Lýza buniek BL21 ultrazvukom

Bunky BL21 sú kmeňom E. coli, ktorý sa široko používa vo výskumných laboratóriách, biotechnológii a priemyselnej výrobe vďaka svojej schopnosti vysoko účinnej expresie proteínov. Ultrazvuková dezintegrácia buniek, lýza a extrakcia proteínov predstavujú bežnú metódu izolácie a získavania cieľových proteínov z vnútorného priestoru buniek BL21. Pôsobenie ultrazvuku úplne rozruší bunku a uvoľní všetky zachytené proteíny, čím sprístupní 100% proteínov.

Bunky BL21 na expresiu proteínov

Bunky BL21 predstavujú chemicky kompetentný bakteriálny kmeň E. coli vhodný na transformáciu a vysokú úroveň expresie proteínov pomocou indukčného systému T7 RNA polymeráza–IPTG. Bunky BL21 umožňujú vysoko účinnú expresiu proteínov z akéhokoľvek génu, ktorý je pod kontrolou promótora T7. Kmeň E. coli BL21(DE3) je kmeň na produkciu proteínov založenú na T7 RNA polymeráze, ktorý sa kombinuje s expresnými vektormi založenými na promótore T7 a široko sa používa v laboratóriách a priemysle na produkciu rekombinantných proteínov. Pri BL21(DE3) vykonáva transkripciu pri expresii génu kódujúceho rekombinantný proteín chromozomálne kódovaná T7 RNA polymeráza (T7 RNAP), ktorá transkribuje osemkrát rýchlejšie než bežná RNAP E. coli. Vďaka tomu je kmeň BL21(DE3) vysoko účinný a patrí medzi najpreferovanejšie bunkové systémy na expresiu proteínov.

Protokol ultrazvukovej lýzy a extrakcie proteínov z buniek BL21

Lýza buniek BL21 sa väčšinou vykonáva ultrazvukom v kombinácii s lauroylsarkozinátom sodným (známym aj ako sarkosyl) ako lyzačným pufrom. Výhody ultrazvukovej dezintegrácie buniek a extrakcie proteínov spočívajú v spoľahlivosti, reprodukovateľnosti, ako aj v jednoduchej, bezpečnej a rýchlej obsluhe ultrazvukových prístrojov. Nasledujúci protokol poskytuje podrobný návod na ultrazvukovú lýzu buniek BL21:

• Na odstránenie chaperónových proteínov sa bakteriálne pelety BL21 resuspendovali v 50 ml ľadovo studeného pufra Sodium Tris-EDTA (STE) (pozostávajúceho z 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl s prídavkom 100 mM PMSF).
• Potom sa pridá 500 ul lyzozýmu (10 mg/ ml) a bunky sa inkubujú na ľade 15 min.
• Následne sa pridá 500 ul DTT a 7 ml sarkosylu (10% (w/v) pripraveného v pufri STE).
• Je nevyhnutné udržiavať všetky purifikačné pufre ľadovo studené a vzorky neustále uchovávať na ľade. Všetky purifikačné kroky by sa mali podľa možnosti vykonávať v chladiacej miestnosti.



• Na ultrazvukovú lýzu a extrakciu proteínov sa vzorky sonikujú v zariadení VialTweeter MultiSample Ultrasonicator počas 4 x 30 sec pri 100% amplitúde s intervalom 2 min medzi jednotlivými sonikáciami. Alternatívne možno použiť sondový ultrazvukový homogenizátor s mikrohrotom, napr. UP200Ht s S26d2 (3 x 30 sec, prestávka 2 min. medzi ultrazvukovými cyklami, 80% amplitúda).
• Pri ďalších purifikačných krokoch sa vzorky musia uchovávať na ľade alebo sa alternatívne musia skladovať pri -80°C až do ďalšieho spracovania.

Ultrazvuková lýza pri presnej regulácii teploty

Presná a spoľahlivá regulácia teploty je pri manipulácii s biologickými vzorkami kľúčová. Vysoké teploty vyvolávajú tepelnú degradáciu proteínov vo vzorkách.
Tak ako všetky mechanické techniky prípravy vzoriek, aj sonikácia vytvára teplo. Pri použití zariadenia VialTweeter však možno teplotu vzoriek dobre regulovať. Predstavujeme vám rôzne možnosti monitorovania a regulácie teploty vzoriek počas ich prípravy na analýzu pomocou zariadení VialTweeter a VialPress.

