Ultrazvuková príprava vzorky pre testy ELISA

Testy ako ELISA sa vo veľkej miere používajú na diagnostiku in vitro, detekciu proteínov súvisiacich s ochorením a kontrolu kvality (napr. monitorovanie potravinových alergénov). Ultrazvuková príprava vzoriek je rýchla, spoľahlivá a reprodukovateľná technika na lýzu buniek a izoláciu intracelulárnych proteínov, DNA, RNA a organel. Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové roztoky na pohodlnú prípravu jednotlivých vzoriek, viacerých liekoviek, ako aj mikrotitračných platničiek a 96-jamkových platničiek.

ELISA – Enzýmový imunosorbentný test

ELISA je skratka pre enzýmový imunosorbentný test a je široko používanou technikou biochemickej analýzy kategórie testov viažucich ligand. V ELISA sa kvapalná vzorka pridáva na stacionárnu pevnú fázu so špeciálnymi väzbovými vlastnosťami. Za normálnych okolností sa stacionárna pevná fáza nanáša ako povlak na jamkovú dosku alebo dosku ELISA. Potom sa postupne pridávajú rôzne kvapalné činidlá, inkubujú a premyjú, takže nakoniec dôjde k optickej zmene (napr. Vývoj farby produktom enzymatickej reakcie) v konečnej kvapaline v jamke. Optická zmena umožňuje merať množstvo analyzovanej látky takzvaným kvantitatívnym “reading”. For the quantitative reading, a spectrophotometer, fluorometer, or luminometer is used to detect and measure the intensity of the transmitted light. The sensitivity of detection is influenced by the amplification of the signal during the analytic reactions. Since enzyme reactions are well investigated and reliable amplification processes, enzymes are used to create the signal. The enzymes are linked to the detection reagents in fixed proportions to allow accurate quantification, which explains also the name “enzýmovo viazané” immunosorbent assay.
Keďže testy ELISA sa vykonávajú na mikrotitračných platniach? 96-jamkových platniach, je známa ako testovacia technika založená na platničkách a používa sa napr. v klinickej diagnostike in vitro, výskume, vývoji liekov atď. na detekciu a kvantifikáciu protilátok, peptidov, proteínov a hormónov.
Technika ELISA sa často používa ako diagnostický nástroj v medicíne, biotechnológii, patológii rastlín a je tiež dôležitým meraním kontroly kvality vo viacerých priemyselných odvetviach.

Ultrazvuková príprava vzorky pred testom ELISA

Pred vykonaním testu ELISA si vzorky vyžadujú kroky prípravy, ako je lýza buniek a extrakcia intracelulárnych proteínov, DNA, RNA atď. Výhodou ultrazvukovej lýzy buniek a izolácie proteínov je jej vysoká účinnosť, spoľahlivosť a reprodukovateľnosť. Všetky tieto faktory sú dôležité pre získanie kvalitných výsledkov diagnostiky a výskumu

Protokol pre ultrazvukovú lýzu buniek pred ELISA

• Pre bunkové kultúry: Pred ultrazvukovou lýzou buniek odstredte články 5 minút pri 270 x g v mikrocentrifúge. Supernatant sa odstráni aspiráciou a resuspenduje sa bunky v 30 – 100 μl RIPA pufra. Potom bunkovú peletu inkubujte na ľade 30 minút.
• Teraz je vzorka bunky pripravená na ultrazvukovú lýzu:
  Použite ultrazvukový prístroj typu sondy (napr. UP200Ht so sondou S26d2) alebo ultrazvukové zariadenie na výrobu viacerých vzoriek (napr. VialTweeter na súčasnú sonikáciu až 10 injekčných liekoviek alebo UIP400MPT pre mikrotitračné platničky? 96-jamkové platničky) v závislosti od množstva vzoriek, ktoré potrebujete pripraviť.
  Na sondovú sonikáciu jednej vzorky umiestnite bunky do 1.5 ml mikroodstredivkových skúmaviek.
• Prednastavte si trvanie ultrazvuku, celkový príkon energie, režim cyklu a/alebo teplotné limity v digitálnej ponuke ultrazvuku. To zaisťuje vysoko spoľahlivú sonikáciu a opakovateľnosť.
• Vložte sonotródu a zapnite ultrazvukové zariadenie. Jemne pohybujte mikrohrotom ultrazvukovej sondy cez vzorku, aby sa vzorka rovnomerne sonikovala.
  U väčšiny buniek bude ultrazvuková lýza dokončená po 2 - 4 cykloch 10 sekundovej sonikácie.
• Po sonikácii vyberte sonotródu zo vzorky. Vzorky by sa mali inkubovať na ľade 5 minút. Potom odstredte pri 10 000 x g po dobu 20 minút, aby sa nečistoty peletovali. Preneste supernatanty do novej mikroodstredivkovej skúmavky. Označte analyty a skladujte pri teplote -20 °C.
• Ultrazvukovú sonotródu je možné vyčistiť správnym utretím alkoholom alebo sonikátom v kadičke naplnenej alkoholom, napr. 70% etanolom. Všetky ultrazvukové sondy vyrobené z titánu sú autoklávovateľné.

