Príprava plazmidov pomocou ultrazvuku

Ultrazvukové spracovanie je spoľahlivou technikou fragmentácie plazmidovej DNA. Presne regulovateľná amplitúda, pulzný režim a regulácia teploty sú najdôležitejšími vlastnosťami ultrazvukového prístroja na fragmentáciu plazmidov bez ich poškodenia. Použitie určitých látok navyše pomáha chrániť plazmidy pred degradáciou. Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne riešenia na riadenú fragmentáciu plazmidov, od spracovania jednotlivých liekoviek až po súčasnú sonikáciu mnohých vzoriek, ako aj viacerých jamiek v doštičkách. Zistite viac o úspešnej ultrazvukovej fragmentácii plazmidov!

Strihanie plazmidov pomocou ultrazvuku

Keď sú vzorky DNA vystavené ultrazvukovým vlnám, vibrácie vytvárané ultrazvukom vyvolávajú v kvapaline akustickú kavitáciu, ktorá mechanickými silami strihá alebo láme molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou. Sonikácia je najpoužívanejšou metódou pri experimentoch so strihaním DNA vo veľkom rozsahu vrátane aplikácií, ako je chromatínová imunoprecipitácia (ChIP), pri ktorých sú malé veľkosti fragmentov absolútne nevyhnutné na dosiahnutie vysokého rozlíšenia. (porov. Tseng et al., 2012)
Plazmidová DNA (pDNA) je špecifickou formou DNA, ktorá sa vyznačuje kruhovým tvarom a nachádza sa v baktériách a niektorých eukaryotoch.
Superšpiralizovaná pDNA je požadovanou formou plazmidovej DNA, pretože vykazuje najlepšie výsledky v nadväzujúcich procesoch, ako sú automatizované sekvenovanie a transfekcia. Ultrazvukové spracovanie je vhodné na úspešnú fragmentáciu pDNA vrátane superšpiralizovanej pDNA.
Thompson et al. (2008) preukázali, že sonikácia plazmidov, o ktorej je známe, že fragmentuje superšpiralizovanú DNA, je účinným spôsobom zlepšenia dĺžok sekvenačných čítaní s kvalitou phred20 do takej miery, že sa významne nelíšia od dĺžok čítaní kontrolného templátu spoločnosti Beckman Coulter alebo enzymaticky linearizovaných plazmidov.

Použitie plazmidových vektorov

Plazmidy sa často používajú ako nástroje na klonovanie, prenos a manipuláciu s génmi. Keď sa plazmidy experimentálne používajú na tieto účely, nazývajú sa vektory. Do plazmidového vektora možno vložiť fragmenty DNA alebo gény, čím vzniká takzvaný rekombinantný plazmid. Plazmidové vektory slúžia ako nosiče na prenos rekombinantnej DNA do hostiteľskej bunky a sú kľúčovou súčasťou molekulárneho klonovania.
„Nevírusové vektory sa intenzívne skúmajú z hľadiska ich potenciálneho využitia v génovej terapii na liečbu rôznych komplikovaných ochorení. Nevírusové vektory chránia plazmidovú DNA pred fyzikálnou, chemickou a enzymatickou degradáciou a dopravujú molekulu DNA na cieľové miesto. Napríklad katiónové lipozómy, chitozán a iné kladne nabité nanočastice vytvárajú s plazmidovou DNA komplexy prostredníctvom elektrostatických interakcií. Ľahko sa tvoriace komplexy katiónových lipozómov a plazmidovej DNA sú však relatívne veľké (t. j. 300–400 nm) a svojou povahou heterogénne, čo sťažuje ich použitie vo farmaceutických aplikáciách. Veľké a heterogénne komplexy plazmidovej DNA/lipozómov, plazmidovej DNA/aerosólov a plazmidovej DNA/peptidov možno pomocou ultrazvuku zmenšiť na menšie a homogénne častice.“ (Sarker et al., 2019)
Významným príkladom použitia plazmidových vektorov je CRISPR–Cas9. Systém CRISPR–Cas9 sa zvyčajne dopravuje do buniek vo forme jedného veľkého plazmidu alebo viacerých menších plazmidov, ktoré kódujú cieľovú sekvenciu, vodiacu RNA CRISPR a Cas9.

