Ultrazvukové DNA Strihanie

• Počas strihanie DNA a RNA sa molekuly DNA rozčlenia na menšie kúsky. Fragmentácia DNA/RNA je jednou z dôležitých krokov vzorky prípravka potrebné vytvoriť knižnice pre ďalšiu generáciu sekvencovaní (NGS).
• Ultrazvukový DNA strihanie používa sily akustickej kavitácie rozbiť DNA alebo RNA na kúsky 100 – 5kb BP.
• Ultrazvukový strihanie umožňuje presnú fragmentáciu DNA a adaptácia na požadovanú dĺžku DNA.

Ultrazvukové DNA Strihanie

Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové-založené riešenia pre DNA, RNA a chromatín strihanie. Vyberte si medzi sondy typu ultrasonicators (napr. UP100H) pre priamu ultrazvukom pomocou microtip, alebo použite VialTweeeter alebo Ultrazvukový CupHorn pre nepriame prípravu DNA rôznych vzoriek súčasne. Hielscher ponúka ideálne zariadenie vzhľadom na vaše potreby: počasie máte 1 alebo až 10 vzoriek, objemy z mikrolitra na liter objemy – Hielscher ultrazvukové procesory sú k dispozícii pre splnenie vašich požiadaviek na prípravu DNA, RNA a chromatín fragmenty v správnej dĺžke. Reprodukovateľnosť, ľahká obsluha a presné ovládanie umožňujú spoľahlivú knižnicu pre sekvenovanie budúcej generácie.
Na rozdiel od enzymatickej fragmentácie DNA, Ultrazvukový strihanie aplikuje čisté mechanické šmykové sily bez pridania chemikálií. Presným nastavením parametrov procesu, Ultrazvukový strihanie produkuje vysokofrekvenciu DNA fragmenty (plazmid a genomické DNA).
Vyčistené nukleové kyseliny môžu byť zosilnené pred alebo po fragmentácii krok.
Parametre ultrazvukom (výkon, pulzný cyklus/praskne, čas a teplota) možno bezpečne ovládať pomocou nastavení softvéru.

Protokoly pre ultrazvukové DNA strihanie

Pre test chromatínu Imunoprecipitácie

Stručne povedané, bunky boli pokovované v 60 mm-priemer riadu (400 000 na jedlo) a prenesené s rhoa siRNA (ako je popísané); po 72 h, boli inkubované formaldehydom (Konečná koncentrácia, 1%) 10 min pri 37 ° c na krížové prepojenie proteínov do DNA. Krížová reakcia bola kalená pridaním jeden-desiaty objem 1,25 mol/L glycín, čo 125 mmol/L konečnej koncentrácie. Bunky boli umývané dvakrát s ľadom-studeným PBS, resuspendovaný v teste rádioimunoprecipitácie (150 mmol/L NaCl, 1% 0,5 NP40% deoxycholátu, 0,1% KBÚ, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L tris-HCl (pH 8,0)] obsahujúce 1 mmol/L fenylmetylsulfonyl aprotinín a 1 AG/mL pepstatínu a, ktorý sa udržiava na ľade po dobu 30 min. Potom, bunky lyzáty boli sonicated na ľad s Hielscher UP200S Ultrazvuk zhluk (3 x 40 s, amplitúda 40%, cyklus 1; Hielscher ultrasonics GmbH), kým cross-súvisiace chromatins boli strihaný na výnos fragmentov DNA medzi 200 a 1 000 BP. Jedna desatina celého lysátu sa použila na kvantitatívne množstvo DNA prítomnej v rôznych vzorkách a považovaných za “Celková vstupná DNA”. Supernatanty boli inkubované s lososom spermie DNA/proteín agarose-50% kalu na zníženie nešpecifické pozadie. Imunoprecipitácia sa potom uskutočnila cez noc pri teplote 4 ° c s 5 AG anti-NF-nB P65 (Upstate) alebo bez protilátok (negatívna kontrola). Tieto supernatanty boli doplnené 5 mol/L NaCl a vyhrievané cez noc pri 65 ° c, aby sa vrátili proteín-DNA krížové odkazy. Imunokomplexy boli ďalej ošetrené DNase-a RNase-Free proteinázy K, a DNA bola vyčistená fenol/chloroform extrakcie a etanol zrážok. PCR sa vykonalo pomocou špecifických primérov zodpovedajúcich sekvencii v rámci promotéra génu ľudského iNOS (P1 Primer: 5 ¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3 ¶; P2 Primer: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3 ¶). (Doublier et al., 2008)

