Ultrazvukové strihanie DNA

Pri strihaní DNA a RNA sa dlhé molekuly DNA fragmentujú na menšie časti, čo je kľúčový krok pri príprave vzoriek na tvorbu knižníc pre sekvenovanie novej generácie (NGS). Ultrazvukové strihanie DNA využíva sily akustickej kavitácie na rozdelenie DNA alebo RNA na fragmenty s veľkosťou od 100 bp do 5 kb. Táto metóda umožňuje presnú kontrolu veľkosti fragmentov a uľahčuje prispôsobenie požadovanej dĺžke DNA na dosiahnutie optimálnych výsledkov sekvenovania.

Strihanie DNA pomocou ultrazvuku

Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne riešenia založené na ultrazvuku na strihanie DNA, RNA a chromatínu. Vyberte si sondový ultrazvukový prístroj (napr. UP100H) na priamu sonikáciu pomocou mikrohrotu alebo použite VialTweeeter či ultrazvukový cuphorn na nepriamu prípravu viacerých vzoriek DNA súčasne. Hielscher ponúka ideálny prístroj s ohľadom na vaše potreby: či už máte 1 alebo až 10 vzoriek s objemami od mikrolitrov po litre – sonikátory Hielscher splnia vaše požiadavky na prípravu fragmentov DNA, RNA a chromatínu so správnou dĺžkou. Reprodukovateľnosť, jednoduchá obsluha a presné riadenie umožňujú vytvoriť spoľahlivú knižnicu pre sekvenovanie novej generácie.
Na rozdiel od enzymatickej fragmentácie DNA sa pri ultrazvukovom strihaní uplatňujú čisto mechanické šmykové sily bez pridávania akýchkoľvek chemikálií. Vďaka presnému nastaveniu procesných parametrov vznikajú pri ultrazvukovom strihaní fragmenty DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou (plazmidová a genómová DNA).
Purifikované nukleové kyseliny možno amplifikovať pred krokom fragmentácie alebo po ňom.
Parametre sonikácie (výkon, pulzný cyklus / série impulzov, čas a teplota) možno bezpečne riadiť prostredníctvom softvérových nastavení.

Protokoly na ultrazvukové strihanie DNA

Pre chromatínovú imunoprecipitačnú analýzu

V stručnosti sa bunky vysiali do misiek s priemerom 60mm (400 000 na misku) a transfekovali sa pomocou RhoA siRNA (podľa opisu); po 72 h sa inkubovali s formaldehydom (konečná koncentrácia 1%) počas 10 min pri 37°C, aby sa vytvorili priečne väzby medzi proteínmi a DNA. Reakcia tvorby priečnych väzieb sa zastavila pridaním jednej desatiny objemu 1,25 mol/L glycínu, čím sa dosiahla konečná koncentrácia 125 mmol/L. Bunky sa dvakrát premyli ľadovo studeným PBS, resuspendovali sa v pufri na rádioimunoprecipitačnú analýzu [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholátu, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] obsahujúcom 1 mmol/L fenylmetylsulfonylfluoridu, 1 Ag/mL aprotinínu a 1 Ag/mL pepstatínu A a ponechali sa na ľade počas 30 min. Potom sa bunkové lyzáty sonikovali na ľade ultrazvukovým sonikátorom Hielscher UP200S (3 x 40 s, amplitúda 40%, cyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), kým sa chromatín s priečnymi väzbami nerozstrihal na fragmenty DNA s veľkosťou od 200 do 1 000 bp. Jedna desatina celkového lyzátu sa použila na kvantifikáciu množstva DNA prítomnej v jednotlivých vzorkách a považovala sa za „celkovú vstupnú DNA“. Supernatanty sa inkubovali s 50% suspenziou DNA zo spermií lososa/proteínovej agarózy na zníženie nešpecifického pozadia. Imunoprecipitácia sa potom uskutočnila cez noc pri 4°C s 5 Ag protilátky anti-NF-nB p65 (Upstate) alebo bez protilátky (negatívna kontrola). Do týchto supernatantov sa pridal 5 mol/L NaCl a zahrievali sa cez noc pri 65°C, aby sa zrušili priečne väzby medzi proteínmi a DNA. Imunokomplexy sa ďalej ošetrili proteinázou K bez DNáz a RNáz a DNA sa purifikovala extrakciou fenolom/chloroformom a zrážaním etanolom. PCR sa uskutočnila so špecifickými primérmi zodpovedajúcimi sekvencii v promótorovej oblasti ľudského génu iNOS (primér p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; primér p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Štúdie expresie EGFP