Ultrazvuková príprava nanočastíc PLGA s obsahom DNA pomocou nanoprecipitácie

Jo et al. (2020) použili kopolymér kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej (PLGA) na vytvorenie nanočasticového nosiča na transport modelového plazmidu CRISPR–Cas9 do primárnych makrofágov odvodených z kostnej drene. Na nanoprecipitáciu nanočastíc PLGA sa použil PLGA s dvoma rôznymi koncovými skupinami (esterovými a amínovými skupinami) s cieľom zvýšiť účinnosť enkapsulácie a stupeň naplnenia pomocou kladne nabitých koncových amínových skupín vďaka nábojovým interakciám medzi nimi a záporne nabitou kostrou DNA. V 50 mL polypropylénovej kónickej centrifugačnej skúmavke sa vírivým miešaním rozpustilo 100 mg Pluronic F127 v 20 mL autoklávovanej deionizovanej vody a následne sa roztok 30 min šetrne sonikoval v ultrazvukovom kúpeli (pozri CupHorn). Pridalo sa autoklávované magnetické miešadielko a roztok sa miešal pri 600 RPM počas 30 min, zatiaľ čo sa pripravovali ostatné roztoky. Počas celého postupu sa namiesto sklenených laboratórnych pomôcok používali plastové, aby sa minimalizovala nešpecifická adsorpcia DNA. Samostatne sa pripravili roztoky PLGA rozpusteného v DMF (44,48 mg/ ml) a TIPS pentacénu rozpusteného v THF (0,667 mg/ml). PLGA sa nechal 30 min v pokoji zmáčať v DMF a potom sa 30 min sonikoval. (úplný protokol nájdete v práci Jo et al., 2020)

Ochrana plazmidovej DNA počas sonikácie

DNA vrátane plazmidov a superšpiralizovaných plazmidov je veľmi citlivá na degradáciu. Všetky dostupné metódy fragmentácie sú známe určitými nevýhodami. Ultrazvuková fragmentácia DNA je jednou z preferovaných metód, pretože riadená sonikácia v kombinácii s ochrannými opatreniami umožňuje znížiť poškodenie reťazcov DNA spôsobené šmykom a teplom.
Okrem nastavenia nízkej amplitúdy, pulzného režimu a regulácie teploty počas ultrazvukového štiepenia DNA šmykovými silami preukázalo použitie určitých látok významný ochranný účinok proti degradácii DNA. Napríklad rôzne polyméry, peptidy a lipidy chránia plazmidovú DNA počas sonikácie.

Stabilita plazmidovej DNA a nanokomplexov plazmidovej DNA/IL voči ultrazvukovému šmykovému namáhaniu sa skúmala pomocou elektroforézy v agarózovom géli. Plazmidová DNA aj nanokomplexy plazmidovej DNA/IL sa vystavili ultrazvukovému šmykovému namáhaniu počas rôzne dlhých časových intervalov. Plazmidová DNA sa vystavila ultrazvukovému šmykovému namáhaniu počas 0, 10, 20, 30 a 40 minút. Nanokomplexy plazmidovej DNA/IL sa však vystavili ultrazvukovému šmykovému namáhaniu počas 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minút.
(štúdia a obrázok: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) preukázali, že keď sa nanoštruktúry plazmidovej DNA / iónovej kvapaliny (pDNA/IL) vystavili ultrazvukovému šmykovému namáhaniu počas 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 min a vytvorili sa ich komplexy s komerčne dostupným katiónovým činidlom na prenos génov lipofektamínom, podiel fluorescenčne pozitívnych buniek bol v uvedenom poradí 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% a 50% (pozri graf nižšie). Podiel fluorescenčne pozitívnych buniek sa zvýšil, keď sa nanoštruktúry vystavili ultrazvukovému šmykovému namáhaniu počas 10 a 20 min, a potom pomaly klesal.

