciu premytím hlíst v PBS a v sterilnej ultračistej vode (ddH₂O), vždy počas 5min, alebo vykonať flotáciu v sacharóze. Vzorky hlíst nepretržite uchovávajte na ľade.

Protokol ultrazvukovej lýzy C. elegans

• Ultrazvukové zariadenie pripravte vopred, aby bol ultrazvukový homogenizátor pripravený na použitie (namontovaná sonda, vopred nastavený program sonikácie). 

Ak je váš sonikátor upevnený na stojane, umiestnite ľadový kúpeľ so skúmavkami so vzorkami pod ultrazvukovú sondu a zasuňte ultrazvukovú sondu do 1,5ml skúmavky.

• Pri lýze C. elegans pomocou UP200St alebo UP200Ht by sa sonikácia mala vykonávať s mikrohrotom (napr. 2mm sonda S26d2; pozri obrázok vľavo) pri 40% amplitúde počas 1sec s prestávkami 30sec medzi impulzmi. Na lýzu C. elegans je ideálnych 5 sonikačných cyklov, každý v trvaní 1 sekundy, s prestávkami 30sec. Ak vykonávate lýzu prvýkrát, môžete po každom impulze pomocou mikroskopu skontrolovať priebeh lýzy v malých alikvotných podieloch vzorky.
• Lýza je úspešne dokončená, keď sú červy rozrušené. Nadmerná sonikácia vedie k rozpadu jadier a prejavuje sa tým, že vzorka sa stáva viskóznou alebo pení. Aby ste zabránili degradácii vzorky, v prípade potreby použite viac impulzov. Na získanie vysokokvalitných proteínových extraktov nepredlžujte trvanie jednotlivých cyklov ultrazvukových impulzov.
• Vyčírite bunkový lyzát centrifugáciou ultrazvukom lyzovaných červov pri 14 000rpm počas 10min pri 4ºC.
• Potom preneste supernatant do novej skúmavky a pripravte ho na imunoprecipitáciu alebo iné analýzy.

Poznámka k homogenizačnému pufru: Homogenizačný pufor pre vyššie uvedený protokol ultrazvukovej lýzy pripravte takto:

Vysokokapacitná lýza C. elegans v 96-jamkových platničkách pomocou sonikátora platničiek UIP400MTP

Lýza C. elegans (dospelé hlístovce)
UIP400MTP 80% amplitúda, 20 cyklov (každý sonikačný cyklus: 30 sec ZAPNUTÉ, 30 sec VYPNUTÉ)
Lyzačný pufor:

• Možnosť 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Možnosť 2) na koimunoprecipitáciu (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (kompletný koktail inhibítorov proteináz)

Vysokokapacitná fragmentácia DNA
DNA C. elegans (dospelé hlístovce) 200–300bp: sonikátor platničiek UIP400MTP – nastavte 80% amplitúdu, 30 impulzov – každý 30sec zapnutý, 30sec vypnutý

Sonikátor platničiek UIP400MTP na vysokokapacitnú prípravu vzoriek rovnomerne sonikuje vzorky vo viacjamkových, mikrotitračných a 96-jamkových platničkách

Ultrazvuková lýza C. elegans na analýzy kvantitatívnej afinitnej purifikácie

Čerstvé embryá C. elegans (∼2 milióny na replikát) sa získali v troch biologických replikátoch ošetrením mladých gravidných hermafroditov bieliacim roztokom a sonikovali sa na ľade (cyklus: 0,5 s, amplitúda: 40–45%, 5 impulzov/séria, 5 sérií, interval medzi sériami: 30 s; ultrazvukovým procesorom UP200S s mikrohrotom S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) v lyzačnom pufri (celkový objem: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycerolu, zmes inhibítorov proteáz, 0,1% náhrady Nonidet P-40). Po sonikácii sa pridala náhrada Nonidet P-40 až do koncentrácie 1% a lyzáty sa inkubovali pri otáčaní skúmaviek cez ich konce pri 4°C počas 30 min, po čom nasledovala centrifugácia pri 20 000 × g počas 20 min pri 4°C. Vyčírený lyzát sa potom odsal bez narušenia vrchnej lipidovej vrstvy a rozdelil na dve polovice, z ktorých sa jedna pridala k agarózovým guľôčkam s anti-GFP a druhá k blokovaným kontrolným guľôčkam (40–50 μl). Po otáčaní skúmaviek cez ich konce pri 4°C počas 60–90 min sa guľôčky raz premyli lyzačným pufrom obsahujúcim 0,1% náhrady Nonidet P-40 a následne sa dvakrát premyli buď pufrom I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), alebo pufrom II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), alebo oboma. Pri pull-down analýzach GFP:MBK-2 sa vykonali dva samostatné experimenty s rôznymi podmienkami premývania. Proteíny sa eluovali orbitálnym trepaním v 50 μl 6 m močoviny/2 M tiomočoviny pri izbovej teplote. Pri pull-down experimentoch MBK-1::GFP sa proteíny eluovali dvakrát trepaním v 50μl 8 m guanidíniumchloridu pri 90°C, po čom nasledovalo zrážanie etanolom. Eluované proteínové vzorky sa potom podrobili štiepeniu v roztoku.
(porov. Chen et al., 2016)

