Ultrazvuková fragmentácia DNA pre sekvenovanie ďalšej generácie
Sekvenovanie novej generácie (NGS) vyžaduje spoľahlivé strihanie a fragmentáciu genómovej DNA, aby sa sekvenovali genómové DNA a vytvorili knižnice genómu. Kontrolovaná fragmentácia DNA na fragmenty DNA je nevyhnutným krokom prípravy vzorky, ktorý je potrebný pred sekvenením DNA. Ultrazvukom je preukázané ako efektívna a spoľahlivá technika pre fragmentáciu DNA určitej dĺžky. Ultrazvukové fragmentačné protokoly DNA dosahujú reprodukovateľné výsledky fragmentácie. Hielscher ultrasonicators sú schopní produkovať širokú škálu genomických FRAGMENT FRAGMENT distribúcií, presne ovládateľné prostredníctvom prevádzkových parametrov. Vzhľadom k tomu, Hielscher ultrazvukové DNA strihovacie systémy sú k dispozícii pre jednotlivé a viac injekčných liekoviek, rovnako ako pre mikrodoty, príprava vzoriek sa stáva vysoko efektívnym.
Elektrofororetické analýzy genomickej DNA E. coli EDL933 podrobené 0 – 15 min ultrazvukom. L označuje DNA rebrík. (Basselet a kol. 2008)
- opakovateľné/reprodukovateľné výsledky
- presne nastaviteľné na získanie určitej dĺžky fragmentu
- Rýchle spracovanie
- konzistentné výsledky fragmentácie DNA
- zariadenia pre akékoľvek objemy vzoriek (napr. viacnásobné injekčné liekovky alebo mikrodoštiá)
- vysoká priepustnosť
- precízna regulácia teploty
- jednoduchá, užívateľsky prívetivá prevádzka
Sekvenovanie ďalšej generácie: Ultrazvuková fragmentácia DNA pre prípravu knižnice
Na vykonanie sekvenovania novej generácie sa musia vykonať tri základné kroky (1) prípravy knižnice, (2) sekvenovania a (3) analýzy údajov. Počas prípravy knižnice je DNA fragmentovaná, potom sa fragmentové konce opravia (leštia) pridaním jednej adenínovej základne a cieľové fragmenty sa premenia na dvojvláknovú DNA. Nakoniec sú takzvané adaptéry pripojené ligáciou, PCR alebo tagmentáciou tak, aby konečný produkt DNA knižnice mohol byť kvantitovaný na sekvenovanie.
Fragmentácia DNA pomocou ultrazvukom: Najmä ak technológie sekvenovania s krátkym čítaním, ako je Illumina, ktoré nemôžu ľahko čítať dlhšie fragmenty DNA, musia byť stojany DNA fragmentované na určitú veľkosť, ktorú možno spoľahlivo dosiahnuť ultrazvukom.
Ultrazvukom môže byť spoľahlivo použitý pre fragmentáciu DNA, RNA a chromatínu.
Ako funguje ultrazvuková fragmentácia DNA?
Ultrazvukom, tiež známy ako spracovanie akustických vzoriek, je široko používaná metóda fragmentácie DNA. Pre ultrazvukové DNA strihanie, vzorky sú vystavené ultrazvukovým vlnám v kontrolovanom stave. Pracovný princíp ultrazvukovej fragmentácie DNA je založený na vibráciách a kavitácii generovaní ultrazvukovými vlnami. Šmykové sily, ktoré sú výsledkom ultrazvukovej (akustickej) kavitácie, zlomia molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou. Nastavenie ultrazvukom, ako je intenzita (amplitúda, trvanie), pulzačný režim a teplota, umožňujú presnú fragmentáciu DNA na určitú požadovanú dĺžku fragmentov DNA. Zatiaľ čo DNA je často znížená na 100 až 600 bp pomocou ultrazvukom, dlhšie fragmenty DNA až do 1300 bp možno získať, keď sa použijú miernejšie ultrazvukové podmienky.
Ultrazvukové DNA strihanie počas ChIP – Chromatín imunoprecipitácia
Upravené od Jkwchui v cc-BY-SA.03
Regulácia teploty, aby sa zabránilo degradácii DNA
Dvojpásmový molekulárny tvar DNA je vysoko citlivý na zvýšené teploty, takže presná kontrola teploty počas krokov prípravy vzorky je kľúčovým faktorom pre spoľahlivé výsledky analýzy.
Či už používate Hielscherove sondy ultrasonicators, VialTweeter alebo UIP400MTP – kontinuálne monitorovanie a regulácia teploty je zabezpečená vďaka pripojiteľnému snímaču teploty a softvéru inteligentného zariadenia. Aby ste udržali teplotu v určitom rozsahu, môžete nastaviť horný a dolný teplotný limit. V dôsledku toho ultrasonicator zastaví, akonáhle je tento teplotný limit prekročený a automaticky bude naďalej sonikovať, keď teplota klesla o nastavenú ∆T.
Sofistikovaný softvér Hielscher ultrasonicators zaisťuje spoľahlivú údržbu ideálnych podmienok na ošetrenie vzoriek.
Fragmentácia DNA hmotnej vzorky s multi-well dosky ultrasonicator UIP400MTP
Počet vzoriek vo vede o živote sa za posledné desaťročie výrazne zvýšil. To znamená, že počas prípravy a analýzy vzorky sa musí spracovať veľmi vysoký počet vzoriek (napr. 384, 1536 alebo 3456 vrtov na mikrodoštidlo), aby sa dosiahli porovnateľné a platné výsledky. S UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics nasleduje trend spracovania hromadných vzoriek. UIP400MTP je ultrasonicator pre prípravu vzoriek pomocou mikrodoštií. UIP400MTP dokáže spracovať dosky so 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 alebo 3456 studňami. V závislosti od typu mikrodoštidiel môže každá studňa zvyčajne držať objemy vzoriek medzi desiatkami nanolitrov až niekoľko mililitrov. Široko používaný vo výskume vedy o živote, UIP400MTP sa veľmi často používa na prípravu vzoriek pred analýzami, ako je ELISA (enzýmovo spojený imunosorbentný dôkaz) alebo PCR, pred analýzou bielkovín, ako aj na prípravu chromatínu pred CHiP a CHiP-seq, identifikáciu modifikácie histónu a iné analytické ošetrenia (napr. gélová elektroforéza, hmotnostná spektrometria).
VialTweeter na praparáciu vzorky až 10 injekčných liekoviek
VialTweeter je široko používaný laboratórny ultrasonicator VialTweeter, ktorý umožňuje efektívnu a pohodlnú ultrazvukom až 10 injekčných liekoviek súčasne. Keďže injekčné liekovky a skúmavky (napr. injekčné liekovky Eppendorf, kryo injekčné liekovky, odstredivky) sú nepriamo sonicated, akejkoľvek krížovej kontaminácii sa zabráni. Keďže do každej vzorky sa dodáva rovnaká intenzita ultrazvuku, všetky výsledky ultrazvukom sú homogénne a reprodukovateľné. VialTweeter ponúka všetky inteligentné funkcie, ako sú naše ostatné digitálne zariadenia (napr. inteligentné menu, programovateľné nastavenia, regulácia teploty, diaľkové ovládanie atď.), aby bol zabezpečený najvyšší užívateľský komfort.
Sondy s viacerými prstami pre microwellové dosky
K dispozícii pre ultrazvukovú sondu homogenizers UP200Ht a UP200St, viac prstov sondy so 4 alebo 8 prstami sú pohodlnou možnosťou na sonikovanie viac vzoriek súčasne za rovnakých podmienok. Napríklad sonotróda MTP-24-8-96 je osem prstová sonda, ktorá je ideálna pre integráciu do automatizovaných systémov alebo efektívnu manuálnu prípravu vrtov multi-well dosiek. Sonotróda s viacerými prstami je ideálna pre automatizované pre laboratóriá, kde sa spracúvajú väčšinou kadičky a skúmavky pomocou štandardného ultrazvukového sonotródy. Multi-finger a štandardné sondy môžu byť rýchlo prepletené v priebehu niekoľkých minút transformovať jedno sonda ultrasonicator na multi-sonda ultrazvukový disruptor.
Hielscher Ultrasonicators pre fragmentáciu DNA
Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové platformy pre fragmentáciu DNA, RNA a chromatínu. Tieto rôzne platformy zahŕňajú ultrazvukové sondy (sonotródy), nepriame ultrazvukom roztoky pre simultánnu prípravu vzoriek viacerých rúr alebo multi-well dosiek (napr. 96-well dosky, mikrotiterové dosky), sonoreaktory a ultrazvukové cuphorns. Všetky platformy pre strihanie DNA sú poháňané frekvenčne vyladenými, vysokovýkonnými ultrazvukovými procesormi, ktoré sú presne ovládateľné a poskytujú reprodukovateľné výsledky.
Ultrazvukové procesory pre akékoľvek číslo vzorky a veľkosť
S Hielscherovými viac-vzorkovými ultrasonicators VialTweeter (až pre 10 skúmaviek) a UIP400MTP (pre mikrodoštičky / viacdielne dosky) je ľahko možné skrátiť čas spracovania vzorky v dôsledku intenzívnej a presne kontrolovateľnej ultrazvukom pri získavaní požadovaného rozloženia a výnosu fragmentu DNA. Ultrazvuková fragmentácia DNA robí prípravu vzoriek efektívnou, spoľahlivou a škálovateľnou. Protokoly môžu byť lineárne škálované z jednej na početné vzorky použitím neustále riadeného ultrazvuku.
Sonda ultrasonicators s jedným až piatimi prstami sú ideálne pre prípravu menších vzoriek čísel. Hielscher's laboratory ultrasonicators sú k dispozícii v rôznych veľkostiach, takže vám môžeme odporučiť ideálne zariadenie pre vašu aplikáciu a požiadavky.
presné riadenie procesov
Presne kontrolovateľné nastavenia ultrazvukom sú rozhodujúce, pretože vyčerpávajúce sonifikácia môže zničiť DNA, RNA a chromatín, ale nedostatočné ultrazvukové strihanie vedie k príliš dlhým fragmentom DNA a chromatínu. Hielscher digitálne ultrasonicators možno ľahko nastaviť na presný ultrazvukom parameter. Špecifické nastavenia ultrazvukom je možné uložiť aj ako naprogramované nastavenie pre rýchle opakovanie toho istého postupu.
Všetky ultrazvukom sa automaticky protokolujú a ukladajú ako súbor CSV na vstavanej SD karte. To umožňuje presnú dokumentáciu vykonaných skúšok a umožňuje ľahko revidovať ultrazvukom.
Prostredníctvom diaľkového ovládania prehliadača, všetky digitálne ultrasonicators môžu byť prevádzkované a monitorované prostredníctvom akéhokoľvek štandardného prehliadača. Inštalácia ďalšieho softvéru nie je potrebná, pretože pripojenie LAN umožňuje veľmi jednoduché nastavenie plug-n-play.
Najvyššia užívateľská prívetivosť v ultrazvukovej príprave vzoriek
Všetky Hielscher ultrasonicators sú navrhnuté tak, aby poskytovali vysoko výkonný ultrazvuk, zatiaľ čo zároveň sú vždy veľmi užívateľsky prívetivé a ľahko ovládateľné. Všetky nastavenia sú dobre štruktúrované v jasnom menu, ku ktorému je možné ľahko pristupovať prostredníctvom farebného dotykového displeja alebo diaľkového ovládania prehliadača. Inteligentný softvér s programovateľnými nastaveniami a automatickým zaznamenávaním údajov zaisťuje optimálne nastavenia ultrazvukom pre spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky. Čisté a ľahko použiteľné rozhranie menu premení Hielscher ultrasonicators na užívateľsky prívetivé a efektívne zariadenia.