Štúdie EGFP-Expression

Pre expresné štúdie, rekombinantný kmeň L. tarentolae P10:: F9Begfp 1.4 dBsat # 12 (Jena Bioscience, Nemecko) s génom pre EGFP (rozšírená zelená fluorescenčná bielkovina), chromozomálne SSU integrovaný, bol kultivovaný v rôznych médiách, ako je opísané predtým a dodatočne doplnené 100 mg l^-1. Nourseothricin (Jena Bioscience, Nemecko). Počas kultivácie boli odobraté 1 ml vzorky, odstrelené (2000 × g, 20 ° c, 10 min) a premyje sa 0,9% roztokom NaCl. Pellet bol resuspendovaný v tlmivom roztoku (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) a rozpadal sonification s ultrazvukovým procesorom Up400s (použitie energie ∼ 400 WS). Bunkové nečistoty boli odstránené odstreďovaním (6000 × g, 4 ° c, 5 min) a analyzované dodekyl sulfát sodný – Polyakrylamidový gél elektroforéza (SDS-PAGE) za podmienok znižovania podľa metódy Laemmli (1970) s 12,5% polyacralamid gély. EGFP-Expression bol preskúmaný v agitovanej kultúre. (Fritsche et al. 2007)

Chromatín imunoprecipitácia

Test chromatínu imunoprecipitácie sa vykonal pomocou ChIP-IT^Tm Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) podľa pokynov výrobcu s určitými úpravami. Stručne povedané, diferencované ľudské podocyty boli cross-spojený s 1% formaldehydu po dobu 10 min pri izbovej teplote. Bunky boli umývané ľadom-studený PBS a fixačná reakcia bola zastavená pridaním 0,125 M glycín 5 min pri izbovej teplote. Bunky boli znovu umyť ľadom-studený PBS a poškriabaný z misky. Bunky boli granulované centrifugáciou a resuspendovali v tlmivom roztoku. Po centrifugácii sa peletované jadrá resuspendovali do tlmivého vankúša, inkubujú sa na ľade po dobu 30 minút a chromatín bol strihaný ultrazvukom, napr. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Nemecko) na 25% výkon 5 impulzov 20 sec každý na ľad na fragmenty približne 200-600 BP. Strihaný chromatín bol potom odstrelil a supernatant bol zachytený. Pri imunoprecipitáciách sa 60 μl chromatínu inkubuje s 1 μg SP1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB P65 (Abcam, Cambridge, UK) alebo NF-κB P50 (Abcam) protilátky alebo s králičom IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), ako negatívnu kontrolu, cez noc pri teplote 4 ° c s jemným otáčaním. Imunokomplexy viazané na magnetické korálky boli zhromaždené pomocou magnetického stojana, umyť extenzívne a proteín/DNA prekríženia boli obrátené a DNA eluovaný pre Real-time analýzy PCR. (Ristola et al. 2009)

Príprava DNA EHEC na analýzu čipových polí

Usporiadanie buniek lyzáty a extrahované dnas
Bakteriálne pelety suspendované v PBS na požadovanú konečnú koncentráciu boli liečené Ultrazvuk disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Nemecko) vybavené mikrošpičkou MS1 (priemer 1 mm). Prevádzková frekvencia bola 30 kHz a efektívny výstupný výkon bol 100 W. Počas operácie sa vzorky ochladili v ľadovej vodnom kúpeli, zmiešali a odstredili. Vzorky boli využité na štúdie prietokového cytometrie, zatiaľ čo pre neskoršiu manipuláciu boli vzorky podrobené tepelnému ošetreniu (95 ° c, 5 min). Surové bunky lyzáty boli spracované zmesou fenolu: chloroform: izoamyl alkohol (25:24:1). Rovnaký objem tejto zmesi bol pridaný do vzorky s lyofilizátom, roztok bol silne pretvorený na 15 s a odstrelil pri 15 000 x g počas 2 min pri izbovej teplote (RT) okolo 22 ° c. Horná vodná fáza obsahujúca genomickú DNA bola starostlivo oddelená a zhromaždila sa v novej sterilnej trubici Eppendorf.
Následne boli vzorky sonicated na fragment DNA. Ultrazvukom krok bol realizovaný za rovnakých podmienok, ako je popísané vyššie. Na vyhodnotenie fragmentácie účinky na genomické DNA, vzorky boli analyzované pomocou agarózový gél elektroforéza.
(…) Vzorky sonicated predtým 2,5 min boli podrobené extrakcii krok po tepelnom spracovaní a odstregácii. DNA uvoľnená bola extrahovaná dvakrát s fenol: chloroform: izoamyl alkohol mix, a potom podrobené druhej ultrazvukom pre 0-15 min. Agarose gél elektroforéza bol použitý na určenie veľkosti distribúcie DNA podrobené post-extrakcie Ultrazvukový fragmentácia (obr. v pravej hornej časti). Veľmi roztrieštená DNA bola zrejmá z prítomnosti DNA škvrna, skôr než high-molekulová hmotnosť kapely, ktoré boli odstránené zo vzoriek sonicated za 2,5 min alebo dlhšie. Dlhšia ultrazvukom postupne znižuje fragment dĺžky približne 150-600 BP, a ultrazvukom po dobu 15 min ďalej degradovaný tieto fragmenty, ako je vidieť prevažne v hornej časti náteru. Tak, priemerná DNA fragment veľkosť postupne klesla s ultrazvukom čas a 5 min ošetrenie povolené získať veľkosti fragmentov DNA najvhodnejšie pre čip Array testy. Nakoniec bol zavedený postup prípravy analytu DNA pozostávajúci z prvých 2 min ultrazvukovej liečby, extrakcie DNA (2 ×) a následnej 5-minútovej ultrazvukom. (Basselet a kol. 2008)

