Ultrazvukom je spoľahlivá technika na fragmentovanie plazmidovej DNA. Presne kontrolovateľná amplitúda, pulzačný režim a regulácia teploty sú najdôležitejšími vlastnosťami ultrazvukom pre nepoškodzujúcu fragmentáciu plazmidov. Okrem toho použitie určitých činidiel pomáha chrániť pred degradáciou plazmidov. Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne riešenia pre riadenú fragmentáciu plazmidov z jednotlivých injekčných liekoviek, súčasne sonikáciu mnohých vzoriek, ako aj dosiek s viacerými jamkami. Získajte viac informácií o úspešnej fragmentácii ultrazvukového plazmidu!

Strihanie plazmidov pomocou ultrazvukom

Keď sú vzorky DNA vystavené ultrazvukovým vlnám, ultrazvukom generované vibrácie vytvárajú akustickú kavitáciu v kvapaline, ktorá mechanickými silami strihá alebo láme molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou. Ultrazvukom je najpoužívanejšou metódou pre experimenty s hromadným strihaním DNA vrátane aplikácií, ako je chromatínová imunoprecipitácia (ChIP), pre ktoré sú veľkosti malých fragmentov absolútne rozhodujúce pre dosiahnutie vysokého rozlíšenia. (porov. Tseng a kol., 2012)
Plazmidová DNA (pDNA) je špecifická forma DNA, charakterizovaná tvarom prstenca a nachádza sa v baktériách a niektorých eukaryotoch.
Supercoiled pDNA je požadovaná forma plazmidovej DNA, pretože vykazuje najlepšie výsledky v následných procesoch, ako je automatizované sekvenovanie a transfekcia. Ultrazvukom je vhodný na fragmentovanie pDNA, vrátane supercoiled pDNA, úspešne.
Thompson et al. (2008) preukázali, že sonikácia plazmidov, o ktorej je známe, že fragmentuje supercoiled DNA, je účinným spôsobom, ako zlepšiť sekvenčné dĺžky čítania phred20 do tej miery, že sa výrazne nelíšia od riadiacej šablóny Beckmana Coultera alebo enzymaticky linearizovaných plazmidov.

Použitie plazmidových vektorov

Plazmidy sa často používajú ako nástroje na klonovanie, prenos a manipuláciu s génmi. Keď sa plazmidy používajú experimentálne na tieto účely, nazývajú sa vektory. Fragmenty alebo gény DNA môžu byť vložené do plazmidového vektora, čím sa vytvorí takzvaný rekombinantný plazmid. Plazmidové vektory sa používajú ako nosiče na vháňanie rekombinantnej DNA do hostiteľskej bunky a sú kľúčovou zložkou molekulárneho klonovania.
“Nevírusové vektory sa intenzívne skúmajú z hľadiska ich potenciálneho použitia v génovej terapii na liečbu rôznych komplikovaných ochorení. Nevírusové vektory chránia plazmidovú DNA pred fyzikálnou, chemickou a enzymatickou degradáciou a dodávajú molekulu DNA na cieľové miesto. Napríklad katiónové lipozómy, chitosan a iné pozitívne nabité nanočastice tvoria komplexy s plazmidovou DNA prostredníctvom elektrostatických interakcií. Ľahko vytvorené katiónové lipozómy/plazmidové DNA komplexy sú však relatívne veľké (t.j. 300 – 400 nm) a heterogénnej povahy, čo sťažuje ich použitie vo farmaceutických aplikáciách. Veľké a heterogénne plazmidové DNA / lipozómy, plazmidové DNA / aerosóly a plazmidové DNA / peptidové komplexy môžu byť redukované na menšie a homogénne častice pomocou ultrazvukom.” (Sarker a kol., 2019)
Prominentným príkladom použitia plazmidových vektorov je CRISPR–Cas9. Systém CRISPR-Cas9 sa zvyčajne dodáva do buniek ako jeden veľký plazmid alebo viac menších plazmidov, ktoré kódujú cieľovú sekvenciu, sprievodcu CRISPR a Cas9.

