Príprava plazmidov pomocou ultrazvuku

Ultrazvuk je spoľahlivá technika na fragmentáciu plazmidovej DNA. Presne regulovateľná amplitúda, režim pulzácie a regulácia teploty sú najdôležitejšími vlastnosťami ultrazvuku pre nepoškodenú fragmentáciu plazmidov. Okrem toho použitie určitých látok pomáha chrániť pred degradáciou plazmidov. Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne riešenia pre riadenú fragmentáciu plazmidov z jednotlivých liekoviek, súčasnú sonikáciu mnohých vzoriek, ako aj viacjamkové platničky. Zistite viac o úspešnej fragmentácii ultrazvukových plazmidov!

Strihanie plazmidov pomocou ultrazvuku

Keď sú vzorky DNA vystavené ultrazvukovým vlnám, ultrazvukom generované vibrácie vytvárajú akustickú kavitáciu v kvapaline, ktorá mechanickými silami strihá alebo rozbíja molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou. Sonikácia je najpoužívanejšou metódou pre experimenty s hromadným strihaním DNA vrátane aplikácií, ako je chromatínová imunoprecipitacia (ChIP), pre ktorú sú malé veľkosti fragmentov absolútne rozhodujúce pre získanie vysokého rozlíšenia. (porovnaj Tseng a kol., 2012)
Plazmidová DNA (pDNA) je špecifická forma DNA, ktorá sa vyznačuje kruhovým tvarom a nachádza sa v baktériách a niektorých eukaryotoch.
Supercoiled pDNA je požadovaná forma plazmidovej DNA, pretože vykazuje najlepšie výsledky v následných procesoch, ako je automatizované sekvenovanie a transfekcia. Ultrazvuk je vhodný na úspešnú fragmentáciu pDNA, vrátane superstočenej pDNA.
Thompson et al. (2008) preukázali, že sonikacia plazmidov, o ktorej je známe, že fragmentuje superstočenú DNA, je účinným spôsobom, ako zlepšiť dĺžku čítania sekvencie phred20 do tej miery, že sa významne nelíšia od kontrolnej templátu Beckmana Coultera alebo enzymaticky linearizovaných plazmidov.

Použitie plazmidových vektorov

Plazmidy sa často používajú ako nástroje na klonovanie, prenos a manipuláciu s génmi. Keď sa plazmidy experimentálne používajú na tieto účely, nazývajú sa vektory. Fragmenty DNA alebo gény môžu byť vložené do plazmidového vektora, čím sa vytvorí takzvaný rekombinantný plazmid. Plazmidové vektory sa používajú ako nosiče na pohon rekombinantnej DNA do hostiteľskej bunky a sú kľúčovou súčasťou molekulárneho klonovania.
“Nevírusové vektory sa intenzívne skúmajú pre ich potenciálne využitie v génovej terapii na liečbu rôznych komplikovaných ochorení. Nevírusové vektory chránia plazmidovú DNA pred fyzikálnou, chemickou a enzymatickou degradáciou a dodávajú molekulu DNA na cieľové miesto. Napríklad katiónové lipozómy, chitozán a iné kladne nabité nanočastice tvoria komplexy s plazmidovou DNA prostredníctvom elektrostatických interakcií. Ľahko vytvorené komplexy katiónových lipozómov/plazmidovej DNA sú však relatívne veľké (t.j. 300–400 nm) a heterogénnej povahy, čo sťažuje ich použitie vo farmaceutických aplikáciách. Veľké a heterogénne plazmidové DNA/lipozómy, plazmidové DNA/aerosóly a plazmidové komplexy DNA/peptidy môžu byť redukované na menšie a homogénne častice pomocou ultrazvuku.” (Sarker a kol., 2019)
Významným príkladom použitia plazmidových vektorov je CRISPR–Cas9. Systém CRISPR-Cas9 sa zvyčajne dodáva do buniek ako jeden veľký plazmid alebo viacero menších plazmidov, ktoré kódujú cieľovú sekvenciu, sprievodcu CRISPR a Cas9.

