Protokol na inaktiváciu koronavírusu SARS-CoV-2 pomocou sonikácie

Hielscher VialTweeter je jedinečná ultrazvuková prípravná jednotka na viac vzoriek, ktorá sa používa na inaktiváciu koronavírusu SARS-CoV-2. VialTweeter umožňuje pripraviť až 10 skúmaviek so vzorkami súčasne, a je preto ideálnou jednotkou na hromadné spracovanie vzoriek.

Inaktivácia koronavírusu SARS-CoV-2 pomocou VialTweeter

Po odstránení fixačného činidla boli monovrstvy trikrát premyté fosfátovo-pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS) pred tým, než sa bunky zoškrabali do 1mL MEM/5% FBS a sonikovali (3 × 10 sekúnd zapnuté, 10 sekúnd vypnuté pri 100% výkone a amplitúde) pomocou ultrazvukového procesora Hielscher UP200St s nástavcom VialTweeter príslušenstvo. Supernatanty sa vyčírili centrifugovaním pri 3000 × g po dobu 10 minút. Úplný protokol na inaktiváciu koronavírusu SARS-CoV-2 od Welch et al. (2020) nájdete nižšie:

Bunky a vírus

Bunky Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) sa kultivovali v modifikovanom Eagleovom minimálnom esenciálnom médiu (MEM) doplnenom o 10% (v/v) plodovú kravskú sérovú zmes (FCS). Použitý vírus bol kmeň SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, izolovaný agentúrou PHE z prvej pacientovej skupiny v Spojenom kráľovstve dňa 29/01/2020. Tento vírus bol získaný pri pasáži 1 a použitý pri štúdiách inaktivácie pri pasáži 2 alebo 3.
Reagencie a chemikálie použité na inaktiváciu SARS-CoV-2, ako aj na odstránenie cytotoxicity reagencií, nájdete v vedeckej správe od Welch et al. (2020).

Inaktivácia vírusu detergentmi – Protokol na inaktiváciu koronavírusu SARS-CoV-2 od Welch et al. 2020

Inaktivácia SARS-CoV-2


Pri komerčných produktoch boli vírusové prípravky (tekutina z bunkovej kultúry, titry v rozmedzí od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) ošetrené v trojitom opakovaní reagenciami v koncentráciách a po dobu kontaktov odporúčaných v pokynoch výrobcu na použitie, ak boli k dispozícii, alebo v koncentráciách a časoch špecificky požadovaných testovacími laboratóriami. Ak výrobca uviedol rozsah koncentrácií, testoval sa najnižší pomer produktu k vzorke (t. j. najnižšia odporúčaná koncentrácia testovaného produktu). Reagencie na transportné skúmavky so vzorkami sa testovali s pomerom jedného objemu tekutiny z bunkovej kultúry k desiatim objemom reagencie, pokiaľ výrobca nešpecifikoval objemový pomer tekutiny vzorky k reagencii. Detergenty, fixačné činidlá a rozpúšťadlá sa testovali pri uvedených koncentráciách na uvedené časy. Všetky kroky inaktivácie sa vykonávali pri izbovej teplote (18 – 25°C). Pri testovaní alternatívnych typov vzoriek sa vírus pridal do uvedenej matrice vzorky v pomere 1:9 a následne sa ošetril testovacími reagenciami ako vyššie. Všetky experimenty zahŕňali kontrolné vzorky ošetrené falošným činidlom v trojitom opakovaní s ekvivalentným objemom PBS namiesto testovacej reagencie. Bezprostredne po požadovanej dobe kontaktu sa 1mL ošetrenej vzorky spracoval pomocou vhodne vybranej filtračnej matrice. Odstránenie reagencie na testovanie inaktivácie sa vykonalo vo väčšom formáte spinových kolón pomocou Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), alebo naplnením prázdnych centrifugových kolón Pierce s kapacitou 10mL (Thermo Fisher) SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR alebo Sephadex LH-20 na získanie 4mL balených guľôčok/živice. Pri purifikácii pomocou filtrov Amicon sa 2 × 500μl vzoriek purifikovali pomocou dvoch centrifugálnych filtrov podľa predtým opísanej metódy a potom sa spojili spolu. Pri odstraňovaní formaldehydu a formaldehydu s glutaraldehydom sa použil jeden filter s objemom vzorky 1× 500μl, po spracovaní sa resuspendoval v 500μl PBS a pridal sa do 400ul MEM/5% FBS. Pri inaktivácii infikovaných monovrstiev, 12,5 cm² fliaš s bunkami Vero E6 (2,5 × 10⁶ buniek/fliašu v 2,5mL MEM/5% FBS) sa infikovali pri MOI 0,001 a inkubovali pri 37°C/5% CO₂ po dobu 24 hodín. Supernatant sa odstránil a bunky sa fixovali pomocou 5mL formaldehydu, alebo formaldehydu a glutaraldehydu pri izbovej teplote po dobu 15 alebo 60 minút. Fixačné činidlo sa odstránilo a monovrstvy sa trikrát premývali PBS pred tým, než sa bunky zoškrabali do 1mL MEM/5% FBS a sonikovali (3 × 10 sekúnd zapnuté, 10 sekúnd vypnuté pri 100% výkone a amplitúde) pomocou UP200St s nástavcom VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanty sa vyčírili centrifugovaním pri 3000 × g po dobu 10 minút.


Podrobnosti o reagencii použitej na inaktiváciu koronavírusu SARS-CoV-2 pomocou ultrazvukového VialTweeter podľa protokolu od Welch et al. 2020

Úplný protokol vrátane použitia Hielscher VialTweeter nájdete tu:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Pokročilé ultrazvukové dismembrátory a narušovače buniek

Viacvzorkový ultrazvukový sonikátor VialTweeter je len jedným z mnohých ultrazvukových riešení na prípravu vzoriek v biologických, biochemických a klinických laboratóriách. Hielscher Ultrasonics ponúka ideálny ultrazvukový dismembrátor pre vašu aplikáciu, napr. lýzu buniek, extrakciu buniek, homogenizáciu tkanív, solubilizáciu lyzátu, rozpúšťanie, odplynenie vzoriek atď.
Dajte nám vedieť, koľko vzoriek musíte spracovať za hodinu a deň, či preferujete priamu alebo nepriamu sonikáciu a aký je cieľ ultrazvukovej úpravy vzoriek. Odporučíme vám najvhodnejšiu ultrazvukovú jednotku pre vašu každodennú pracovnú rutinu!
Digitálne ultrazvukové procesory Hielscher Ultrasonics sú vybavené inteligentným softvérom, automatickým zaznamenávaním údajov, jednoduchými možnosťami prednastavenia na kontrolu teploty, dĺžku sonikácie, cyklický/pulzný režim, ako aj osvetlenie vzorky a diaľkové ovládanie cez prehliadač. Snažíme sa, aby boli naše ultrazvukové zariadenia čo najinteligentnejšie, aby sa váš výskum a pracovná rutina stali čo najpohodlnejšími a najúspešnejšími.
Kliknite sem, ak chcete nájsť ďalšie aplikácie vrátane protokolov ultrazvukovej prípravy vzoriek pomocou VialTweeter!