Bunková lyza buniek BL21 ultrazvukom
BL21 Bunky pre proteínovú expresiu
BUNKA BL21 je chemicky kompetentný bakteriálny kmeň E. coli vhodný na transformáciu a expresiu bielkovín na vysokej úrovni pomocou indukčného systému T7 RNA polymerázy-IPTG. Bunky BL21 umožňujú vysokoúcnosť proteínovej expresie akéhokoľvek génu, ktorý je pod kontrolou propagátora T7. Kmeň E. coli BL21(DE3) je kmeň na báze polymerázy T7 polymerázy v kombinácii s produkčnými expresívnymi vektormi T7 a vo veľkej miere sa používa v laboratóriách a priemysle na výrobu rekombinantných proteínov. V BL21(DE3) sa expresia génu kódujúceho rekombinantný proteín prepíše chromozomálne kódovaná T7 RNA polymeráza (T7 RNAP), ktorá sa prepisuje osemkrát rýchlejšie ako konvenčná E. coli RNAP. To robí kmeň BL21 (DE3) vysoko efektívne a premení jeho do jedného z najviac preferovaných proteínovej expresie bunkových systémov.
Protokol pre ultrazvukové lyzýzy a extrakcie bielkovín z BUNIEK BL21
Bunková lýza buniek BL21 sa väčšinou vykonáva pomocou ultrazvukom v kombinácii s lauroyl sarkoozinátom sodným (tiež známym ako sarkosyl) ako lýza tlmivého roztoku. Výhody ultrazvukové bunky narušenie a extrakcia bielkovín spočíva v spoľahlivosti, reprodukovateľnosť, rovnako ako jednoduché, bezpečné a rýchle fungovanie ultrazvukom. Nižšie uvedený protokol dáva krok-za-krokom smer pre ultrazvukové BL21 bunkovej lysis:
Ultrazvukový bunkový disruptor UP200St s mikro-tip S26d2 pre lyzu a extrakciu bielkovín
- Aby sa odstránili chaperónové proteíny, bakteriálne pelety BL21 boli resuspendované v 50 ml ľadovo studeného tlmivého roztoku Tris-EDTA (STE) sodným (STE) (pozostávajúci z 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl doplnených 100 mM PMSF).
- Pridá sa 500 ul lyzozýmu (10 mg/ ml) a bunky sa inkubujú na ľade 15 minút.
- Potom sa pridá 500 ul DTT a 7 ml sarkosylu (10% (w/v) v tlmivom roztoku STE).
- Je nevyhnutné udržiavať všetky čistiarenné nárazníky za studena a neustále uchovávať vzorky na ľade. Všetky purifikačné kroky by sa mali vykonať v chladnej miestnosti, ak je to možné.
- V prípade ultrazvukovej lyzy a extrakcie proteínov sa vzorky VialTweeter MultiSample Ultrazvukom 4 x 30 sekúnd pri 100% amplitúde s 2 min intervalom medzi každou sonikáciou. Alternatívne ultrazvukový homogenizátor typu sondy s mikroprepitom napr. UP200Ht s S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. pauza medzi ultrazvukové cykly, 80% amplitúda) môžu byť použité.
- V prípade ďalších purifikačných krokov sa vzorky musia uchovávať na ľade alebo alternatívne skladovať pri teplote -80 °C až do ďalšieho spracovania.
Ultrazvuková lyzóza v rámci prescise regulácie teploty
Presná a spoľahlivá regulácia teploty je rozhodujúca pri manipulácii s biologickými vzorkami. Vysoké teploty iniciujú tepelne indukovanej degradácie proteínov vo vzorkách.
Ako všetky techniky mechanickej prípravy vzoriek, ultrazvukom vytvára teplo. Avšak, teplota vzoriek môže byť dobre kontrolovaná pri použití VialTweeter. Predstavujeme vám rôzne možnosti pre monitorovanie a kontrolu teploty vašich vzoriek pri ich príprave s VialTweeter a VialPress pre analýzu.
- Monitorovanie teploty vzorky: Ultrazvukový procesor UP200St, ktorý poháňa VialTweeter, je vybavený inteligentným softvérom a príkonovým teplotným snímačom. Zapojte snímač teploty do UP200St a zasuňte špičku snímača teploty do jednej zo skúmaviek so vzorkou. Prostredníctvom digitálneho farebného dotykového displeja môžete nastaviť v ponuke UP200St špecifický teplotný rozsah pre vašu sonikáciu vzoriek. Ultrazvukom sa automaticky zastaví, keď sa dosiahne maximálna teplota, a pozastaví sa, až kým teplota vzorky nedosiahne nižšiu hodnotu nastavenej teploty ∆. Potom sa ultrazvukom spustí automaticky znova. Táto inteligentná funkcia zabraňuje degradácii vyvolanej teplom.