Ultrazvuková homogenizácia a lýza červov

Na lýzu C.elegans a extrakciu proteínov sa pre každú vzorku zozbieralo 30 000 hlístovcov v príslušnom štádiu, ktoré sa premyli ľadovo chladným médiom S-basal, skoncentrovali centrifugáciou pri 1500 rpm počas 2 min., šesťkrát premyli ľadovo chladným médiom S-basal na odstránenie zvyškových baktérií a potom uchovávali na ľade až do použitia. Na extrakciu proteínov sa dospelé červy nesúce vajíčka nechali po poslednom premytí médiom S-basal vytvoriť kompaktný sediment. Sedimenty červov sa potom resuspendovali v 1 ml ľadovo chladného extrakčného tlmivého roztoku [20 mM fosforečnan draselný, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibítory proteáz (Sigma P2714)] a okamžite sa spracovali.
∼30 000 dospelých červov nesúcich vajíčka (čo zodpovedá ∼100 mg mokrej hmotnosti) sa sonikovalo na ľade pomocou sondového ultrazvukového prístroja (napr. UP50H s mikrohrotom MS2) pri 40% amplitúde počas 10 cyklov s 3 sek. zapnutia a 30 sek. vypnutia v 1 ml ľadovo chladného extrakčného tlmivého roztoku. (porov. Baskharan et al. 2012)

Ultrazvuková extrakcia lipidov z C. elegans

V lipidomike, odvetví metabolomiky, sa charakterizuje a analyzuje súbor lipidov biologických systémov. C. elegans sa v lipidomike široko využívajú na skúmanie interakcií metabolických lipidov a ich účinkov na zdravie a dĺžku života.
Ultrazvuková lýza a extrakcia sa používajú na uvoľnenie lipidov, ako sú sfingolipidy, z embryí, lariev a dospelých červov C. elegans. Sonikácia sa používa na prípravu homogenátov červov a následne na extrakciu lipidov zo vzorky.
Protokol ultrazvukovej extrakcie lipidov z C. elegans
Rozmrazte sediment C. elegans na ľade a resuspendujte ho v 0.5 ml ultračistej vody. 
Sonikujte vzorky C. elegans v skúmavkách s objemom 1,5mL, pričom vzorky nepretržite udržiavajte na ľade.
Sonikáciu možno vykonávať pomocou sondového ultrazvukového prístroja, ako je UP200Ht, ultrazvukovej jednotky na prípravu vzoriek VialTweeter (súčasná sonikácia 10 vzoriek) alebo prístroja UIP400MTP (na sonikáciu viacjamkových platničiek, napríklad 96-jamkových platničiek).
Na ultrazvukovú lýzu pomocou UP200Ht použite mikrohrot S26d2. V digitálnom menu vopred nastavte režim ultrazvukových cyklov. Nastavte amplitúdu na 10% a režim sonikácie na 20 cyklov s 2 sek. impulzmi a prestávkou 30 sek. medzi jednotlivými sériami ultrazvukových pulzácií.
Preneste supernatanty do sklenených skúmaviek so skrutkovacím uzáverom. 
Vykonajte Folchovu extrakciu pridaním 1 ml ultračistej vody do každej sklenenej skúmavky a následným pridaním 6 ml zmesi chloroformu a metanolu (pomer = 2:1) do každej sklenenej skúmavky.
Každú sklenenú skúmavku premiešajte na vortexovom miešadle štyrikrát po 30 sek. 
Centrifugujte skúmavky pri 1 258 x g počas 15 min (Eppendorf, 5810 R), aby sa ďalej zlepšilo oddelenie fáz. 
Preneste spodnú hydrofóbnu frakciu do čistej sklenenej skúmavky pomocou sklenenej Pasteurovej pipety. 
Vysušte spodnú hydrofóbnu frakciu v prúde dusíka v dusíkovom odparovači. 
Vysušený sediment uchovávajte až do použitia v mrazničke pri -80 °C. 


