Ultrazvukové strihanie DNA

Počas strihania DNA a RNA sú dlhé molekuly DNA fragmentované na menšie kúsky, čo je kľúčový krok pri príprave vzoriek na konštrukciu knižnice sekvenovania novej generácie (NGS). Ultrazvukové strihanie DNA využíva akustické kavitačné sily na rozbitie DNA alebo RNA na fragmenty v rozmedzí od 100 bp do 5 kb. Táto metóda umožňuje presnú kontrolu nad veľkosťou fragmentu a uľahčuje prispôsobenie požadovanej dĺžke DNA pre optimálne výsledky sekvenovania.

Strihanie DNA pomocou ultrazvuku

Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové riešenia pre strihanie DNA, RNA a chromatínu. Vyberte si medzi ultrazvukovými prístrojmi typu sondy (napr. UP100H) na priamu sonikáciu pomocou mikrohrotu, alebo použite VialTweeeter alebo ultrazvukový cuphorn na nepriamu prípravu DNA rôznych vzoriek súčasne. Spoločnosť Hielscher ponúka ideálne zariadenie s ohľadom na vaše potreby: či už máte 1 alebo až 10 vzoriek, objemy od mikrolitrov po litre – Hielscher sonikátory splnia vaše požiadavky na prípravu fragmentov DNA, RNA a chromatínu v správnej dĺžke. Reprodukovateľnosť, jednoduchá obsluha a presné ovládanie umožňujú spoľahlivú knižnicu pre sekvenovanie novej generácie.
Na rozdiel od enzymatickej fragmentácie DNA aplikuje ultrazvukové strihanie čisté mechanické šmykové sily bez pridania akýchkoľvek chemikálií. Presným nastavením procesných parametrov vytvára ultrazvukové strihanie fragmenty DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou (plazmid a genómová DNA).
Purifikované nukleové kyseliny môžu byť amplifikované pred alebo po fragmentačnom kroku.
Parametre sonikácie (výkon, pulzný cyklus / dávky, čas a teplota) je možné bezpečne ovládať pomocou softvérových nastavení.

Protokoly pre ultrazvukové strihanie DNA

Pre chromatínový imunoprecipitačný test

Stručne povedané, bunky boli pokovované v miskách s priemerom 60 mm (400 000 na misku) a transfekované RhoA siRNA (ako je opísané); po 72 hodinách boli inkubované s formaldehydom (konečná koncentrácia, 1 %) po dobu 10 minút pri 37 °C, aby sa proteíny zosieťovali s DNA. Reakcia zosieťovania bola uhasená pridaním jednej desatiny objemu 1,25 mol/l glycínu, čím sa získala konečná koncentrácia 125 mmol/l. Bunky boli dvakrát premyté ľadovo studeným PBS, resuspendované v rádioimunoprecipitačnom testovacom pufri [150 mmol/l NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholát, 0,1% SDS, 5 mmol/l EDTA, 50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0)] obsahujúcim 1 mmol/l fenylmetylsulfonylfluorid, 1 Ag/ml aprotinínu a 1 Ag/ml pepstatínu A a udržiavané na ľade 30 minút. Potom boli bunkové lyzáty sonikované na ľade pomocou Hielscher UP200S ultrazvukový sonikátor (3 x 40 s, amplitúda 40%, cyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), kým neboli zosieťované chromatíny strihané, aby sa získali fragmenty DNA medzi 200 a 1 000 bp. Jedna desatina celého lyzátu sa použila na kvantifikáciu množstva DNA prítomnej v rôznych vzorkách a považovala sa za “celkový vstup DNA”. Supernatanty boli inkubované s lososovými spermiami DNA/proteínom agarózo-50% kaše, aby sa znížilo nešpecifické pozadie. Imunoprecipitacia sa potom vykonala cez noc pri 4 °C s 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) alebo bez protilátok (negatívna kontrola). Tieto supernatanty boli doplnené 5 mol/l NaCl a zahrievané cez noc na 65 °C, aby sa obnovili krížové väzby proteín-DNA. Imunokomplexy boli ďalej ošetrené proteinázou K bez DNázy a RNázy a DNA bola purifikovaná extrakciou fenolu/chloroformu a zrážaním etanolu. PCR bola vykonaná so špecifickými primérmi zodpovedajúcimi sekvencii v oblasti promotora ľudského génu iNOS (p1 primér: 5¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶). (Doublier a kol., 2008)