Na štúdie expresie sa rekombinantný kmeň L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Nemecko) s génom pre EGFP (zosilnený zelený fluorescenčný proteín) integrovaným do chromozomálneho ssu kultivoval v rôznych médiách, ako bolo opísané vyššie, s dodatočným prídavkom 100 mg l^-1 antibiotika Nourseothricin (Jena Bioscience, Nemecko). Počas kultivácie sa odoberali vzorky s objemom 1 ml, centrifugovali sa (2000 × g, 20°C, 10 min) a premývali roztokom 0,9% NaCl. Pelet sa resuspendoval v pufri (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) a dezintegroval sonikáciou pomocou ultrazvukového procesora UP400S (dodaná energia ∼ 400 Ws). Bunkové zvyšky sa odstránili centrifugáciou (6000 × g, 4°C, 5 min) a analyzovali elektroforézou v polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným (SDS-PAGE) za redukčných podmienok podľa Laemmliho metódy (1970) s použitím 12,5% polyakrylamidových gélov. Expresia EGFP sa skúmala v kultúre za miešania. (Fritsche et al. 2007)

Imunoprecipitácia chromatínu

Imunoprecipitácia chromatínu sa vykonala s použitím ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) podľa pokynov výrobcu s niekoľkými úpravami. V stručnosti, diferencované ľudské podocyty sa sieťovali pomocou 1% formaldehydu počas 10 min pri izbovej teplote. Bunky sa premyli ľadovo chladným PBS a fixačná reakcia sa zastavila pridaním 0,125 M glycínu na 5 min pri izbovej teplote. Bunky sa opäť premyli ľadovo chladným PBS a zoškrabali z misky. Bunky sa centrifugáciou získali vo forme peletu a resuspendovali v lyzačnom pufri. Po centrifugácii sa jadrá získané vo forme peletu resuspendovali v pufri na strihanie, inkubovali na ľade počas 30 min a chromatín sa strihal sonikáciou, napr. pomocou UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Nemecko) pri 25% výkone piatimi pulzmi, každý v trvaní 20 sec, na ľade na fragmenty s veľkosťou približne 200–600 bp. Rozstrihaný chromatín sa potom centrifugoval a supernatant sa odobral. Na imunoprecipitáciu sa 60 μl chromatínu inkubovalo s 1 μg protilátok proti Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo) alebo NF-κB p50 (Abcam), prípadne s králičím IgG (Zymed Laboratories) ako negatívnou kontrolou, cez noc pri 4°C za jemného otáčania. Imunokomplexy naviazané na magnetické guľôčky sa zachytili pomocou magnetického stojana, dôkladne sa premyli, priečne väzby medzi proteínmi a DNA sa zrušili a DNA sa eluovala na analýzu pomocou PCR v reálnom čase. (Ristola et al. 2009)

