Ultrazvukový Príprava vzoriek pre testy ELISA

Testy ako ELISA sa vo veľkej miere používajú na diagnostiku in vitro, detekciu proteínov súvisiacich s ochorením a kontrolu kvality (napr. monitorovanie potravinových alergénov). Ultrazvukový prípravok vzoriek je rýchla, spoľahlivá a reprodukovateľná technika na lyzovanie buniek a izoláciu intracelulárnych proteínov, DNA, RNA a organely. Hielscher Ultrazvukom ponúka rôzne ultrazvukové riešenia pre pohodlnú prípravu jednotlivých vzoriek, viac injekčných liekoviek, rovnako ako pre mikrotiter dosky a 96-dobre dosky.

Elisa – Enzým-Spojený Imunosorbent test

ELISA je skratka pre enzým-spojený imunosorbent test a je široko používaný biochemickej analýzy techniky kategórie ligand-záväzné testy. V ELISA sa kvapalná vzorka pridá do stacionárnej tuhej fázy so špeciálnymi väzbových vlastnosťami. Za normálnych okolností sa stacionárna tuhá fáza aplikuje ako povlak na dobre dosku alebo dosku ELISA. Potom sa postupne pridávajú, inkubujú a umyjú rôzne kvapalné činidlá tak, aby sa nakoniec v konečnej kvapaline v studničkách vyskytla optická zmena (napr. vývoj farieb produktom enzymatickej reakcie). Optická zmena umožňuje merať množstvo analytu tzv. “čítanie". Na kvantitatívne odčítanie sa na detekciu a meranie intenzity prenášaného svetla používa spektrofotometer, fluórometer alebo luminometer. Citlivosť detekcie je ovplyvnená zosilnením signálu počas analytických reakcií. Vzhľadom k tomu, enzýmové reakcie sú dobre vyšetrené a spoľahlivé zosilnenie procesov, enzýmy sa používajú na vytvorenie signálu. Enzýmy sú spojené s detekčnými činidlami v pevných pomeroch, aby sa umožnila presná kvantifikácia, čo vysvetľuje aj názov imunosorbentový test "spojený s enzýmami".
Keďže testy ELISA sa vykonávajú v mikrotiterových platniach / 96-dobre platniach, je známy ako testovacia technika na báze platničiek a používa sa napr.
Technika ELISA sa často používa ako diagnostický nástroj v medicíne, biotechnológii, rastlinnej patológii a je tiež dôležitým meraním kvality vo viacerých odvetviach.

Ultrazvukový Príprava vzorky pred ELISA

Predtým, ako sa môže vykonať test ELISA, vzorky vyžadujú kroky prípravy takejto bunkovej lyzy a extrakcie intracelulárnych proteínov, DNA, RNA atď. Výhodou ultrazvukovej bunkovej lyzy a izolácie bielkovín je jeho vysoká účinnosť, spoľahlivosť a reprodukovateľnosť. Všetky tieto faktory sú dôležité na získanie vysokokvalitnej diagnostiky a výsledkov výskumu

Protokol pre pre-ELISA ultrazvukové bunkové lysis

• Pre bunkové kultúry: Pred ultrazvukovou bunkovou lalýzou odstreďujte bunky 5 minút pri 270 x g v mikroodstredivke. Supernatant odstráňte aspiráciou a resuspendujte bunky v 30 – 100 μl tlmivého roztoku RIPA. Potom inkubujte bunkový pelet na ľade 30 minút.
• Teraz je vzorka bunky pripravená na ultrazvukovú lyzu:
  Použite ultrazvukový zvuk typu sondy (napr. UP200Ht so sondou S26d2) alebo ultrazvukovým zariadením s viacerými vzorkami (napr. VialTweeter na simultánne ultrazvukovanie až 10 injekčných liekoviek alebo UIP400MPT pre mikrotiterové platne / 96-dobre dosky) v závislosti od množstva vzoriek, ktoré potrebujete pripraviť.
  Pre ultrazvukom sondy jednej vzorky vložte bunky do 1,5 ml mikrocentrifúgových skúmaviek.
• Prednastavte ultrazvukové trvanie, celkový príkon energie, režim cyklu a/alebo teplotné limity v digitálnom menu ultrazvukového zariadenia. To zaisťuje vysoko spoľahlivú sonikáciu a opakovateľnosť.
• Nastavte sonotródu a zapnite ultrazvukové zariadenie. Jemne presuňte mikročip ultrazvukovej sondy cez vzorku, aby ste vzorku rovnomerne sonikujú.
  Pre väčšinu buniek sa ultrazvuková lyza dokončí po 2 -4 cykloch 10 sekúnd ultrazvukom.
• Po ultrazvukom vyberte sonotródu zo vzorky. Vzorky by sa mali inkubovať na ľade po dobu 5 minút. Potom odstreďujte pri 10 000 x g počas 20 minút, aby sa úlomky peletili. Preneste supernatanty do novej mikrocentrifúgovej trubice. Označte analyty a uchovávajte pri teplote -20°C.
• Ultrazvukový sonotróda sa môže čistiť tak, že sa správne utrie alkoholom alebo sonikátom v kadička naplnenej alkoholom, napr. Všetky ultrazvukové sondy vyrobené z titánu sú autoklávovateľné.