Štúdie expresie EGFP

Pre expresné štúdie bol rekombinantný kmeň L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Nemecko) s génom pre EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), integrovaný chromozomálny ssu, kultivovaný v rôznych médiách, ako je opísané vyššie, a dodatočne doplnený o 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Nemecko). Počas kultivácie sa odobralo 1 ml vzoriek, odstredilo sa (2000 × g, 20 °C, 10 min) a premylo sa 0,9% roztokom NaCl. Peleta bola resuspendovaná v pufričke (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) a rozbitá sonifikáciou s ultrazvukovým procesorom UP400S (aplikácia energie ∼ 400 Ws). Bunkové zvyšky boli odstránené centrifugáciou (6000 × g, 4 °C, 5 min) a analyzované elektroforézou dodecylsulfátu sodného – polyakrylamidového gélu (SDS-PAGE) za redukčných podmienok podľa metódy Laemmliho (1970) s 12,5 % polyakralamidovými gélmi. Expresia EGFP bola skúmaná v rozrušenej kultúre. (Fritsche et al. 2007)

Imunoprecipitácia chromatínu

Test imunoprecipitácie chromatínu bol vykonaný pomocou ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) podľa pokynov výrobcu s niekoľkými úpravami. Stručne povedané, diferencované ľudské podocyty boli zosieťované s 1% formaldehydom po dobu 10 minút pri izbovej teplote. Bunky sa premyli ľadovo studeným PBS a fixačná reakcia sa zastavila pridaním 0,125 M glycínu po dobu 5 minút pri izbovej teplote. Bunky boli opäť umyté ľadovo vychladeným PBS a zoškrabané z misky. Bunky boli granulované centrifugáciou a resuspendované v lyzačnom pufri. Po odstredení sa peletované jadrá resuspendovali v strihacom pufri, inkubovali sa na ľade 30 minút a chromatín sa striahol sonikáciou, napr. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Nemecko) pri 25% výkone 5 impulzov po 20 sekundách na ľade na fragmenty približne 200–600 bp. Strihaný chromatín sa potom odstredil a supernatant sa zozbieral. Na imunoprecipitácie sa 60 μl chromatínu inkubovalo s 1 μg protilátok Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) alebo NF-κB p50 (Abcam) alebo s IgG králikov (Zymed Laboratories), ako negatívna kontrola, cez noc pri 4 °C s jemnou rotáciou. Imunokomplexy naviazané na magnetické guľôčky sa zozbierali pomocou magnetického stojana, rozsiahlo sa premyli a zosieťované proteín/DNA sa obrátili a DNA sa eluovala na analýzu PCR v reálnom čase. (Ristola a kol. 2009)

Príprava EHEC DNA na analýzu čipového poľa

Usporiadanie bunkových lyzátov a extrahovaných DNA
Bakteriálne pelety suspendované v PBS na požadovanú konečnú koncentráciu boli ošetrené ultrazvukový disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Nemecko) vybavený mikrošpičkou MS1 (priemer 1 mm). Pracovná frekvencia bola 30 kHz a efektívny výstupný výkon bol 100 W. Počas operácie sa vzorky ochladzovali v ľadovo-vodnom kúpeli, miešali a odstreďovali. Vzorky boli použité na štúdie prietokovej cytometrie, zatiaľ čo pre neskoršiu manipuláciu boli vzorky podrobené tepelnému spracovaniu (95 °C, 5 min). Lyzáty surových buniek boli spracované zmesou fenol:chloroform:izoamylalkohol (25:24:1). Rovnaký objem tejto zmesi sa pridal do vzorky lyzátu, roztok sa energicky víril po dobu 15 sekúnd a odstredil sa pri 15 000 x g počas 2 minút pri izbovej teplote (RT) okolo 22 °C. Horná vodná fáza obsahujúca genómovú DNA bola starostlivo oddelená a zhromaždená do novej sterilnej Eppendorfovej skúmavky.
Následne boli vzorky sonikované, aby sa fragmentovala DNA. Krok sonikácie bol realizovaný za rovnakých podmienok, ako je opísané vyššie. Na vyhodnotenie fragmentačných účinkov na genómovú DNA boli vzorky analyzované pomocou elektroforézy agarózového gélu.
(…) Vzorky predtým sonikované po dobu 2,5 minúty boli podrobené extrakcii po tepelnom spracovaní a odstreďovaní. Uvoľnená DNA bola dvakrát extrahovaná zmesou fenol:chloroform:izoamylalkohol a potom podrobená druhej sonikácii po dobu 0 – 15 minút. Na stanovenie veľkostnej distribúcie DNA podrobenej ultrazvukovej fragmentácii po extrakcii bola použitá elektroforéza agarózového gélu (obr. vpravo hore). Vysoko fragmentovaná DNA bola zrejmá skôr z prítomnosti náteru DNA ako pásov s vysokou molekulovou hmotnosťou, ktoré boli eliminované zo vzoriek sonikovaných 2,5 minúty alebo dlhšie. Dlhšia sonikacia postupne zmenšovala dĺžku fragmentov na približne 150 – 600 bp a sonikácia po dobu 15 minút tieto fragmenty ďalej degradovala, čo je vidieť najmä z hornej časti náteru. Priemerná veľkosť fragmentu DNA sa teda postupne znižovala s časom ultrazvuku a 5-minútová liečba umožnila získať veľkosti fragmentov DNA, ktoré sú najvhodnejšie pre testy čipového poľa. Nakoniec bol zavedený postup prípravy DNA analytu pozostávajúci z prvých 2 minút ultrazvukového ošetrenia, extrakcie DNA (2×) a následnej 5-minútovej sonikácie. (Basselet et al. 2008)

