Ultrazvuková príprava vzorky pre testy ELISA
Testy ako ELISA sa vo veľkej miere používajú na diagnostiku in vitro, detekciu proteínov súvisiacich s ochorením a kontrolu kvality (napr. monitorovanie potravinových alergénov). Ultrazvuková príprava vzoriek je rýchla, spoľahlivá a reprodukovateľná technika na lýzu buniek a izoláciu intracelulárnych proteínov, DNA, RNA a organel. Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové roztoky na pohodlnú prípravu jednotlivých vzoriek, viacerých liekoviek, ako aj mikrotitračných platničiek a 96-jamkových platničiek.
ELISA – Enzýmový imunosorbentný test
ELISA je skratka pre enzýmový imunosorbentný test a je široko používanou technikou biochemickej analýzy kategórie testov viažucich ligand. V ELISA sa kvapalná vzorka pridáva na stacionárnu pevnú fázu so špeciálnymi väzbovými vlastnosťami. Za normálnych okolností sa stacionárna pevná fáza nanáša ako povlak na jamkovú dosku alebo dosku ELISA. Potom sa postupne pridávajú rôzne kvapalné činidlá, inkubujú a premyjú, takže nakoniec dôjde k optickej zmene (napr. Vývoj farby produktom enzymatickej reakcie) v konečnej kvapaline v jamke. Optická zmena umožňuje merať množstvo analyzovanej látky takzvaným kvantitatívnym “reading”. For the quantitative reading, a spectrophotometer, fluorometer, or luminometer is used to detect and measure the intensity of the transmitted light. The sensitivity of detection is influenced by the amplification of the signal during the analytic reactions. Since enzyme reactions are well investigated and reliable amplification processes, enzymes are used to create the signal. The enzymes are linked to the detection reagents in fixed proportions to allow accurate quantification, which explains also the name “enzýmovo viazané” immunosorbent assay.
Keďže testy ELISA sa vykonávajú na mikrotitračných platniach? 96-jamkových platniach, je známa ako testovacia technika založená na platničkách a používa sa napr. v klinickej diagnostike in vitro, výskume, vývoji liekov atď. na detekciu a kvantifikáciu protilátok, peptidov, proteínov a hormónov.
Technika ELISA sa často používa ako diagnostický nástroj v medicíne, biotechnológii, patológii rastlín a je tiež dôležitým meraním kontroly kvality vo viacerých priemyselných odvetviach.

Ultrazvuková jednotka na prípravu vzorky VialTweeter sa používa na lýzu buniek a extrakciu bielkovín pred testami ELISA
Ultrazvuková príprava vzorky pred testom ELISA
Pred vykonaním testu ELISA si vzorky vyžadujú kroky prípravy, ako je lýza buniek a extrakcia intracelulárnych proteínov, DNA, RNA atď. Výhodou ultrazvukovej lýzy buniek a izolácie proteínov je jej vysoká účinnosť, spoľahlivosť a reprodukovateľnosť. Všetky tieto faktory sú dôležité pre získanie kvalitných výsledkov diagnostiky a výskumu
- Homogénna úprava vzoriek
- Úplná lýza
- Kompletná extrakcia proteínov (napr. protilátky, DNA)
- Optimálne prispôsobenie sa typu bunky
- Pre akúkoľvek veľkosť vzorky
- Reprodukovateľné
- Regulovaná teplota
- Automatické protokolovanie údajov na SD karte
Protokol pre ultrazvukovú lýzu buniek pred ELISA
- Pre bunkové kultúry: Pred ultrazvukovou lýzou buniek odstredte články 5 minút pri 270 x g v mikrocentrifúge. Supernatant sa odstráni aspiráciou a resuspenduje sa bunky v 30 – 100 μl RIPA pufra. Potom bunkovú peletu inkubujte na ľade 30 minút.
- Teraz je vzorka bunky pripravená na ultrazvukovú lýzu:
Použite ultrazvukový prístroj typu sondy (napr. UP200Ht so sondou S26d2) alebo ultrazvukové zariadenie na výrobu viacerých vzoriek (napr. VialTweeter na súčasnú sonikáciu až 10 injekčných liekoviek alebo UIP400MPT pre mikrotitračné platničky? 96-jamkové platničky) v závislosti od množstva vzoriek, ktoré potrebujete pripraviť.
Na sondovú sonikáciu jednej vzorky umiestnite bunky do 1.5 ml mikroodstredivkových skúmaviek. - Prednastavte si trvanie ultrazvuku, celkový príkon energie, režim cyklu a/alebo teplotné limity v digitálnej ponuke ultrazvuku. To zaisťuje vysoko spoľahlivú sonikáciu a opakovateľnosť.
- Vložte sonotródu a zapnite ultrazvukové zariadenie. Jemne pohybujte mikrohrotom ultrazvukovej sondy cez vzorku, aby sa vzorka rovnomerne sonikovala.
U väčšiny buniek bude ultrazvuková lýza dokončená po 2 - 4 cykloch 10 sekundovej sonikácie. - Po sonikácii vyberte sonotródu zo vzorky. Vzorky by sa mali inkubovať na ľade 5 minút. Potom odstredte pri 10 000 x g po dobu 20 minút, aby sa nečistoty peletovali. Preneste supernatanty do novej mikroodstredivkovej skúmavky. Označte analyty a skladujte pri teplote -20 °C.
- Ultrazvukovú sonotródu je možné vyčistiť správnym utretím alkoholom alebo sonikátom v kadičke naplnenej alkoholom, napr. 70% etanolom. Všetky ultrazvukové sondy vyrobené z titánu sú autoklávovateľné.

Extrakcia bielkovín z buniek E. coli pomocou ultrazvuková sonda UP200St
- Opláchnite tkanivo ľadovo studeným PBS (0,01 M, pH = 7,4), aby ste dôkladne odstránili prebytočnú hemolýznu krv.
- Odvážte tkanivo (obličky, srdce, pľúca, slezinu atď.) a macerujte ho na malé kúsky, ktoré sú homogenizované v PBS. Požadovaný objem PBS súvisí s hmotnosťou tkaniva. Spravidla 1 g tkaniva vyžaduje cca. 9 ml PBS. Odporúča sa pridať do PBS nejaký inhibítor proteázy. (Alternatívne sa môže použiť RIPA alebo hypotonický lyzačný pufr obsahujúci proteázu a kokteil inhibítorov fosfatázy.)
- V závislosti od veľkosti tkaniva môže byť na predbežné ošetrenie tkaniva užitočné krátke vírivé ošetrenie (približne 1-2 minúty v 15 sekundových impulzoch).
- Namontujte mikrohrot, napr. S26d2, na ultrazvuk. Skúmavku na vzorku s vreckovkou vložte do ľadového kúpeľa.
- Sonikujte vzorku ultrazvukom, napr. UP200St (80 % amplitúda) na 1 minútu v pulznom režime (15 sekúnd zapnuté, 15 sekúnd pauza). Vzorku uchovávajte v ľadovom kúpeli.
- Homogenáty sa potom odstredia, aby sa získali špecifické bazény (cytosolické, jadrové, mitochondriálne alebo lyzozomálne), aby sa proteín obohatil na analýzu. Odstreďovaním vzorky po dobu 5 minút pri 5000× g sa odoberie supernatant.
Spoľahlivá regulácia teploty počas sonikácie
Teplota je rozhodujúcim faktorom ovplyvňujúcim proces, ktorý je obzvlášť dôležitý pri úprave biologických vzoriek, napr. na zabránenie tepelnej degradácii proteínov. Ako všetky techniky mechanickej prípravy vzoriek, aj sonikácia vytvára teplo. Teplotu vzoriek je však možné dobre kontrolovať pri použití prístrojov Hielscher Ultrasonics. Predstavujeme vám rôzne možnosti monitorovania a kontroly teploty vašich vzoriek pri ich predanalytickej príprave pomocou ultrazvukového ultrazvuku alebo VialTweeter.
- Monitorovanie teploty vzorky: Všetky digitálne ultrazvukové procesory Hielscher sú vybavené inteligentným softvérom a zásuvným snímačom teploty. Zapojte snímač teploty do ultrazvukového zariadenia (napr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP) a vložte hrot teplotného snímača do jednej zo skúmaviek so vzorkami. Prostredníctvom digitálneho farebného dotykového displeja môžete v ponuke ultrazvukového procesora nastaviť konkrétny teplotný rozsah pre sonikáciu vzorky. Ultrazvuk sa automaticky zastaví po dosiahnutí maximálnej teploty a pozastaví sa, kým sample teplota klesne na nižšiu hodnotu nastavenej teploty ∆. Potom sa sonikácia spustí automaticky znova. Táto inteligentná funkcia zabraňuje degradácii spôsobenej teplom.
- Pokiaľ ide o ultrazvukovú jednotku s viacerými vzorkami VialTweeter, titánový blok, ktorý drží skúmavky na vzorky, môže byť predchladený. Vložte blok VialTweeter (iba sonotrode bez prevodníka!) do chladničky alebo mrazničky, aby sa titánový blok predchladil, pomáha oddialiť nárast teploty vo vzorke. Ak je to možné, samotná vzorka môže byť tiež predchladená.
- Na ochladenie počas sonikácie použite ľadový kúpeľ alebo suchý ľad. Umiestnite skúmavku (skúmavky) počas sonikácie do ľadového kúpeľa. Pre VialTweeter použite plytký podnos naplnený suchým ľadom a umiestnite VialTweeter na suchý ľad, aby sa teplo mohlo rýchlo rozptýliť.
Zákazníci na celom svete používajú ultrazvukové prístroje Hielscherovho typu sondy, ako aj ultrazvukové jednotky s viacerými vzorkami VialTweeter a UIP400MTP na svoju každodennú prípravu vzoriek v biologických, biochemických, lekárskych a klinických laboratóriách. Vďaka inteligentnému softvéru a regulácii teploty procesorov Hielscher je spoľahlivo riadená teplota a zabráni sa tepelnej degradácii vzorky. Ultrazvuková príprava vzoriek pomocou ultrazvukových roztokov Hielscher poskytuje vysoko spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky!
Prečítajte si viac o vysokovýkonnej sonikácii pomocou sonikátora s viacjamkovou platňou UIP400MTP na testy!
Kontaktujte nás!? Opýtajte sa nás!
Literatúra? Referencie
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Fakty, ktoré stoja za to vedieť
Aké typy testu ELISA existujú?
Existuje niekoľko typov ELISA, ktoré sa vyznačujú princípom fungovania. Sú známe ako priama ELISA, nepriama ELISA, sendvičová ELISA, konkurenčná ELISA a reverzná ELISA. Nižšie vám predstavujeme prehľad rôznych typov ELISA a ich hlavných charakteristík a rozdielov.
ELISA môže byť spustená v kvalitatívnom alebo kvantitatívnom formáte. Kvalitatívne výsledky poskytujú jednoduchý pozitívny alebo negatívny výsledok, zatiaľ čo v kvantitatívnej testovacej skúške ELISA sa optická hustota (OD) vzorky porovnáva so štandardnou krivkou, čo je zvyčajne sériové riedenie roztoku cieľovej molekuly so známou koncentráciou.
Priama ELISA
Priama ELISA je najjednoduchšia forma testu Elisa, kde sa používa iba primárna protilátka značená enzýmom a sekundárne protilátky nie sú potrebné. Enzýmom značená primárna protilátka sa viaže priamo na cieľ, t. j. antigén. Pufrovaný antigénový roztok sa pridáva do každej jamky mikrotitrovej platne (zvyčajne 96-jamkové platničky, ELISA-platne), kde priľne k plastovému povrchu prostredníctvom nábojových interakcií. Keď enzým spojený s primárnou protilátkou reaguje so svojím substrátom, vytvára viditeľný signál, ktorý možno merať pomocou spektrofotometra, fluorometra alebo luminometra.
Nepriama ELISA
Pre nepriamy test ELISA sa vyžaduje primárna protilátka aj sekundárna protilátka. Na rozdiel od priamej ELISA však nie primárna protilátka, ale sekundárna protilátka nie je označená enzýmom. Antigén je imobilizovaný na jamkovú platňu a viazaný primárnou protilátkou. Následne sa enzýmom značená sekundárna protilátka viaže na primárnu protilátku. Nakoniec enzým spojený so sekundárnou protilátkou reaguje so svojím substrátom a vytvára viditeľný signál, ktorý je možné zistiť.
Sendvič ELISA
Zatiaľ čo pri priamych a nepriamych testoch ELISA je antigén imobilizovaný a potiahnutý na povrch jamkovej platničky, v sendvičovej ELISA je protilátka imobilizovaná na plastový povrch platničky ELISA. Imobilizované protilátky v sendvičovej ELISA sú známe ako záchytné protilátky. Okrem záchytných protilátok sú v sendvičovej ELISA potrebné aj takzvané detekčné protilátky. Detekčné protilátky zahŕňajú neznačenú primárnu detekčnú protilátku a enzýmom značenú sekundárnu detekčnú protilátku.
Postupne sa antigén, ktorý je predmetom záujmu, viaže na záchytnú protilátku imobilizovanú na platni. Potom sa primárna detekčná protilátka naviaže na antigén. Potom sa sekundárna detekčná protilátka naviaže na primárnu detekčnú protilátku. V záverečnom reakčnom kroku enzým reaguje so svojím substrátom a vytvára viditeľný signál, ktorý je možné opticky detekovať.
Konkurenčná ELISA
Kompetitívne ELISA, tiež známe ako inhibícia ELISA, je najkomplexnejším typom ELISA, pretože zahŕňa použitie inhibičného antigénu. Každý z troch formátov, priamy, nepriamy a sendvičový ELISA, je možné prispôsobiť konkurenčnému formátu ELISA. V kompetitívnej skupine ELISA inhibítor antigén a antigén, ktorý je predmetom záujmu, súťažia o väzbu na primárnu protilátku.
Pre kompetitívne ELISA sa neznačená protilátka inkubuje v prítomnosti jej antigénu, t. j. vzorky. Tieto viazané komplexy protilátok/antigénov sa potom pridajú do jamky potiahnutej antigénom.
Doska sa umyje, aby sa odstránili neviazané protilátky. Konkurenčná ELISA má svoj názov vďaka tomu, že čím viac antigénu je vo vzorke, tým viac komplexov antigén-protilátka sa tvorí. To znamená, že v jamke je k dispozícii menej neviazaných protilátok na väzbu na antigén a antigény musia súťažiť o dostupnú protilátku. Pridá sa sekundárna protilátka, ktorá zodpovedá primárnej protilátke. Táto druhá protilátka je spojená s enzýmom. Po pridaní substrátu zostávajúce enzýmy produkujú chromogénny alebo fluorescenčný signál.
V tomto bode sa reakcia zastaví, aby sa zabránilo prípadnému nasýteniu signálu.
Niektoré konkurenčné súpravy ELISA obsahujú antigén viazaný na enzýmy namiesto protilátky viazanej na enzýmy. Označený antigén súťaží o primárne miesta väzby protilátok so vzorkou antigénu (neznačený). Čím menej antigénu vo vzorke, tým viac označeného antigénu sa zadržiava v jamke a tým silnejší je signál.
Reverzná ELISA
Reverzná ELISA nepoužíva jamkové platne, ale ponecháva antigény suspendované v testovacej tekutine. Reverzný test ELISA meria množstvo viazanej protilátky prostredníctvom antigénu. Bol vyvinutý špeciálne na detekciu a skúmanie proteínu obalu vírusu západonílskej horúčky a toho, ako je schopný nájsť protilátky špecifické pre vírus.
Ktoré enzymatické markery sa používajú pre ELISA?
Nižšie uvedený zoznam uvádza najbežnejšie enzymatické markery používané v testoch ELISA, ktoré umožňujú meranie výsledkov testu po dokončení.
- OPD (o-fenyléndiamíndihydrochlorid) sa zmení na jantárovú, aby zistil HRP (chrenovú peroxidázu), ktorá sa často používa ako konjugovaný proteín.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametylbenzidín) sa pri detekcii HRP zmení na modrý a po pridaní kyseliny sírovej alebo fosforečnej zožltne.
- ABTS (2,2′-Azinobis [3-etylbenzotiazolín-6-sulfónová kyselina]-diamónna soľ) sa pri detekcii HRP zmení na zelenú.
- PNPP (p-nitrofenylfosfát, disodná soľ) pri detekcii alkalickej fosfatázy zožltne.