1. Monitorovanie teploty vzorky: Ultrazvukový procesor UP200St, ktorý poháňa VialTweeter, je vybavený inteligentným softvérom a pripojiteľným snímačom teploty. Pripojte snímač teploty k UP200St a vložte jeho hrot do jednej zo skúmaviek so vzorkami. Prostredníctvom digitálneho farebného dotykového displeja môžete v ponuke UP200St nastaviť konkrétny teplotný rozsah na sonikáciu vzorky. Ultrazvukový prístroj sa automaticky zastaví po dosiahnutí maximálnej teploty a zostane pozastavený, kým teplota vzorky neklesne na dolnú hodnotu nastaveného teplotného rozsahu ∆. Potom sa sonikácia opäť automaticky spustí. Táto inteligentná funkcia zabraňuje degradácii vyvolanej teplom.
2. Blok VialTweeter možno vopred ochladiť. Vložte blok VialTweeter (iba sonotródu bez meniča!) do chladničky alebo mrazničky, aby sa titánový blok vopred ochladil, čo pomáha oddialiť nárast teploty vo vzorke. Ak je to možné, možno vopred ochladiť aj samotnú vzorku.
3. Na chladenie počas sonikácie použite suchý ľad. Použite plytkú nádobu naplnenú suchým ľadom a položte VialTweeter na ľad, aby sa teplo mohlo rýchlo odvádzať.

Zákazníci na celom svete používajú VialTweeter a VialPress pri každodennej príprave vzoriek v biologických, biochemických, medicínskych a klinických laboratóriách. Vďaka inteligentnému softvéru a regulácii teploty procesora UP200St je teplota spoľahlivo regulovaná a predchádza sa degradácii vzoriek vyvolanej teplom. Ultrazvuková príprava vzoriek pomocou VialTweeter a VialPress poskytuje vysoko spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky!
 

Nájdite optimálny ultrazvukový dezintegrátor pre svoju aplikáciu lýzy

Hielscher Ultrasonics je výrobca s dlhoročnými skúsenosťami s výrobou vysokovýkonných ultrazvukových bunkových dezintegrátorov a homogenizátorov pre laboratóriá, stolové systémy a systémy priemyselného rozsahu. Veľkosť vašej bakteriálnej bunkovej kultúry, cieľ vášho výskumu alebo výroby a objem buniek, ktorý sa má spracovať za hodinu alebo deň, sú zásadnými faktormi pri hľadaní vhodného ultrazvukového bunkového dezintegrátora pre vašu aplikáciu.
Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne riešenia na súčasnú sonikáciu viacerých vzoriek (až 10 liekoviek pomocou VialTweeter) a hromadné spracovanie vzoriek (t. j. mikrotitračných platničiek / platničiek ELISA pomocou UIP400MTP), ako aj klasické laboratórne ultrazvukové prístroje so sondou s rôznymi úrovňami výkonu od 50 do 400 wattov až po plne priemyselné ultrazvukové procesory s výkonom až 16 000 wattov na jednotku na komerčnú dezintegráciu buniek a extrakciu proteínov vo veľkovýrobe. Všetky ultrazvukové prístroje Hielscher sú skonštruované na prevádzku 24/7/365 pri plnom zaťažení. Robustnosť a spoľahlivosť sú základnými vlastnosťami našich ultrazvukových zariadení.
Všetky digitálne ultrazvukové homogenizátory sú vybavené inteligentným softvérom, farebným dotykovým displejom a automatickým zaznamenávaním údajov, vďaka čomu je ultrazvukové zariadenie praktickým pracovným nástrojom v laboratóriách a výrobných prevádzkach.
Dajte nám vedieť, aký druh buniek, aký objem, ako často a s akým cieľom potrebujete spracovávať svoje biologické vzorky. Odporučíme vám najvhodnejší ultrazvukový bunkový dezintegrátor pre požiadavky vášho procesu.

Nasledujúca tabuľka poskytuje prehľad približnej spracovateľskej kapacity našich ultrazvukových systémov od kompaktných ručných homogenizátorov a ultrazvukových prístrojov na spracovanie viacerých vzoriek až po priemyselné ultrazvukové procesory na komerčné aplikácie:

Literatúra / Referencie

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.