Ultrazvuková príprava lyzátov červov

Lyzát červov: Červy v štádiu L4 sa zozbierali a trikrát premyli tlmivým roztokom M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl a 0,87 mM MgSO₄) s cieľom odstrániť všetky baktérie. Po odstránení čo najväčšieho množstva pufra M9 boli červy resuspendované v lyzačnom pufri: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-glycerolfosfát, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorid sodný, 1 mM ortovanadičnan sodný, 5 mM pyrofosforečnan sodný, 0,2 mM fenylmetánsulfonylfluorid a inhibítor proteáz. Červy boli trikrát zmrazené v kvapalnom dusíku a rozmrazené pri 37°C, potom boli sonikované na suchom ľade pomocou ultrazvukovej jednotky VialTweeter na súčasnú prípravu 10 skúmaviek so vzorkami. Sonikácia prebiehala pri 50% amplitúde v 10 cykloch po 2 sekundy s 30-sekundovou prestávkou medzi sonikačnými impulzmi. Následne boli vzorky centrifugované pri 12 000 rpm a 4°C počas 15 min. Supernatant bol odobratý a uskladnený pri -70°C. Alikvotná časť sa použila na kvantifikáciu proteínov Bradfordovou metódou.
Stanovenie celkového glutatiónu, GSH a GSSG: Na kvantifikáciu glutatiónu boli lyzáty pripravené a stanovenie vykonané v ten istý deň. Larvy L4 kŕmené glukózou a kontrolné larvy L4 boli zozbierané a trikrát premyté pufrom M9. Po odstránení čo najväčšieho množstva pufra M9 boli červy resuspendované v ľadovo studenej kyseline metafosforečnej (5% w/v), potom boli sonikované v ľade pomocou ultrazvukového zariadenia VialTweeter pri 50% amplitúde v desiatich sonikačných cykloch po 2 sekundy s 30-sekundovou prestávkou medzi jednotlivými cyklami. Následne boli centrifugované pri 12 000 rpm a 4 ̊C počas 15 min.
(porov. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Príprava vzoriek C. elegans pred imunoprecipitáciou a Western blottingom

V stručnosti, na prípravu embryonálnych extraktov boli larvy C. elegans v štádiu L1 kultivované do dospelosti vo veľkoobjemových kvapalných kultúrach v médiu S. Embryá boli zozbierané štandardnou metódou s bieliacim roztokom a suspendované v lyzačnom pufri (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glycerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 zmes inhibítorov proteáz a 1􏰅 zmes inhibítorov fosfatáz I a II), rýchlo zmrazené v kvapalnom dusíku a lyzované ultrazvukovým rozrušením buniek pomocou ultrazvukového zariadenia s mikrohrotom, ako je UP200Ht s S26d2, 10 impulzmi počas 10 s pri 30% amplitúde. Ak je potrebné pripraviť väčší počet vzoriek, odporúčajú sa ultrazvukové zariadenie VialTweeter alebo ultrazvukové zariadenie na spracovanie viacerých vzoriek UIP400MTP pre doštičky s jamkami. Po sonikácii boli extrakty predbežne prečistené centrifugáciou pri 30 000g počas 20 min pri 4°C. Predbežne prečistený extrakt (300µg celkového proteínu) bol inkubovaný so 40µ􏰂g afinitne purifikovanej protilátky anti-CDC-25.1 (táto štúdia) zosieťovanej s proteínom A na agaróze, alebo sa ako kontrola použilo podobné množstvo králičieho imunoglobulínu (Ig)G zosieťovaného s proteínom A na agaróze, v celkovom objeme 200µl lyzačného pufra obsahujúceho 1% NP-40, ktorého pridanie znížilo nešpecifickú väzbu proteínov na matricu. Vzorky boli otáčané počas 1 h pri 4°C, guľôčky boli trikrát premyté lyzačným pufrom a eluované pomocou 30µl glycínu/HCl a 200 mM NaCl, pH 2,2. Po imunoprecipitácii boli eluáty zriedené v 30µ􏰂l vzorkového pufra s SDS, zahrievané na 95°C počas 4 min a na SDS-PAGE sa zvyčajne nanášali 3% celkového množstva pre vstupnú vzorku a 30% pre eluáty. Nasledoval Western blotting s protilátkami anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubikvitín (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) alebo anti-􏰁β-aktín (1:2000). Ak extrakty neboli podrobené imunoprecipitácii, rovnaké množstvo celkového proteínu získaného z týchto extraktov bolo resuspendované vo vzorkovom pufri s SDS, zahriate na 95°C a potom priamo nanesené na SDS-PAGE a analyzované Western blottingom. (porov. Segref et al. 2020)