Ultrazvuková príprava nanočastíc PLGA zaťažených DNA nanozrážaním

Jo et al. (2020) použili poly(kyselinu mliečnu-koglykolovú) (PLGA) na vytvorenie nosiča nanočastíc na dodanie modelového plazmidu CRISPR–Cas9 do makrofágov odvodených z primárnej kostnej drene. Na nanoprecipitáciu nanočastíc PLGA boli použité PLGA s dvoma rôznymi koncovými skupinami (esterové a amínové skupiny) s cieľom, aby kladne nabité amínové koncové kryty zvýšili účinnosť zapuzdrenia a zaťaženie v dôsledku nábojových interakcií medzi nimi a záporne nabitou chrbticou DNA. V 50 ml polypropylénovej kužeľovej odstredivkovej skúmavke sa 100 mg Pluronic F127 rozpustilo v 20 ml autoklávovanej DI vody vírivým zmiešaním, po ktorom nasledovalo 30 minút jemnej sonikácie pomocou ultrazvukového kúpeľa (pozri CupHorn). Pridala sa autoklávovaná magnetická miešacia tyč a roztok sa miešal pri 600 ot./min počas 30 minút, zatiaľ čo sa vyrábali ostatné roztoky. Namiesto skleneného riadu sa použil plastový laboratórny riad, aby sa minimalizovala nešpecifická adsorpcia DNA. Roztoky PLGA rozpustené v DMF (44,48 mg/ml) a TIPS pentacín rozpustený v THF (0,667 mg/ml) boli vyrobené samostatne. PLGA bola ponechaná v pokoji mokrá v DMF po dobu 30 minút a potom bola sonikovaná 30 minút. (úplný protokol pozri Jo et al., 2020)

Ochrana plazmidovej DNA počas sonikácie

DNA vrátane plazmidov a superstočených plazmidov je vysoko citlivá degradácia. Všetky dostupné metódy fragmentácie sú známe pre určité nevýhody. Ultrazvuková fragmentácia DNA je jednou z preferovaných metód, pretože riadená sonikácia v kombinácii s ochrannými opatreniami umožňuje znížiť šmykové a tepelné poškodenie vlákien DNA.
Okrem nastavenia nízkej amplitúdy, režimu pulzácie a regulácie teploty počas ultrazvukového strihania DNA preukázalo použitie určitých látok významný ochranný účinok proti degradácii DNA. Napríklad rôzne polyméry, peptidy a lipidy chránia plazmidovú DNA počas ultrazvuku.

Stabilita plazmidovej DNA a nanokomplexov plazmidovej DNA/IL proti ultrazvukovému šmykovému namáhaniu sa skúmala pomocou elektroforézového testu agarózového gélu. Nanokomplexy plazmidovej DNA aj plazmidovej DNA/IL boli vystavené ultrazvukovému šmykovému namáhaniu v rôznych časových bodoch. Plazmidová DNA bola vystavená ultrazvukovému šmykovému namáhaniu po dobu 0, 10, 20, 30 a 40 minút. Nanokomplexy plazmidovej DNA/IL však boli vystavené ultrazvukovému šmykovému namáhaniu po dobu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minút.
(štúdia a obrázok: ©Sarker a kol., 2019)

(2019) preukázali, že keď boli nanoštruktúry plazmidovej DNA / iónovej kvapaliny (pDNA / IL) vystavené ultrazvukovému šmykovému namáhaniu po dobu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minút a v komplexe s komerčne dostupným činidlom dodávajúcim katiónový gén lipofektamín, percento fluorescenčných pozitívnych buniek bolo 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65 % a 50 % (pozri tabuľku nižšie). Percento fluorescenčných pozitívnych buniek sa zvýšilo, keď boli nanoštruktúry vystavené ultrazvukovému šmykovému namáhaniu po dobu 10 a 20 minút, a potom sa pomaly znižovalo.