• Opláchnite tkanivo ľadovo studeným PBS (0,01 M, pH = 7,4), aby ste dôkladne odstránili prebytočnú hemolýznu krv.
• Odvážte tkanivo (obličky, srdce, pľúca, slezinu atď.) a macerujte ho na malé kúsky, ktoré sú homogenizované v PBS. Požadovaný objem PBS súvisí s hmotnosťou tkaniva. Spravidla 1 g tkaniva vyžaduje cca. 9 ml PBS. Odporúča sa pridať do PBS nejaký inhibítor proteázy. (Alternatívne sa môže použiť RIPA alebo hypotonický lyzačný pufr obsahujúci proteázu a kokteil inhibítorov fosfatázy.)
• V závislosti od veľkosti tkaniva môže byť na predbežné ošetrenie tkaniva užitočné krátke vírivé ošetrenie (približne 1-2 minúty v 15 sekundových impulzoch).
• Namontujte mikrohrot, napr. S26d2, na ultrazvuk. Skúmavku na vzorku s vreckovkou vložte do ľadového kúpeľa.
• Sonikujte vzorku ultrazvukom, napr. UP200St (80 % amplitúda) na 1 minútu v pulznom režime (15 sekúnd zapnuté, 15 sekúnd pauza). Vzorku uchovávajte v ľadovom kúpeli.
• Homogenáty sa potom odstredia, aby sa získali špecifické bazény (cytosolické, jadrové, mitochondriálne alebo lyzozomálne), aby sa proteín obohatil na analýzu. Odstreďovaním vzorky po dobu 5 minút pri 5000× g sa odoberie supernatant.

Spoľahlivá regulácia teploty počas sonikácie

Teplota je rozhodujúcim faktorom ovplyvňujúcim proces, ktorý je obzvlášť dôležitý pri úprave biologických vzoriek, napr. na zabránenie tepelnej degradácii proteínov. Ako všetky techniky mechanickej prípravy vzoriek, aj sonikácia vytvára teplo. Teplotu vzoriek je však možné dobre kontrolovať pri použití prístrojov Hielscher Ultrasonics. Predstavujeme vám rôzne možnosti monitorovania a kontroly teploty vašich vzoriek pri ich predanalytickej príprave pomocou ultrazvukového ultrazvuku alebo VialTweeter.

1. Monitorovanie teploty vzorky: Všetky digitálne ultrazvukové procesory Hielscher sú vybavené inteligentným softvérom a zásuvným snímačom teploty. Zapojte snímač teploty do ultrazvukového zariadenia (napr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP) a vložte hrot teplotného snímača do jednej zo skúmaviek so vzorkami. Prostredníctvom digitálneho farebného dotykového displeja môžete v ponuke ultrazvukového procesora nastaviť konkrétny teplotný rozsah pre sonikáciu vzorky. Ultrazvuk sa automaticky zastaví po dosiahnutí maximálnej teploty a pozastaví sa, kým sample teplota klesne na nižšiu hodnotu nastavenej teploty ∆. Potom sa sonikácia spustí automaticky znova. Táto inteligentná funkcia zabraňuje degradácii spôsobenej teplom.
2. Pokiaľ ide o ultrazvukovú jednotku s viacerými vzorkami VialTweeter, titánový blok, ktorý drží skúmavky na vzorky, môže byť predchladený. Vložte blok VialTweeter (iba sonotrode bez prevodníka!) do chladničky alebo mrazničky, aby sa titánový blok predchladil, pomáha oddialiť nárast teploty vo vzorke. Ak je to možné, samotná vzorka môže byť tiež predchladená.
3. Na ochladenie počas sonikácie použite ľadový kúpeľ alebo suchý ľad. Umiestnite skúmavku (skúmavky) počas sonikácie do ľadového kúpeľa. Pre VialTweeter použite plytký podnos naplnený suchým ľadom a umiestnite VialTweeter na suchý ľad, aby sa teplo mohlo rýchlo rozptýliť.

Zákazníci na celom svete používajú ultrazvukové prístroje Hielscherovho typu sondy, ako aj ultrazvukové jednotky s viacerými vzorkami VialTweeter a UIP400MTP na svoju každodennú prípravu vzoriek v biologických, biochemických, lekárskych a klinických laboratóriách. Vďaka inteligentnému softvéru a regulácii teploty procesorov Hielscher je spoľahlivo riadená teplota a zabráni sa tepelnej degradácii vzorky. Ultrazvuková príprava vzoriek pomocou ultrazvukových roztokov Hielscher poskytuje vysoko spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky!
Prečítajte si viac o vysokovýkonnej sonikácii pomocou sonikátora s viacjamkovou platňou UIP400MTP na testy!