- Blok VialTweeter je možné predchladiť. Vložte blok VialTweeter (iba sonotróda bez prevodníka!) do chladničky alebo mrazničky, aby sa predchladil titánový blok, ktorý pomáha odložiť zvýšenie teploty vo vzorke. Ak je to možné, vzorka sama o sebe môže byť pre-chladené taky.
- Použite suchý ľad vychladnúť počas ultrazvukom. Použite plytký podnos naplnený suchým ľadom a položte VialTweeter na ľad, aby sa teplo rýchlo rozptýlilo.
Zákazníci po celom svete používajú VialTweeter a VialPress pre ich každodennú prípravu vzoriek práce v biologických, biochemických, lekárskych a klinických laboratórií. Inteligentný softvér a regulácia teploty procesora UP200St, teplota je spoľahlivo regulovaná a tepelne vyvolaná degradácia vzorky sa zabránilo. Ultrazvukový príprava vzoriek s VialTweeter a VialPress prináša vysoko spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky!
Nájdite optimálny ultrazvukový disruptor pre vašu aplikáciu Lysis
Hielscher Ultrazvukom je dlhoročný skúsený výrobca vysokovýkonných ultrazvukových bunkových disruptorov a homogenizátorov pre laboratóriá, bench-top a priemyselné systémy stupnice. Vaša veľkosť bakteriálnej bunkovej kultúry, váš výskum alebo výrobný cieľ a objem buniek na spracovanie za hodinu alebo deň sú základnými faktormi na nájdenie správneho ultrazvukového bunkového disruptora pre vašu aplikáciu.
Hielscher Ultrazvukom ponúka rôzne riešenia pre simultánne ultrazvukom multi-vzorky (až 10 injekčných liekoviek s VialTweeter) a hmotnostné vzorky (tj mikrotiter dosky / ELISA dosky s UIP400MTP), rovnako ako klasický sonda-typ laboratórne ultrazvukom s rôznymi úrovňami výkonu od 50 do 400 wattov na plne priemyselné ultrazvukové procesory s až 16.000wattov na jednotku pre komerčné narušenie buniek a extrakcie bielkovín vo veľkej výrobe. Všetky Hielscher ultrazvukom sú postavené pre 24/7/365 prevádzku pri plnom zaťažení. Robustnosť a spoľahlivosť sú základnými funkciami našich ultrazvukových zariadení.
Všetky digitálne ultrazvukové homogenizátory sú vybavené inteligentným softvérom, farebným dotykovým displejom a automatickým protokolom dát, vďaka ktorému sa ultrazvukové zariadenie mení na pohodlný pracovný nástroj v laboratórnych a výrobných zariadeniach.
Dajte nám vedieť, aký druh buniek, aký objem, s akou frekvenciou a s akým cieľom musíte spracovať svoje biologické vzorky. Odporúčame vám najvhodnejší ultrazvukový bunkový disruptor pre vaše požiadavky na proces.
Nižšie uvedený stôl vám dáva údaj o približnej spracovateľnosti našich ultrazvukových systémov od kompaktných ručných homogenizátorov a multisample ultrasonicators až po priemyselné ultrazvukové procesory pre komerčné aplikácie:
| Objem šarže | prietok | Odporúčané Devices |
|---|---|---|
| 96-dobre / mikrotiter dosky | neuv | UIP400MTP (UIP400MTP) |
| 10 injekčných liekoviek à 0,5 až 1,5 ml | neuv | VialTweeter, UP200St |
| 0.01 až 250 ml | 5 až 100 ml/min. | UP50H |
| 0.01 až 500 ml | 10 až 200mL/min | UP100H |
| 10 až 2000mL | 20 až 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 až 20L | 02 až 4 l / min | UIP2000hdT |
| 10 až 100L | 2 až 10 l / min | UIP4000hdT |
| neuv | 10 až 100 l / min | UIP16000 |
| neuv | väčšia | strapec UIP16000 |
Kontaktuj nás! / Opýtajte sa nás!