Ultrazvuková lýza s presnou reguláciou teploty

Presná a spoľahlivá regulácia teploty je pri manipulácii s biologickými vzorkami kľúčová. Vysoké teploty spúšťajú tepelne indukovanú degradáciu proteínov vo vzorkách.
Sonikácia vytvára teplo rovnako ako všetky mechanické techniky prípravy vzoriek. Pri použití zariadenia VialTweeter však možno teplotu vzoriek dobre regulovať. Predstavujeme vám rôzne možnosti monitorovania a regulácie teploty vašich vzoriek počas ich prípravy na analýzu pomocou zariadení VialTweeter a VialPress.

1. Monitorovanie teploty vzorky: Ultrazvukový procesor UP200St, ktorý poháňa VialTweeter, je vybavený inteligentným softvérom a pripojiteľným snímačom teploty. Pripojte snímač teploty k UP200St a vložte hrot snímača teploty do jednej zo skúmaviek so vzorkami. Pomocou digitálneho farebného dotykového displeja môžete v ponuke UP200St nastaviť konkrétny teplotný rozsah pre sonikáciu vašich vzoriek. Sonikátor sa automaticky zastaví po dosiahnutí maximálnej teploty a zostane pozastavený, kým teplota vzorky neklesne na dolnú hodnotu nastaveného teplotného rozdielu ∆. Potom sa sonikácia automaticky znovu spustí. Táto inteligentná funkcia zabraňuje degradácii vyvolanej teplom.
2. Blok VialTweeter možno vopred ochladiť. Vložte blok VialTweeter (iba sonotródu bez meniča!) do chladničky alebo mrazničky, aby sa titánový blok vopred ochladil, čo pomáha oddialiť nárast teploty vo vzorke. Ak je to možné, možno vopred ochladiť aj samotnú vzorku.
3. Na chladenie počas sonikácie použite suchý ľad. Použite plytkú tácku naplnenú suchým ľadom a umiestnite VialTweeter na suchý ľad, aby sa teplo mohlo rýchlo odvádzať.

Nájdite optimálny ultrazvukový dezintegrátor buniek pre vašu aplikáciu lýzy

Hielscher Ultrasonics je výrobca s dlhoročnými skúsenosťami s výrobou vysokovýkonných ultrazvukových dezintegrátorov buniek a homogenizátorov pre laboratórne, stolové a priemyselné systémy. Veľkosť vašej bakteriálnej bunkovej kultúry, váš výskumný alebo výrobný cieľ a objem buniek, ktorý sa má spracovať za hodinu alebo deň, sú základnými faktormi pri hľadaní správneho ultrazvukového dezintegrátora buniek pre vašu aplikáciu.
Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne riešenia na súčasnú sonikáciu viacerých vzoriek (až 10 liekoviek), ako aj na hromadné spracovanie vzoriek (t. j. mikrotitračné platničky / 96-jamkové platničky), od klasického laboratórneho sondového sonikátora s rôznymi úrovňami výkonu od 50 do 400 wattov až po plne priemyselné ultrazvukové procesory s výkonom až 16 000 wattov na jednotku na komerčnú dezintegráciu buniek a extrakciu proteínov vo veľkovýrobe. Všetky sonikátory Hielscher sú skonštruované na prevádzku 24/7/365 pri plnom zaťažení. Robustnosť a spoľahlivosť sú základnými vlastnosťami našich ultrazvukových zariadení.
Všetky digitálne ultrazvukové homogenizátory sú vybavené inteligentným softvérom, farebným dotykovým displejom a automatickým zaznamenávaním údajov, vďaka čomu je ultrazvukové zariadenie pohodlným pracovným nástrojom v laboratóriách a výrobných prevádzkach.
Dajte nám vedieť, aký druh buniek, aký objem, ako často a s akým cieľom musíte spracovávať svoje biologické vzorky. Odporučíme vám najvhodnejší ultrazvukový dezintegrátor buniek pre požiadavky vášho procesu.

Nasledujúca tabuľka poskytuje prehľad o približnej spracovateľskej kapacite našich ultrazvukových systémov od kompaktných ručných homogenizátorov a sonikátorov na viacero vzoriek až po priemyselné ultrazvukové procesory na komerčné aplikácie: