Lýza buniek BL21 ultrazvukom
Bunky BL21 sú kmeň E. coli, ktorý je široko používaný vo výskumných laboratóriách, biotechnológiách a priemyselnej výrobe vďaka svojej schopnosti exprimovať proteíny vysoko efektívne. Ultrazvukové narušenie buniek, lýza a extrakcia proteínov je bežnou metódou izolácie a zberu cieľových proteínov z bunkového vnútra buniek BL21. Ultrazvuk úplne naruší bunku a uvoľní všetky zachytené proteíny, vďaka čomu je k dispozícii 100 % proteínu.
Bunky BL21 pre expresiu proteínov
Bunka BL21 je chemicky kompetentný bakteriálny kmeň E. coli vhodný na transformáciu a expresiu proteínov na vysokej úrovni pomocou indukčného systému T7 RNA polymerázy-IPTG. Bunky BL21 umožňujú vysoko účinnú expresiu proteínov akéhokoľvek génu, ktorý je pod kontrolou promótora T7. Kmeň E. coli BL21 (DE3) je kmeň na výrobu proteínov na báze T7 RNA polymerázy kombinovaný s expresnými vektormi na báze promotora T7 a je široko používaný v laboratóriách a priemysle na výrobu rekombinantných proteínov. V BL21(DE3) je expresia génu kódujúceho rekombinantný proteín transkribovaná chromozomálne kódovanou T7 RNA polymerázou (T7 RNAP), ktorá sa transkribuje osemkrát rýchlejšie ako konvenčná E. coli RNAP. Vďaka tomu je kmeň BL21 (DE3) vysoko účinný a mení ho na jeden z najpreferovanejších bunkových systémov s expresiou proteínov.
Protokol pre ultrazvukovú lýzu a extrakciu proteínov z buniek BL21
Lýza buniek BL21 sa väčšinou vykonáva pomocou ultrazvuku v kombinácii s lauroylsarkozinátom sodným (tiež známym ako sarkosyl) ako lýznym pufrom. Výhody ultrazvukového narušenia buniek a extrakcie proteínov spočívajú v spoľahlivosti, reprodukovateľnosti, ako aj jednoduchej, bezpečnej a rýchlej prevádzke ultrazvukových prístrojov. Nižšie uvedený protokol poskytuje krok za krokom smer pre ultrazvukovú lýzu buniek BL21:
- Na odstránenie proteínov chaperónu boli bakteriálne pelety BL21 resuspendované v 50 ml ľadovo studeného tlmivého roztoku Tris-EDTA (STE) sodného (pozostávajúceho z 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl doplneného o 100 mM PMSF).
- Pridá sa 500 ul lyzozýmu (10 mg/ml) a bunky sa inkubujú na ľade 15 minút.
- Potom sa pridá 500 ul DTT a 7 ml sarkosylu (10 % (m/v) doplnené v tlmivom roztoku STE).
- Je nevyhnutné udržiavať všetky čistiace pufre ľadovo studené a vzorky udržiavať neustále na ľade. Všetky kroky čistenia by sa mali podľa možnosti vykonávať v chladnej miestnosti.
- Na ultrazvukovú lýzu a extrakciu proteínov sa vzorky sonikujú v Viacvzorkový ultrazvuk VialTweeter po dobu 4 x 30 sekúnd pri 100% amplitúde s 2-minútovým intervalom medzi jednotlivými sonikáciami. Alternatívne ultrazvukový homogenizátor sondového typu s mikrohrotom, napr. UP200Ht s S26d2 (3 x 30 sekúnd, 2 min. pauza medzi ultrazvukovými cyklami, 80% amplitúda).
- Pre ďalšie kroky čistenia sa vzorky musia uchovávať na ľade alebo sa alternatívne skladovať pri teplote -80 °C až do ďalšieho spracovania.
Ultrazvukový disruptor buniek UP200St s mikrohrotom S26d2 na lýzu a extrakciu bielkovín
Ultrazvuková lýza pod presnou reguláciou teploty
Presná a spoľahlivá regulácia teploty je rozhodujúca pri manipulácii s biologickými vzorkami. Vysoké teploty iniciujú tepelne indukovanú degradáciu proteínov vo vzorkách.
Ako všetky techniky mechanickej prípravy vzoriek, aj sonikácia vytvára teplo. Teplotu vzoriek je však možné dobre kontrolovať pri použití VialTweeter. Predstavujeme vám rôzne možnosti monitorovania a kontroly teploty vašich vzoriek pri ich príprave pomocou VialTweeter a VialPress na analýzu.
- Monitorovanie teploty vzorky: Ultrazvukový procesor UP200St, ktorý poháňa VialTweeter, je vybavený inteligentným softvérom a zásuvným snímačom teploty. Zapojte snímač teploty do UP200St a vložte hrot snímača teploty do jednej zo skúmaviek na vzorky. Prostredníctvom digitálneho farebného dotykového displeja môžete v ponuke UP200St nastaviť špecifický teplotný rozsah pre sonikáciu vzorky. Ultrazvuk sa automaticky zastaví po dosiahnutí maximálnej teploty a pozastaví sa, kým sample teplota klesne na nižšiu hodnotu nastavenej teploty ∆. Potom sa sonikácia spustí automaticky znova. Táto inteligentná funkcia zabraňuje degradácii spôsobenej teplom.
- Blok VialTweeter je možné predchladiť. Vložte blok VialTweeter (iba sonotrode bez prevodníka!) do chladničky alebo mrazničky, aby sa titánový blok predchladil, pomáha oddialiť nárast teploty vo vzorke. Ak je to možné, samotná vzorka môže byť tiež predchladená.
- Počas sonikácie použite suchý ľad na ochladenie. Použite plytký podnos naplnený suchým ľadom a položte VialTweeter na ľad, aby sa teplo mohlo rýchlo rozptýliť.
Zákazníci na celom svete používajú VialTweeter a VialPress na každodennú prípravu vzoriek v biologických, biochemických, lekárskych a klinických laboratóriách. Inteligentný softvér a regulácia teploty procesora UP200St spoľahlivo reguluje teplotu a zabraňuje tepelnej degradácii vzorky. Ultrazvuková príprava vzoriek pomocou VialTweeter a VialPress poskytuje vysoko spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky!
Nájdite optimálny ultrazvukový disruptor pre vašu aplikáciu lýzy
Hielscher Ultrasonics je dlhoročný skúsený výrobca vysokovýkonných ultrazvukových disruptorov buniek a homogenizátorov pre laboratóriá, stolové a priemyselné systémy. Veľkosť bakteriálnej bunkovej kultúry, váš výskumný alebo výrobný cieľ a objem bunky na spracovanie za hodinu alebo deň sú základnými faktormi na nájdenie správneho ultrazvukového disruptora buniek pre vašu aplikáciu.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne riešenia pre súčasnú sonikáciu viacerých vzoriek (až 10 injekčných liekoviek s VialTweeterom) a hmotnostných vzoriek (t. j. mikrotitračné doštičky / ELISA platne s UIP400MTP), ako aj klasický laboratórny ultrazvuk sondového typu s rôznymi úrovňami výkonu od 50 do 400 wattov až po plne priemyselné ultrazvukové procesory s výkonom až 16 000 wattov na jednotku pre komerčné narušenie buniek a extrakciu proteínov vo veľkej výrobe. Všetky ultrazvukové prístroje Hielscher sú skonštruované pre prevádzku 24/7/365 pri plnom zaťažení. Robustnosť a spoľahlivosť sú základnými vlastnosťami našich ultrazvukových prístrojov.
Všetky digitálne ultrazvukové homogenizátory sú vybavené inteligentným softvérom, farebným dotykovým displejom a automatickým protokolovaním údajov, vďaka čomu sa ultrazvukové zariadenie stáva pohodlným pracovným nástrojom v laboratóriu a výrobných zariadeniach.
Dajte nám vedieť, aký druh buniek, aký objem, s akou frekvenciou a s akým cieľom máte na spracovanie svojich biologických vzoriek. Odporučíme vám najvhodnejší disruptor ultrazvukových buniek pre vaše procesné požiadavky.
Nasledujúca tabuľka vám poskytuje približnú kapacitu spracovania našich ultrazvukových systémov od kompaktných ručných homogenizátorov a ultrazvukových procesorov MultiSample až po priemyselné ultrazvukové procesory pre komerčné aplikácie:
| Objem dávky | Prietok | Odporúčané zariadenia |
|---|---|---|
| 96-jamkové / mikrotitračné platne | N.A. | UIP400MTP |
| 10 injekčných liekoviek s objemom 0,5 až 1,5 ml | N.A. | VialTweeter na UP200St |
| 00,01 až 250 ml | 5 až 100 ml/min | UP50H |
| 001 až 500 ml | 10 až 200 ml/min | UP100H |
| 10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 až 20 l | 00,2 až 4 l/min | UIP2000hdT |
| 10 až 100 l | 2 až 10 l/min | UIP4000hdT |
| N.A. | 10 až 100 l/min | UIP16000 |
| N.A. | väčší | Zhluk UIP16000 |
Kontaktujte nás! / Opýtajte sa nás!