Príprava DNA EHEC na analýzu pomocou čipových polí

Príprava bunkových lyzátov a extrahovaných DNA
Bakteriálne pelety suspendované v PBS na požadovanú konečnú koncentráciu sa spracovali ultrazvukovým dezintegrátorom UP100H (Hielscher GmbH, Nemecko) vybaveným mikrohrotom MS1 (s priemerom 1mm). Pracovná frekvencia bola 30 kHz a efektívny výstupný výkon bol 100 W. Počas prevádzky sa vzorky chladili v kúpeli z ľadu a vody, miešali a centrifugovali. Vzorky sa použili na štúdie prietokovou cytometriou, zatiaľ čo na neskoršie spracovanie sa vzorky podrobili tepelnému ošetreniu (95°C, 5 min). Surové bunkové lyzáty sa spracovali zmesou fenol:chloroform:izoamylalkohol (25:24:1). K vzorke lyzátu sa pridal rovnaký objem tejto zmesi, roztok sa intenzívne miešal na vortexovom miešači počas 15 s a centrifugoval pri 15 000 x g počas 2 min pri izbovej teplote (RT) približne 22°C. Horná vodná fáza obsahujúca genómovú DNA sa opatrne oddelila a preniesla do novej sterilnej skúmavky Eppendorf.
Následne sa vzorky sonikovali s cieľom fragmentovať DNA. Sonikácia sa uskutočnila za rovnakých podmienok, ako je opísané vyššie. Na vyhodnotenie účinkov fragmentácie na genómovú DNA sa vzorky analyzovali pomocou elektroforézy v agarózovom géli.
(…) Vzorky predtým sonikované počas 2,5 min sa po tepelnom ošetrení a centrifugácii podrobili extrakcii. Uvoľnená DNA sa dvakrát extrahovala zmesou fenol:chloroform:izoamylalkohol a následne sa podrobila druhej sonikácii počas 0 – 15 min. Na stanovenie distribúcie veľkostí DNA podrobenej ultrazvukovej fragmentácii po extrakcii sa použila elektroforéza v agarózovom géli (obr. vpravo hore). Vysoká miera fragmentácie DNA bola zrejmá z prítomnosti rozmazanej stopy DNA namiesto pásov s vysokou molekulovou hmotnosťou, ktoré sa vo vzorkách sonikovaných počas 2,5 min alebo dlhšie už nevyskytovali. Dlhšia sonikácia postupne skracovala fragmenty približne na 150 – 600 bp a sonikácia počas 15 min tieto fragmenty ďalej degradovala, čo je viditeľné najmä v hornej časti rozmazanej stopy. Priemerná veľkosť fragmentov DNA sa teda s časom pôsobenia ultrazvuku postupne zmenšovala a ošetrenie počas 5 min umožnilo získať fragmenty DNA s veľkosťami najvhodnejšími na analýzy pomocou čipových polí. Napokon sa zaviedol postup prípravy analytu DNA zahŕňajúci najprv 2 min ultrazvukového ošetrenia, extrakciu DNA (2×) a následnú sonikáciu počas 5 min. (Basselet et al. 2008)

Imunoprecipitácia chromatínu (ChIP)

Bunky HEK293 sa kultivovali podľa vyššie uvedeného opisu a fixovali sa 2 mM disukcínimidylglutarátom počas 45 min pri izbovej teplote. Následne sa bunky dvakrát premyli PBS. Chromatín sa zosieťoval počas 10 min pri izbovej teplote pomocou 1% (v/v) formaldehydu a dvakrát sa premyl ľadovo chladným PBS. Zosieťovacia reakcia sa zastavila inkubáciou s glycínom pri konečnej koncentrácii 0,125 M počas 5 min pri izbovej teplote. Po inkubácii s trypsínom sa bunky zoškrabali z misky na kultiváciu buniek a dvakrát sa premyli PBS. Bunkový sediment sa resuspendoval v lyzačnom pufri (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl a 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkuboval sa na ľade počas 10 min a homogenizoval sa Dounceovým homogenizátorom. Následne sa jadrá sedimentovali centrifugáciou (3500 x g, 5 min, 4 °C) a resuspendovali sa v pufri pre jadrá (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA a 1% (w/v) SDS). Jadrá sa rozrušili sonikáciou tromi 20-s impulzmi v sonikátore UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) pri nastavení cyklu 0,5 a amplitúdy 30%, čím sa získali fragmenty genómovej DNA s prevažujúcou veľkosťou 200 – 1000 bp. Na ChIP sa 50g DNA zriedilo 4-násobne v imunoprecipitačnom pufri (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 a 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analýza modifikácií histónov pomocou imunoprecipitácie chromatínu (ChIP)

Stručne, 6 x 10⁶ buniek sa dvakrát premylo PBS a na kultivačnej platni sa počas 15 min pri izbovej teplote v prítomnosti 0,5% formaldehydu vytvorili priečne väzby. Reakcia tvorby priečnych väzieb sa zastavila pridaním 0,125 M glycínu. Všetky nasledujúce kroky sa uskutočnili pri 48°C. Všetky pufre boli vopred vychladené a obsahovali inhibítory proteáz (Complete Mini, Roche). Bunky sa dvakrát premyli PBS a potom sa zoškrabali. Získané pelety sa rozpustili v 1 ml lyzačného pufra (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) a sonikovali sa v studenom etanolovom kúpeli počas 10 cyklov pri 100% amplitúde pomocou sonikátora UP50H (Hielscher, Teltow, Nemecko). Fragmentácia chromatínu sa vizualizovala v 1% agarózovom géli. Získané fragmenty boli v rozsahu 200–500pb. Rozpustný chromatín sa získal centrifugáciou sonikovaných vzoriek pri 14 000g počas 10 min pri 48°C. Rozpustná frakcia sa zriedila v pomere 1/10 v riediacom pufri (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), potom sa rozdelila na alikvotné podiely a skladovala pri 80°C až do použitia. (Rodriguez et al. 2008)