Vplyv iónovej kvapaliny [Bmim][PF6] na transport plazmidovej DNA do buniek COS7. Nanokomplexy plazmidovej DNA/IL (iónovej kvapaliny) sa vystavili ultrazvukovému šmykovému namáhaniu počas až 120 minút a pred transportom do buniek COS7 sa vytvorili ich komplexy s LA. Údaje ukazujú priemerný počet (%) GFP pozitívnych buniek HeLa spočítaných v 10 rôznych mikroskopických zorných poliach a experiment sa vykonal viackrát počas troch rôznych dní. (Štúdia a graf: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvuková príprava lyzátu

Protokol ultrazvukovej lýzy buniek
Začnite obohatenou vzorkou buniek pripravenou metódou separácie buniek (napr. imunomagnetickou separáciou buniek, fluorescenčne aktivovaným triedením buniek (FACS), centrifugáciou v hustotnom gradiente, imunodenzitnou izoláciou buniek).
Vzorky buniek musia obsahovať objem lyzačného pufra primeraný cieľu experimentu a použitému sondovému ultrazvukovému prístroju.
Uprednostňujú sa hypotonické pufre, pretože podporujú ultrazvukovú lýzu buniek. Je dôležité vhodne používať prísady a zvoliť primeranú koncentráciu solí.
Vyberte si zariadenie na ultrazvukovú lýzu: Na nepriamu sonikáciu liekoviek sa odporúčajú VialTweeter alebo CupHorn. Na viacjamkové platničky je ideálnym ultrazvukovým prístrojom UIP400MTP. Na klasickú sondovú sonikáciu sú najvhodnejšie ultrazvukové homogenizátory, ako UP100H alebo UP200Ht, s mikrohrotom.
Protokol sondovej sonikácie: Ponorte sondu ultrazvukového prístroja do objemu vzorky v mikrocentrifugačnej skúmavke a sonikujte približne 10 sekúnd. V závislosti od vzorky DNA možno sonikáciu zopakovať ešte raz alebo dvakrát. Potrebný vstup ultrazvukovej energie (Ws/mL) závisí od viskozity vzorky a typu DNA. Chladenie v ľadovom kúpeli a pulzný režim ultrazvukového prístroja pomáhajú predchádzať tepelnej degradácii vzorky.
Po ultrazvukovej lýze sa vzorka centrifuguje, aby sa oddelili zvyšky vo forme pelety (obsahujúce nelyzované bunky, jadrá a nelyzované organely).
Ak sa vzorka ihneď ďalej nespracúva, možno ju skladovať pri vhodnej teplote, aby sa zachovala jej životaschopnosť.

Ultrazvukové prístroje na fragmentáciu DNA

Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne platformy na báze ultrazvuku na fragmentáciu DNA, RNA a chromatínu. Tieto platformy zahŕňajú ultrazvukové sondy (sonotródy), riešenia nepriamej sonikácie na súčasnú prípravu vzoriek vo viacerých skúmavkách alebo viacjamkových platničkách (napr. 96-jamkových platničkách, mikrotitračných platničkách), sonoreaktory a ultrazvukové pohárové sonotródy. Všetky platformy na strihové štiepenie DNA sú poháňané vysokovýkonnými ultrazvukovými procesormi s ladenou frekvenciou, ktoré možno presne ovládať a ktoré poskytujú reprodukovateľné výsledky.

Ultrazvukové procesory pre ľubovoľný počet a veľkosť vzoriek

S ultrazvukovými prístrojmi Hielscher na spracovanie viacerých vzoriek VialTweeter (až na 10 skúmaviek) a UIP400MTP (na mikroplatničky/viacjamkové platničky) možno vďaka intenzívnej a presne ovládateľnej sonikácii ľahko skrátiť čas spracovania vzoriek a zároveň dosiahnuť požadovanú distribúciu veľkostí fragmentov DNA a výťažok. Ultrazvuková fragmentácia DNA zabezpečuje efektívne, spoľahlivé a škálovateľné kroky prípravy plazmidov. Protokoly možno pri zachovaní konštantných parametrov ultrazvuku lineárne škálovať z jednej vzorky na veľký počet vzoriek.
Sondové ultrazvukové prístroje s jedným až piatimi prstami sú ideálne na prípravu menšieho počtu vzoriek. Laboratórne ultrazvukové prístroje Hielscher sú dostupné s rôznymi úrovňami výkonu, takže si môžete vybrať ideálny ultrazvukový dezintegrátor pre svoju aplikáciu súvisiacu s DNA.