Nižšie uvedená tabuľka vám dáva indikáciu približnej spracovateľskej kapacity našich laboratórnych ultrasonicators, ktoré sú ideálne pre úlohy prípravy vzoriek, ako je fragmentácia DNA a RNA, bunková lýza, ako aj extrakcia bielkovín:
| Zariadenie | Napájanie [W] | Typ | Objem [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP (UIP400MTP) | 400 | pre mikrodosky | 6 – 3456 studní | VialTweeter | 200 | až 10 injekčných liekoviek plus možnosť upínania | 0.5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | Typ sondy | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | Typ sondy | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | Typ sondy | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | Typ sondy | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | Typ sondy | 5,0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, sonoreactor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | bunka bez prúdenia bez kontaminácie |
Kontaktuj nás! / Opýtajte sa nás!
Ultrazvuková jednotka na prípravu viacerých vzoriek VialTweeter umožňuje simultánne ultrazvukom až 10 injekčných liekoviek. S upínacím zariadením VialPress je možné na prednej strane pritlačiť až 4 ďalšie trubice pre intenzívnu sonikáciu.
Sonotróda MTP-24-8-96 má osem ultrazvukových sond pre ultrazvukom studní mikrotiterových dosiek.
Literatúra/referencie
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Fakty stojí za to vedieť
Čo je sekvenovanie novej generácie?
Sekvenovanie novej generácie, tiež sekvenovanie next gen (NGS), sekvenovanie s vysokou priepustnosťou alebo sekvenovanie druhej generácie, sa vzťahuje na prístup masívneho paralelného sekvenovania, kde sa veľmi veľké (masívne) množstvo DNA miliónov fragmentov sekvenuje súčasne paralelne pri behu.
Na vykonanie sekvenovania novej generácie sa musia vykonať tri základné kroky (1) prípravy knižnice, (2) sekvenovania a (3) analýzy údajov. Počas prípravy knižnice musia byť reťazce DNA roztrieštené na fragmenty DNA určitej dĺžky. Ultrazvukom je jednou z preferovaných techník fragmentácie DNA.
Počas procesu sekvenovania DNA sa poradie nukleotidov v DNA – známa ako sekvencia nukleovej kyseliny - je určená. Sekvencia nukleovej kyseliny sa skladá zo štyroch nukleotidových báz – adenínu, cytozínu, guanínu, tymiánu. – ktorý kód pre informáciu.
Sekvenovanie novej generácie je hnacou silou výskumu v oblasti vedy o živote a personalizovanej medicíny, pretože sekvenovanie DNA a RNA sa silne používajú v genomickom výskume, výskume rakoviny, výskume zriedkavých a komplexných chorôb, mikrobiálnom výskume, agrogenomii a mnohých ďalších výskumných oblastiach.
Sekvenovanie novej generácie vs Sanger Sequencing
Zatiaľ čo pri sekvenovaní novej generácie (NGS) je možné sekvenovať obrovské množstvo genomických vzoriek, Sanger Sequencing (tiež známy ako metóda ukončenia reťazca alebo sekvenovanie prvej generácie) má len schopnosť sekvenovať malé vzorkovacie čísla. Sanger sekvenovanie iba sekvenuje jeden fragment DNA naraz a môže byť dosiahnutý za jeden deň. Vďaka svojej akuracii je sekvenovanie Sanger tiež považované za technológiu zlatého štandardu, ktorá sa používa na overenie výsledkov získaných sekvenovaním novej generácie.
Sangerovo sekvenovanie dosahuje dĺžku čítania približne 800bp (zvyčajne 500-600bp s neobohavenou DNA). Dlhšie dĺžky čítania v Sekvenovaní Sanger vykazujú významné výhody oproti iným postupnostiam, najmä pokiaľ ide o sekvenovanie opakujúcich sa oblastí genómu. Výzva údajov o sekvencii s krátkym čítaním je obzvlášť problémom pri sekvenovaní nových genómov (de novo) a pri postupnosti vysoko preskupených genómových segmentov, zvyčajne tých, ktoré sa vyskytujú v genómoch rakoviny alebo v oblastiach chromozómov, ktoré vykazujú štrukturálne variácie. [cp. Morozova a Marra, 2008]
Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizers z laboratórium na priemyselnej veľkosti.