UIP400MTP dosky sonikátor pre vysokovýkonné narušenie buniek v 96-jamkových platniach
ultrazvuk UP200Ht s 2 mm mikrohrotom S26d2 na sonikáciu malých vzoriek
Prečítajte si viac o tom, ako môžete použiť svoj ultrazvukový homogenizátor tkanív na efektívnu a spoľahlivú prípravu tlmivých roztokov!
Fakty, ktoré stoja za to vedieť
Baktérie Escherichia Coli
Escherichia coli je typ baktérie, ktorý netvorí spóry, gramnegatívny a vyznačuje sa formou rovnej tyčinky. Baktérie E. coli sú prítomné v životnom prostredí, potravinách a črevách ľudí a zvierat. E. coli je zvyčajne pohyblivá pomocou peritrichóznych bičíkov, ale existujú aj nepohyblivé typy. E. coli sú takzvané fakultatívne anaeróbne chemoorganotrofné organizmy, čo znamená, že sú schopné dýchacieho aj fermentačného metabolizmu. Väčšina typov E. coli je benígna a plní užitočné funkcie v tele, napr. potláča rast škodlivých bakteriálnych druhov, syntetizuje vitamíny atď.
Bunky baktérií Escherichia coli takzvaného typu B sú špeciálnou kategóriou kmeňov E. coli, ktoré sa vo výskume široko používajú na skúmanie mechanizmov, ako je citlivosť bakteriofágov alebo systémy reštrikcií a modifikácie. Okrem toho sú baktérie E. coli cenené ako spoľahlivý ťažný kôň pre expresiu bielkovín v biotechnologických a biologických laboratóriách. Napríklad E. coli sa používa na syntézu zlúčenín, ako sú proteíny a oligosacharidy v priemyselnom meradle. Vzhľadom na špecifické vlastnosti, ako je nedostatok proteázy, nízka produkcia acetátu pri vysokej hladine glukózy a zvýšená permeabilita, sú B bunky E. coli najčastejšie používanými hostiteľskými bunkami na produkciu geneticky upravených proteínov.
Rekombinantný proteín
Rekombinantné proteíny (rProt) získavajú význam v rôznych odvetviach, vrátane chemickej výroby, farmaceutickej, kozmetickej medicíny, humánnej a živočíšnej medicíny, poľnohospodárstva, potravinárstva a priemyslu spracovania odpadu.
Produkcia rekombinantného proteínu si vyžaduje použitie expresného systému. Ako expresné bunkové systémy na produkciu rekombinantnej DNA sa môžu použiť prokaryotické aj eukaryotické bunky. Zatiaľ čo bakteriálne bunky sa najčastejšie používajú na expresiu proteínov kvôli faktorom, ako sú nízke náklady, ľahká škálovateľnosť a jednoduché podmienky médií, cicavce, kvasinky, riasy, hmyz a bezbunkové systémy sú zavedenými alternatívami. Typ proteínu, funkčná aktivita, ako aj požadovaný výťažok exprimovaného proteínu ovplyvňujú výber bunkového systému použitého na expresiu proteínov.
Na expresiu rekombinantného proteínu musí byť konkrétna bunka transfekovaná vektorom DNA obsahujúcim templát rekombinantnej DNA. Bunky transfekované šablónou sa potom kultivujú. V dôsledku bunkového mechanizmu bunky prepisujú a prekladajú požadovaný proteín, čím produkujú cieľový proteín.
Keď sú exprimované proteíny uväznené v bunkovej matrici, bunka musí byť lyzovaná (narušená a rozbitá), aby sa uvoľnili proteíny. V nasledujúcom kroku čistenia sa proteín oddelí a vyčistí.
Prvým rekombinantným proteínom použitým pri liečbe bol rekombinantný ľudský inzulín v roku 1982. Dnes sa na celom svete vyrába viac ako 170 druhov rekombinantných proteínov na lekárske ošetrenie. Bežne používané rekombinantné proteíny používané v medicíne sú napríklad rekombinantné hormóny, interferóny, interleukíny, rastové faktory, faktory nekrózy nádorov, faktory zrážania krvi, trombolytické lieky a enzýmy na liečbu závažných chorôb, ako je cukrovka, nanizizmus, infarkt myokardu, kongestívne srdcové zlyhanie, mozgová apoplexia, roztrúsená skleróza, neutropénia, trombocytopénia, anémia, hepatitída, reumatoidná artritída, astma, Crohnova choroba a liečba rakoviny. (porovnaj Phuc V. Pham, v Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatúra / Referencie
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Ultrazvuk VialTweeter na súčasnú sonikaciu 10 vzoriek, napr. na narušenie buniek BL21
Vysoko výkonné ultrazvuky! Sortiment produktov spoločnosti Hielscher pokrýva celé spektrum od kompaktného laboratórneho ultrazvuku cez stolové jednotky až po plne priemyselné ultrazvukové systémy.