Ultrasonicator UP200Ht s 2mm mikrotipom S26d2 na ultrazvuk malých vzoriek
Literatúra/referencie
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Fakty stojí za to vedieť
Baktérie Escherichia Coli
Escherichia coli je typ baktérie, ktorý je non-spóry-tvárnenie, Gram-negatívne a je charakterizovaný svojou formou rovnej tyče. Baktérie E.coli sú prítomné v životnom prostredí, potravinách a črevách ľudí a zvierat. E. coli je zvyčajne motile pomocou peritrichous flagella, ale tam sú nonmotile typy, taky. E.coli sú takzvané fakultatívne anaeróbne chemoorganotroph organizmy, čo znamená, že sú schopné respiračného aj fermentačného metabolizmu. Väčšina typov E.coli je benígna a plní užitočné funkcie v tele, napr.
Baktérie Escherichia coli bunky takzvaného typu B sú osobitnou kategóriou kmeňov E.coli, ktoré sú široko používané vo výskume na skúmanie mechanizmov, ako je citlivosť bakteriofágu alebo systémy na úpravu obmedzení. Okrem toho sa baktérie E.coli oceňujú ako spoľahlivý pracovný kretén pre expresiu bielkovín v laboratóriách biotechnológie a vedy o živote. Napríklad E.coli sa používajú na syntetizáciu zlúčenín, ako sú bielkoviny a oligosacharidy v priemyselnom meradle. Vzhľadom na špecifické vlastnosti, ako je nedostatok proteázy, nízka produkcia acetátu na vysokej úrovni glukózy a zvýšená priepustnosť, E. coli B bunky sú najčastejšie používané hostiteľské bunky na výrobu geneticky upravených proteínov.
Rekombinantný proteín
Rekombinantné proteíny (rProt) získavajú významný význam v rôznych odvetviach, a to aj v chemickej výrobe, farmaceutickej, kozmetickej, humánnej a živočíšnej medicíne, poľnohospodárstve, potravinárstve, ako aj v priemysle spracovania odpadu.
Produkcia rekombinantného proteínu si vyžaduje použitie expresného systému. Ako expresívne bunkové systémy na produkciu rekombinantnej DNA sa môžu použiť prokaryotické aj eukaryotické bunky. Zatiaľ čo bakteriálne bunky sú najviac široko používané pre expresiu bielkovín v dôsledku faktorov, ako sú nízke náklady, ľahká škálovateľnosť a jednoduché mediálne podmienky, cicavce, kvasinky, riasy, hmyz a bunky-free systémy sú stanovené alternatívy. Typ proteínu, funkčná aktivita, ako aj požadovaná výťažnosť vyjadreného proteínu ovplyvňujú výber bunkového systému používaného na expresiu proteínov.
Na vyjadrenie rekombinantného proteínu musí byť konkrétna bunka transfikená vektorom DNA obsahujúcim šablónu rekombinantnej DNA. Bunky transfected so šablónou sú potom kultivované. V dôsledku bunkového mechanizmu bunky prepisujú a prekladajú proteín záujmu, čím produkujú cielený proteín.
Keďže vyjadrené proteíny sú zarezané do bunkovej matrice, bunka musí byť lyzovaná (narušená a zlomená), aby sa uvoľnili proteíny. V nasledujúcom kroku čistenia sa proteín separuje a čistí.
Prvým rekombinantným proteínom použitým pri liečbe bol rekombinantný ľudský inzulín v roku 1982. V súčasnosti sa na celom svete vyrába viac ako 170 druhov rekombinantných bielkovín na liečebné ošetrenie. Bežne používané rekombinantné proteíny používané v medicíne sú napríklad rekombinantné hormóny, interferóny, interleukíny, rastové faktory, faktory nádorovej nekrózy, faktory zrážania krvi, trombolytické lieky a enzýmy na liečbu veľkých ochorení, ako je cukrovka, trpaslík, infarkt myokardu, kongestívne srdcové zlyhanie, mozgová apoplexia, roztrúsená skleróza, neutropénia, trombocytopénia, anémia, hepatitída, reumatoidná artritída, astma, Crohnova choroba a liečba rakoviny. (porovnaj Phuc V. Pham, v Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Vysokovýkonné ultrazvukom! Produktový rad Hielscher pokrýva celé spektrum od kompaktného laboratórneho ultrasonicatoru cez stolové jednotky až po plnoindustriálne ultrazvukové systémy.