Ultrazvuková príprava DNA nabitých nanočastíc PLGA nanoprecipitáciou

Jo et al. (2020) použili kyselinu poly(mliečnu-ko-glykolovú) (PLGA) na vytvorenie nosiča nanočastíc na dodanie modelu CRISPR-Cas9 plazmidu do primárnych makrofágov odvodených z kostnej drene. Na nanoprecipitáciu nanočastíc PLGA sa použila PLGA s dvoma rôznymi koncovými skupinami (esterová a amínová skupina) s cieľom, aby kladne nabité koncové čiapky amínu zvýšili účinnosť zapuzdrenia a zaťaženie v dôsledku interakcií náboja medzi ním a záporne nabitou chrbticou DNA. V 50 ml polypropylénovej kužeľovej odstredivkovej skúmavke sa 100 mg plurónovej F127 rozpustilo v 20 ml autoklávovanej DI vody vírovým miešaním, po ktorom nasledovalo 30 minút jemnej sonikácie pomocou ultrazvukového kúpeľa (pozri CupHorn). Pridala sa autoklávovaná magnetická miešacia tyč a roztok sa miešal pri 600 otáčkach za minútu 30 minút, zatiaľ čo ostatné roztoky boli vyrobené. Namiesto skla sa používal plastový laboratórny riad, aby sa minimalizovala nešpecifická adsorpcia DNA. Roztoky PLGA rozpustené v DMF (44,48 mg/ml) a TIPS pentácénu rozpustené v THF (0,667 mg/ml) sa vyrobili samostatne. PLGA bola ponechaná pokojne mokrá v DMF po dobu 30 minút, než bola sonikovaná 30 minút (pre úplný protokol pozri Jo et al., 2020)

Ochrana plazmidovej DNA počas ultrazvukom

DNA vrátane plazmidov a supercoiled plazmidov je vysoko citlivá degradácia. Všetky dostupné metódy fragmentácie sú známe určitými nevýhodami. Ultrazvuková fragmentácia DNA je jednou z preferovaných metód, pretože riadená sonikácia v kombinácii s ochrannými opatreniami umožňuje znížiť poškodenie vlákien DNA vyvolané strihom a teplom.
Okrem nastavenia nízkej amplitúdy, pulzačného režimu a regulácie teploty počas ultrazvukového strihania DNA, použitie určitých činidiel vykazovalo významný ochranný účinok proti degradácii DNA. Napríklad rôzne polyméry, peptidy a lipidy chránia plazmidovú DNA počas ultrazvuku.

Stabilita plazmidovej DNA a nanokomplexov plazmidovej DNA/IL proti ultrazvukovému namáhaniu strihom sa skúmala pomocou testu agarózovej gélovej elektroforézy. Nanokomplexy plazmidovej DNA aj plazmidovej DNA/IL boli vystavené ultrazvukovému šmykovému namáhaniu v rôznych časových bodoch. Plazmidová DNA bola vystavená ultrazvukovému šmykovému namáhaniu po dobu 0, 10, 20, 30 a 40 minút. Nanokomplexy plazmidovej DNA /IL však boli vystavené ultrazvukovému namáhaniu strihom po dobu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minút.
(štúdia a obrázok: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) preukázali, že keď boli nanoštruktúry plazmidovej DNA / iónovej kvapaliny (pDNA / IL) vystavené ultrazvukovému šmykovému namáhaniu pre 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minút a komplexne s komerčne dostupným činidlom na dodávanie katiónových génov lipofektamínom, percento fluorescenčných pozitívnych buniek bolo 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65 %, resp. 50 % (pozri graf nižšie). Percento fluorescenčných pozitívnych buniek sa zvýšilo, keď boli nanoštruktúry vystavené ultrazvukovému namáhaniu strihom po dobu 10 a 20 minút a potom pomaly klesali.