Chromatínová imunoprecipitacia (ChIP)

Bunky HEK293 boli kultivované tak, ako je opísané vyššie, a fixované 2 mM disuccinimidylglutarátom po dobu 45 minút pri izbovej teplote. Následne boli bunky dvakrát premyté PBS. Chromatín bol zosieťovaný 10 minút pri izbovej teplote pomocou 1% (v/v) formaldehydu a dvakrát premytý ľadovo studeným PBS. Zosieťovacia reakcia bola zastavená inkubáciou s glycínom v konečnej koncentrácii 0,125 M počas 5 minút pri izbovej teplote. Po inkubácii s trypsínom boli bunky zoškrabané z misky na bunkovú kultúru a dvakrát premyté PBS. Bunková peleta bola resuspendovaná v lýznom pufri (5 mM rúrky, pH 8.0, 85 mM KCl a 0.5% (v/v) Nonidet P-40), inkubovaná na ľade 10 minút a homogenizovaná homogenizátorom Dounce. Následne boli jadrá peletované centrifugáciou (3500 x g, 5 min, 4 °C) a resuspendované v tlmivom roztoku jadier (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA a 1% (w/v) SDS). Jadrá boli narušené sonikáciou s tromi 20-s pulzmi v a Ultrazvuk UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) pri nastavení cyklu 0,5 a amplitúdy 30 %, čím sa získajú fragmenty genómovej DNA s objemovou veľkosťou 200 – 1000 bp. Pre ChIP bolo 50 g DNA zriedené 4-násobne v imunoprecipitačnom pufri (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1 % (v/v) Triton X-100 a 0,01 % (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analýza modifikácie histónov pomocou imunoprecipitácie chromatínu (ChIP)

Stručne, 6 x 10⁶ bunky sa dvakrát premyli PBS a zosieťovali na kultivačnej platni po dobu 15 minút pri izbovej teplote v prítomnosti 0,5% formaldehydu. Reakcia zosieťovania bola zastavená pridaním 0,125 M glycínu. Všetky nasledujúce kroky boli vykonané pri 48 °C. Všetky pufre boli predchladené a obsahovali inhibítory proteázy (Complete Mini, Roche). Bunky sa dvakrát umyli PBS a potom sa zoškrabali. Zozbierané pelety sa rozpustili v 1 ml lýzneho pufra (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) a sonikovali sa v studenom etanolovom kúpeli počas 10 cyklov pri 100% amplitúde pomocou Ultrazvuk UP50H (Hielscher, Teltow, Nemecko). Fragmentácia chromatínu bola vizualizovaná v 1% agarózovom géli. Získané fragmenty boli v rozmedzí 200–500 pb. Rozpustný chromatín sa získal odstredením sonikovaných vzoriek pri 14 000 g počas 10 minút pri 48 °C. Rozpustná frakcia sa zriedila 1/10 v riediacom pufri (1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), potom sa alikotovala a skladovala pri 80 °C až do použitia. (Rodriguez et al. 2008)