Vplyv iónovej kvapaliny [Bmim][PF6] na dodávanie plazmidovej DNA do buniek COS7. Nanokomplexy plazmidovej DNA/IL (iónová kvapalina) boli vystavené ultrazvukovému šmykovému namáhaniu až 120 minút a pred dodaním do buniek COS7 sa komplexovali s LA. Údaje ukazujú priemerný počet (%) GFP pozitívnych HeLa buniek spočítaných v 10 rôznych mikroskopických poliach a experiment bol vykonaný viackrát v troch rôznych dňoch. (Štúdia a graf: ©Sarker et al., 2019)

Príprava ultrazvukového lyzátu

Protokol ultrazvukovej lýzy buniek
Začnite s obohatenou vzorkou buniek, ktorá bola pripravená metódou separácie buniek (napr. imunomagnetická separácia buniek, fluorescenčne aktivované triedenie buniek (FACS), centrifugácia s gradientom hustoty, izolácia buniek imunodensity
Vzorky buniek musia vykazovať objem lyzačného pufra, ktorý je vhodný pre experimentálny cieľ a ultrazvukový prístroj typu sondy.
Uprednostňujú sa hypotonické pufre, pretože zlepšujú ultrazvukovú lýzu buniek. Je dôležité, aby sa prísady a koncentrácia soli používali vhodným spôsobom.
Vyberte si ultrazvukové lýzne zariadenie: Na nepriamu sonikáciu injekčných liekoviek sa odporúča VialTweeter alebo CupHorn. Pre viacjamkové platne je UIP400MTP ideálnym ultrazvukom. A najvhodnejšia je klasická sonikácia typu sondy, ultrazvukový homogenizátor ako UP100H alebo UP200Ht s mikrohrotom.
Protokol pre sonikáciu typu sondy: Umiestnite ultrazvukovú sondu do objemu vzorky v skúmavke s mikroodstredivkou a sonikujte cca. 10 sekúnd. V závislosti od vzorky DNA sa sonikácia môže opakovať ešte raz alebo dvakrát. Požadovaný ultrazvukový energetický vstup (Ws/ml) závisí od viskozity vzorky a typu DNA. Chladenie pomocou ľadového kúpeľa a pulzačného režimu ultrazvuku pomáha predchádzať tepelnej degradácii vzorky.
Po ultrazvukovej lýze sa vzorka odstredí, aby sa oddelili zvyšky peliet (obsahujúce nelyzované bunky, jadrá a nelyzované organely)
Ak sa vzorka okamžite ďalej nespracuje, môže sa skladovať pri vhodnej teplote, aby sa zachovala jej životaschopnosť.

Ultrazvukové prístroje na fragmentáciu DNA

Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne platformy založené na ultrazvuku pre fragmentáciu DNA, RNA a chromatínu. Tieto rôzne platformy zahŕňajú ultrazvukové sondy (sonotrody), nepriame sonikačné roztoky na súčasnú prípravu vzoriek z viacerých skúmaviek alebo viacjamkových platní (napr. 96-jamkové platne, mikrotitračné platne), sonoreaktory a ultrazvukové cuphorny. Všetky platformy na strihanie DNA sú poháňané frekvenčne vyladenými, vysoko výkonnými ultrazvukovými procesormi, ktoré sú presne ovládateľné a poskytujú reprodukovateľné výsledky.

Ultrazvukové procesory pre akýkoľvek počet a veľkosť vzorky

S viacvzorkovými ultrazvukovými prístrojmi Hielscher VialTweeter (až pre 10 skúmaviek) a UIP400MTP (pre mikroplatničky/viacjamkové platničky) je možné ľahko skrátiť čas spracovania vzorky vďaka intenzívnej a presne kontrolovateľnej ultrazvukovej signalizácii a zároveň získať požadovanú distribúciu veľkosti fragmentov DNA a výťažnosť. Vďaka ultrazvukovej fragmentácii DNA sú kroky prípravy plazmidov efektívne, spoľahlivé a škálovateľné. Protokoly je možné lineárne škálovať od jednej po množstvo vzoriek použitím konštantných ultrazvukových parametrov.
Ultrazvukové sondy s jedným až piatimi prstami sú ideálne na prípravu menších počtov vzoriek. Laboratórne ultrazvukové prístroje Hielscher sú k dispozícii s rôznymi úrovňami výkonu, takže si môžete vybrať ideálny ultrazvukový disruptor pre vašu aplikáciu súvisiacu s DNA.