Vplyv iónovej kvapaliny [Bmim][PF6] na dodávanie plazmidovej DNA do buniek COS7. Nanokomplexy plazmidovej DNA/IL (iónovej kvapaliny) boli vystavené ultrazvukovému šmykovému namáhaniu až 120 minút a pred dodaním do buniek COS7 sa komplexne zmiešali s LA. Údaje ukazujú priemerný počet (%) GFP pozitívnych HeLa buniek spočítaných v 10 rôznych mikroskopických poliach a experiment bol vykonaný viackrát v troch rôznych dňoch. (Štúdia a graf: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvukový prípravok lyzátu

Protokol ultrazvukovej lýzy buniek
Začnite s obohatenou vzorkou buniek, ktorá bola pripravená metódou separácie buniek (napr. separácia imunomagnetických buniek, triedenie buniek aktivované fluorescenciou (FACS), odstreďovanie s hustotným gradientom, izolácia buniek imunodenzity).
Vzorky buniek musia vykazovať objem tlmivého roztoku na rozpúšťanie, ktorý je vhodný pre experimentálny cieľ a ultrazvukový prístroj typu sondy.
Uprednostňujú sa hypotonické pufre, pretože zvyšujú lýzu ultrazvukových buniek. Je dôležité, aby sa prísady a koncentrácia soli používali vhodným spôsobom.
Vyberte si ultrazvukové zariadenie na rozpúšťanie: Na nepriamu sonikáciu injekčných liekoviek sa odporúča VialTweeter alebo CupHorn. Pre multiwell-dosky, UIP400MTP je ideálny ultrasonicator. A klasická sonikácia typu sondy, ultrazvukový homogenizátor ako UP100H alebo UP200Ht s mikro-hrotom sú najvhodnejšie.
Protokol pre sonikáciu typu sondy: Umiestnite ultrazvukovú sondu do objemu vzorky v mikrocentrifugačnej skúmavke a sonikujte približne na 10 sekúnd. V závislosti od vzorky DNA sa sonikácia môže opakovať ešte raz alebo dvakrát. Požadovaný ultrazvukový energetický vstup (Ws/ml) závisí od viskozity vzorky a typu DNA. Chladenie prostredníctvom ľadového kúpeľa a pulzačného režimu ultrazvukom pomáha zabrániť tepelnej degradácii vzorky.
Po ultrazvukovej lýze sa vzorka odstredí na oddelenie zvyškov peliet (obsahujúcich nelyzované bunky, jadrá a nelyzúvané organely)
Ak sa vzorka ďalej okamžite nespracúva, môže sa skladovať pri vhodnej teplote, aby sa zachovala jej životaschopnosť.

Ultrazvukové prístroje na fragmentáciu DNA

Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové platformy pre fragmentáciu DNA, RNA a chromatínu. Tieto rôzne platformy zahŕňajú ultrazvukové sondy (sonotródy), nepriame ultrazvukom roztoky pre simultánnu prípravu vzoriek viacerých rúr alebo multi-well dosiek (napr. 96-well dosky, mikrotiterové dosky), sonoreaktory a ultrazvukové cuphorns. Všetky platformy pre strihanie DNA sú poháňané frekvenčne vyladenými, vysokovýkonnými ultrazvukovými procesormi, ktoré sú presne ovládateľné a poskytujú reprodukovateľné výsledky.

Ultrazvukové procesory pre akékoľvek číslo vzorky a veľkosť

S Hielscherovými ultrazvukovými prístrojmi s viacerými vzorkami VialTweeter (pre až 10 skúmaviek) a UIP400MTP (pre mikroplatne / multiwell platne) je možné ľahko skrátiť čas spracovania vzorky v dôsledku intenzívnej a presne kontrolovateľnej ultrazvukom pri dosiahnutí požadovanej distribúcie a výťažnosti fragmentu DNA. Ultrazvuková fragmentácia DNA robí kroky prípravy plazmidov účinnými, spoľahlivými a škálovateľnými. Protokoly je možné lineárne škálovať od jednej po početné vzorky použitím konštantných ultrazvukových parametrov.
Ultrazvukové sondy s jedným až piatimi prstami sú ideálne na prípravu menších počtov vzoriek. Hielscherove laboratórne ultrazvukové prístroje sú k dispozícii s rôznymi úrovňami výkonu, takže si môžete vybrať ideálny ultrazvukový disruptor pre vašu aplikáciu súvisiacu s DNA.