Pre homogenáty tkanív:

• Tkanivo opláchnite ľadovo studenými PBS (0,01 M, pH =7,4), aby sa dôkladne odstránila prebytočná krv hemolýzy.
• Odvážte tkanivo (obličky, srdce, pľúca, slezina atď.) a macerujte ho na malé kúsky, ktoré sú homogenizované v PBS. Požadovaný objem PBS súvisí s hmotnosťou tkaniva. Spravidla 1 g tkaniva vyžaduje približne 9 ml PBS. Odporúča sa pridať do PBS inhibítor proteázy. (Alternatívne sa môže použiť tlmivý roztok RIPA alebo hypotonická lýza obsahujúca proteázu a fosfatázu.)
• V závislosti od veľkosti tkaniva môže byť pri predbežnej liečbe tkaniva užitočná krátka liečba vírom (cca 1-2 min. za 15 sekúnd).
• Namontujte mikro-tip, napríklad S26d2, na váš ultrazvukový. Skúmavka so vzorkou s tkanivom sa umiestni do ľadového kúpeľa.
• Vzorku osolte ultrazvukom, napr. Vzorku uchovávajte v ľadovom kúpeli.
• Homogenáty sa potom odstreďujú, aby sa získali špecifické skupiny (cytozolické, jadrové, mitochondriálne alebo lyzozomálne), aby sa proteín obohatil na analýzu. Odstreďovanie vzorky po dobu 5 minút pri 5000 × g sa supernatant získa.

Spoľahlivá regulácia teploty počas ultrazvukom

Teplota je rozhodujúci faktor ovplyvňujúci proces, ktorý je obzvlášť dôležitý pre liečbu biologických vzoriek, napr. Ako všetky techniky mechanickej prípravy vzoriek, ultrazvukom vytvára teplo. Avšak, teplota vzoriek môže byť dobre kontrolovaná pri použití Hielscher ultrazvukom zariadenia. Predstavujeme vám rôzne možnosti na monitorovanie a kontrolu teploty vašich vzoriek pri ich príprave pomocou ultrazvukom typu sondy alebo pred analyticky VialTweeter.

1. Monitorovanie teploty vzorky: Všetky digitálne ultrazvukové procesory Hielscher sú vybavené inteligentným softvérom a pripojením teplotného snímača. Zapojte snímač teploty do ultrazvukového zariadenia (napr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) a vložte špičku snímača teploty do jednej zo skúmaviek so vzorkou. Prostredníctvom digitálneho farebného dotykového displeja môžete nastaviť v ponuke ultrazvukového procesora špecifický teplotný rozsah pre vašu sonikáciu vzoriek. Ultrazvukom sa automaticky zastaví, keď sa dosiahne maximálna teplota, a pozastaví sa, až kým teplota vzorky nedosiahne nižšiu hodnotu nastavenej teploty ∆. Potom sa ultrazvukom spustí automaticky znova. Táto inteligentná funkcia zabraňuje degradácii vyvolanej teplom.
2. Pokiaľ ide o ultrazvukové jednotky s viacerými vzorkami VialTweeter, titánový blok, ktorý drží skúmavky so vzorkou, sa môže predchladiť. Vložte blok VialTweeter (iba sonotróda bez prevodníka!) do chladničky alebo mrazničky, aby sa predchladil titánový blok, ktorý pomáha odložiť zvýšenie teploty vo vzorke. Ak je to možné, vzorka sama o sebe môže byť pre-chladené taky.
3. Použite ľadový kúpeľ alebo suchý ľad vychladnúť počas ultrazvukom. Počas ultrazvuku vložte vzorkovacie trubice do ľadového kúpeľa. Pre VialTweeter, použite plytký zásobník naplnený suchým ľadom a miesto VialTweeter na suchom ľade tak, aby teplo môže rýchlo rozptýliť.

Zákazníci po celom svete používajú Hielscher sonda-ultrasonicators, rovnako ako multi-vzorky ultrazvukom jednotky VialTweeter a UIP400MTP pre ich každodennú prípravu vzoriek práce v biologických, biochemických, lekárskych a klinických laboratórií. Inteligentný softvér a regulácia teploty procesorov Hielscher, teplota je spoľahlivo regulovaná a tepelne-indukovanej degradácie vzoriek vyhnúť. Ultrazvuková príprava vzoriek s ultrazvukovým roztokom Hielscher prináša vysoko spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky!