Ultrazvuková príprava vzoriek na testy ELISA

Testy, ako je ELISA, sa široko používajú na diagnostiku in vitro, detekciu proteínov súvisiacich s ochoreniami a kontrolu kvality (napr. monitorovanie potravinových alergénov). Ultrazvuková príprava vzoriek je rýchla, spoľahlivá a reprodukovateľná technika na lýzu buniek a izoláciu vnútrobunkových proteínov, DNA, RNA a organel. Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové riešenia na pohodlnú prípravu jednotlivých vzoriek, viacerých liekoviek, ako aj mikrotitračných platničiek a 96-jamkových platničiek.

ELISA – enzýmovo viazaný imunosorbentový test

ELISA je skratka pre enzýmovo viazaný imunosorbentový test a predstavuje široko používanú techniku biochemickej analýzy z kategórie testov založených na väzbe ligandu. Pri teste ELISA sa kvapalná vzorka pridáva na stacionárnu pevnú fázu so špecifickými väzbovými vlastnosťami. Stacionárna pevná fáza sa zvyčajne nanáša ako povlak na jamkovú platničku alebo platničku ELISA. Potom sa postupne pridávajú rôzne kvapalné činidlá, inkubujú sa a vymývajú, takže napokon v konečnej kvapaline v jamke nastane optická zmena (napr. vznik sfarbenia v dôsledku produktu enzymatickej reakcie). Optická zmena umožňuje merať množstvo analytu takzvaným kvantitatívnym „odčítaním“. Na kvantitatívne odčítanie sa používa spektrofotometer, fluorometer alebo luminometer na detekciu a meranie intenzity prechádzajúceho svetla. Citlivosť detekcie ovplyvňuje zosilnenie signálu počas analytických reakcií. Keďže enzymatické reakcie sú dobre preskúmané a predstavujú spoľahlivé procesy zosilnenia, na vytvorenie signálu sa používajú enzýmy. Enzýmy sú naviazané na detekčné činidlá v pevných pomeroch, aby umožňovali presnú kvantifikáciu, čo vysvetľuje aj názov „enzýmovo viazaný“ imunosorbentový test.
Keďže sa testy ELISA vykonávajú v mikrotitračných platničkách / 96-jamkových platničkách, táto technika je známa ako testovacia technika založená na platničkách a používa sa napr. v klinickej diagnostike in vitro, výskume, vývoji liekov atď. na detekciu a kvantifikáciu protilátok, peptidov, proteínov a hormónov.
Technika ELISA sa často používa ako diagnostický nástroj v medicíne, biotechnológiách a rastlinnej patológii a je tiež dôležitým meraním pri kontrole kvality vo viacerých priemyselných odvetviach.

Ultrazvuková príprava vzoriek pred testom ELISA

Pred vykonaním testu ELISA si vzorky vyžadujú prípravné kroky, ako sú lýza buniek a extrakcia vnútrobunkových proteínov, DNA, RNA atď. Výhodou ultrazvukovej lýzy buniek a izolácie proteínov je vysoká účinnosť, spoľahlivosť a reprodukovateľnosť. Všetky tieto faktory sú dôležité na získanie kvalitných diagnostických a výskumných výsledkov

Protokol ultrazvukovej lýzy buniek pred testom ELISA

• Pre bunkové kultúry: Pred ultrazvukovou lýzou buniek centrifugujte bunky 5 minút pri 270 x g v mikrocentrifúge. Odstráňte supernatant odsatím a resuspendujte bunky v 30 – 100 μL pufra RIPA. Potom inkubujte bunkový pelet na ľade 30 min.
• Teraz je bunková vzorka pripravená na ultrazvukovú lýzu:
  Použite sondový ultrazvukový prístroj (napr. UP200Ht so sondou S26d2) alebo ultrazvukové zariadenie na spracovanie viacerých vzoriek (napr. VialTweeter na súčasnú sonikáciu až 10 liekoviek alebo UIP400MPT na mikrotitračné platničky / 96-jamkové platničky) v závislosti od počtu vzoriek, ktoré potrebujete pripraviť.
  Pri sonikácii jednotlivej vzorky sondou umiestnite bunky do 1,5 mL mikrocentrifugačných skúmaviek.
• V digitálnej ponuke ultrazvukového prístroja vopred nastavte trvanie sonikácie, celkový prívod energie, režim cyklov a/alebo teplotné limity. Tým sa zabezpečí vysoko spoľahlivá sonikácia a opakovateľnosť.
• Vložte sonotródu a zapnite ultrazvukové zariadenie. Jemne pohybujte mikrohrotom ultrazvukovej sondy vo vzorke, aby ste vzorku sonikovali rovnomerne.
  Pri väčšine buniek sa ultrazvuková lýza dokončí po 2–4 cykloch sonikácie trvajúcich 10 sekúnd.
• Po sonikácii vyberte sonotródu zo vzorky. Vzorky by sa mali inkubovať na ľade 5 min. Potom ich centrifugujte pri 10 000 x g počas 20 min, aby sa bunkové zvyšky usadili do pelety. Preneste supernatanty do novej mikrocentrifugačnej skúmavky. Označte analyty a skladujte ich pri -20°C.
• Ultrazvukovú sonotródu možno vyčistiť dôkladným utretím alkoholom alebo sonikáciou v kadičke naplnenej alkoholom, napr. 70% etanolom. Všetky ultrazvukové sondy vyrobené z titánu možno sterilizovať v autokláve.

• Opláchnite tkanivo ľadovo studeným PBS (0,01M, pH=7,4), aby ste dôkladne odstránili prebytočnú hemolyzovanú krv.
• Odvážte tkanivo (obličky, srdce, pľúca, slezina atď.) a macerujte ho na malé kúsky, ktoré sa homogenizujú v PBS. Potrebný objem PBS závisí od hmotnosti tkaniva. Orientačne je na 1g tkaniva potrebných približne 9mL PBS. Do PBS sa odporúča pridať inhibítor proteáz. (Alternatívne možno použiť RIPA alebo hypotonický lyzačný pufor obsahujúci zmes inhibítorov proteáz a fosfatáz.)
• V závislosti od veľkosti tkaniva môže byť na jeho predbežné spracovanie užitočné krátke premiešanie na vortexovom miešadle (približne 1–2 min. v 15-sekundových pulzoch).
• Namontujte na ultrazvukový prístroj mikrohrot, napr. S26d2. Vložte skúmavku so vzorkou tkaniva do ľadového kúpeľa.
• Sonikujte vzorku ultrazvukovým prístrojom, napr. UP200St (80% amplitúda), počas 1 min. v pulznom režime (15 sekúnd zapnuté, 15 sekúnd prestávka). Udržiavajte vzorku v ľadovom kúpeli.
• Homogenáty sa potom centrifugujú, aby sa získali špecifické frakcie (cytozolové, jadrové, mitochondriálne alebo lyzozómové) s cieľom obohatiť ich o proteín určený na analýzu. Centrifugáciou vzorky počas 5 minút pri 5000×g sa získa supernatant.

Spoľahlivá regulácia teploty počas sonikácie

Teplota je rozhodujúcim faktorom ovplyvňujúcim proces, ktorý je obzvlášť dôležitý pri spracovaní biologických vzoriek, napr. na zabránenie tepelnej degradácii proteínov. Tak ako všetky mechanické techniky prípravy vzoriek, aj sonikácia vytvára teplo. Pri používaní zariadení Hielscher Ultrasonics však možno teplotu vzoriek dobre regulovať. Predstavujeme vám rôzne možnosti monitorovania a regulácie teploty vzoriek počas ich predanalytickej prípravy pomocou ultrazvukového prístroja so sondou alebo zariadenia VialTweeter.

1. Monitorovanie teploty vzorky: Všetky digitálne ultrazvukové procesory Hielscher sú vybavené inteligentným softvérom a pripojiteľným snímačom teploty. Pripojte snímač teploty k ultrazvukovému zariadeniu (napr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonikátor pre viacjamkové platničky UIP400MTP) a vložte hrot snímača teploty do jednej zo skúmaviek so vzorkami. Prostredníctvom digitálneho farebného dotykového displeja môžete v ponuke ultrazvukového procesora nastaviť konkrétny teplotný rozsah na sonikáciu vzoriek. Ultrazvukový prístroj sa po dosiahnutí maximálnej teploty automaticky zastaví a zostane pozastavený, kým teplota vzorky neklesne na dolnú hodnotu nastaveného teplotného intervalu ∆. Potom sa sonikácia opäť automaticky spustí. Táto inteligentná funkcia zabraňuje degradácii spôsobenej teplom.
2. Pri ultrazvukovom zariadení VialTweeter na spracovanie viacerých vzoriek možno titánový blok, ktorý drží skúmavky so vzorkami, vopred schladiť. Vložte blok VialTweeter (iba sonotródu bez meniča!) do chladničky alebo mrazničky. Predbežné schladenie titánového bloku pomáha oddialiť nárast teploty vo vzorke. Ak je to možné, možno vopred schladiť aj samotnú vzorku.
3. Na chladenie počas sonikácie použite ľadový kúpeľ alebo suchý ľad. Počas sonikácie vložte skúmavku alebo skúmavky so vzorkami do ľadového kúpeľa. Pre VialTweeter použite plytkú nádobu naplnenú suchým ľadom a položte VialTweeter na suchý ľad, aby sa teplo mohlo rýchlo odvádzať.

Zákazníci na celom svete používajú sondové ultrazvukové prístroje Hielscher, ako aj jednotky VialTweeter a UIP400MTP na sonikáciu viacerých vzoriek pri každodennej príprave vzoriek v biologických, biochemických, medicínskych a klinických laboratóriách. Vďaka inteligentnému softvéru a regulácii teploty v ultrazvukových procesoroch Hielscher je teplota spoľahlivo regulovaná a predchádza sa degradácii vzoriek spôsobenej teplom. Ultrazvuková príprava vzoriek pomocou ultrazvukových riešení Hielscher poskytuje vysoko spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky!
Prečítajte si viac o sonikácii s vysokou priepustnosťou vzoriek pomocou sonikátora UIP400MTP pre viacjamkové platničky na analytické stanovenia!