Chromatín imunoprecipitácia (ChIP)

HEK293 bunky boli kultivované, ako je popísané vyššie a upevnené s 2 mM disuccinimidyl-glutarát pre 45 min pri izbovej teplote. Následne boli bunky umývané dvakrát s PBS. Chromatín bol krížový spojený 10 min pri izbovej teplote s použitím 1% (v/v) formaldehydu a dvakrát sa umyl s ľadom-studeným PBS. Krížová reakcia bola zastavená inkubáciou glycínu v konečnej koncentrácii 0,125 M po dobu 5 min pri izbovej teplote. Po inkubácii s trypsin, bunky boli poškriabaný z misky bunkovej kultúry a umyť dvakrát s PBS. Bunková pelety bola resuspendovaná v rozpadu medzipamäte (5 mM rúrky, pH 8,0, 85 mM KCl, a 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubované na ľade po dobu 10 min, a homogenizované s Dounce homogenizer. Následne boli jadrá granulované centrifugáciou (3500 x g, 5 min., 4 ° c) a resuspendovaná v nukleovej tlmivej (50 mM tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA a 1% (w/v) KBÚ). Jadrá boli narušené sonikáciou s 3 20-s impulzy v UP50H zhluk (Hielscher Ultraschall Technologie) na nastavenie cyklu 0,5 a amplitúdy 30%, ktoré prinášajú genomické DNA fragmenty s objemovej veľkosti 200-1000 bp. V prípade ChIP sa 50g DNA zriedi 4-násobne v medzipamäti imunoprecipitácie (16,7 mM tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 a 0,01% (w/v) KBÚ). (Weiske et al. 2006)

Analýza modifikácií histónu chromatínu imunoprecipitácie (ChIP)

Stručne povedané, 6 x 10⁶ bunky boli umývané dvakrát s PBS a cross-spojený na kultivačné dosky na 15 min pri izbovej teplote v prítomnosti 0,5% formaldehydu. Cross-spájajúcej reakcia bola zastavená pridaním 0,125 M glycín. Všetky nasledujúce kroky sa vykonali pri 48 ° c. Všetky medzipamäte boli predchladené a obsiahnuté inhibítory proteáz (Complete mini, Roche). Bunky boli umývané dvakrát s PBS a potom poškriabaný. Zozbierané pelety boli rozpustené v 1 ml tlmivého roztoku (1% KBÚ, 5 mM EDTA, 50 mM tris pH 8) a boli sonicated v studenom etanole kúpeli po dobu 10 cyklov pri 100% amplitúdy pomocou UP50H zhluk (Hielscher, Teltow, Nemecko). Chromatín fragmentácia bol vizualizovaný v 1% agarózový gél. Získané fragmenty boli v rozmedzí 200 – 500pb. Rozpustný chromatín sa získal odstreďovaním sonicated vzoriek pri teplote 14 000 g počas 10 min pri 48 ° c. Rozpustná frakcia bola zriedená 1/10 v zrieďovacom tlmivom roztoku (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM tris pH 8, 150 mM NaCl), potom sa po použití alicitoval a skladuje pri teplote 80 ° c. (Rodriguez et al. 2008)