Protokol o inaktivácii koronavírusu SARS-CoV-2 so Sonication

Hielscher VialTweeter je unikátna ultrazvuková jednotka na prípravu viacerých vzoriek, ktorá sa používa na inaktiváciu koronavírusu SARS-COV-2. VialTweeter umožňuje pripraviť súčasne až 10 injekčných liekoviek so vzorkou, a preto je ideálnou jednotkou na spracovanie hmotnostnej vzorky.

Inaktivácia koronavírusu SARS-CoV-2 koronavírusom VialTweeter

Po odstránení fixačné, monolayers boli umyté trikrát fosfát-pufrovaný slaný roztok (PBS) pred škrabanie buniek do 1mL MEM/5% FBS a sonikované (3 × 10 sekúnd na, 10 sekúnd off na 100% výkonu a amplitúdy) pomocou ultrazvukový procesor Hielscher UP200St s VialTweeter Prílohu. Supernatanty boli vyčísľované odstreďovačom pri 3000 × g počas 10 minút. 

Prečítajte si celý protokol o inaktivácii koronavírusu SARS-CoV-2 od welch et al. (2020) nižšie:

Bunky a vírus

Vero E6 bunky (Vero C1008; ATCC CRL-1586) boli kultivované v modifikovanom eagle minimálne základné médium (MEM) doplnené 10% (v / v) plodu teľa sérum (FCS). Vírusom bol kmeň SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, izolovaný PHE z prvého zoskupenia pacientov vo Veľkej Británii 29.1.2020. Tento vírus sa získal v prechode 1 a používal sa na štúdie inaktivácie v časti 2 alebo 3.
V prípade činidiel a chemikálií používaných na inaktiváciu SARS-CoV-2, ako aj odstránenie cytotoxicity činidla nájdete vo vedeckej správe welch et al. (2020).

Inaktivácia vírusu detergentmi – Koronavírus SARS-CoV-2: Protokol o inaktivácii koronavírusu welch et al. 2020

Inaktivácia SARS-CoV-2

V prípade komerčných produktov sa vírusové prípravky (tekutina tkanivovej kultúry, titery od 1 × 10⁶ na 1 × 10⁸ PFU/ml) boli ošetrené v troch vyhotoveniach činidlami v koncentráciách a v kontaktných časoch odporúčaných v návode výrobcu na použitie, ak sú k dispozícii, alebo na koncentrácie a časy osobitne požadované skúšobnými laboratóriami. Ak výrobca udá rozsah koncentrácií, testoval sa najnižší pomer výrobku k vzorke (t. j. najnižšia odporúčaná koncentrácia testovaného výrobku). Reagencie transportnej trubice vzorky boli testované s použitím pomeru jedného objemu tekutiny tkanivovej kultúry k desiatim objemom činidla, pokiaľ výrobca nešpecifikoval objemový pomer vzorky tekutiny k činidlu. Detergenty, fixačné prostriedky a rozpúšťadlá boli testované v indikovaných koncentráciách v indikovaných časoch. Všetky kroky inaktivácie boli vykonané pri izbovej teplote okolia (18 – 25°C). Na testovanie alternatívnych typov vzoriek bol vírus obohatený do indikovanej matrice vzorky v pomere 1:9, potom ošetrený testovanými činidlami, ako je uvedené vyššie. Všetky pokusy zahŕňali vzorky ošetrené troch kontrolnými vzorkami ošetrenými podľa makety s ekvivalentným objemom PBS namiesto testovacieho činidla. Bezprostredne po požadovanom čase kontaktu sa 1 ml ošetrenej vzorky spracovalo pomocou vhodne zvolenej filtračnej matrice. Odstránenie činidla na testovanie inaktivácie sa vykonalo vo väčšom formáte odstreďovacích kolón pomocou spinových kolón Pierce 4mL detergentov (Thermo Fisher) alebo vyplnením prázdnych odstrediviek s kapacitou Pierce 10mL (Thermo Fisher) s SM2 Bio-korálkami, Sephacryl S-400HR alebo Sephadex LH-20, aby sa 4 ml balené korálky/resin. Na čistenie pomocou Amiconových filtrov sa 2 × 500 μl vzoriek purifikovali pomocou dvoch odstredivých filtrov metódou, ktorá bola predtým opísaná a potom sa spojili. Na formaldehyd a formaldehyd s odstránením glutaraldehydu sa použil jeden filter s objemom vzorky 1× 500 μl, resuspendovaný po spracovaní v 500μl PBS a pridal sa k 400ul MEM/5% FBS. Pre inaktiváciu infikovaných jednovrstvové, 12,5 cm² banky kysín Vero E6 (2,5 × 10⁶ buniek/banky v 2,5 ml MEM/5% FBS) boli infikované moi 0,001 a inkubované pri teplote 37 °C/5 % CO₂ 24 hodín. Supernatant bol odstránený a bunky fixované pomocou 5 ml formaldehydu alebo formaldehydu a glutaraldehydu pri izbovej teplote 15 alebo 60 minút. Fixačný bol odstránený, a monolayers umyť trikrát s PBS pred škrabanie buniek do 1mL MEM/5% FBS a sonikované (3 × 10 sekúnd na, 10 sekúnd off na 100% výkon a amplitúda) pomocou UP200St s VialTweeter prílohu (Hielscher Ultrazvuková technológia). Supernatanty boli vyčísľované odstreďovačom pri 3000 × g počas 10 minút.

Podrobnosti o činidle používanej na inaktiváciu koronavírusu SARS-CoV-2 ultrazvukom VialTweeter podľa protokolu Welch et al. 2020

Úplný protokol, vrátane použitia Hielscher VialTweeter možno nájsť tu:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofistikované ultrazvukové dismembrators a bunkové disruptory

Multi-vzorka ultrasonicator VialTweeter je len jedným z mnohých ultrazvukových roztokov pre prípravu vzoriek v biologických, biochemických a klinických laboratóriách. Hielscher Ultrazvukom ponúka ideálny ultrazvukový dismembrátor pre vašu aplikáciu, napr.
Dajte nám vedieť, koľko vzoriek musíte spracovať za hodinu a deň, ak dávate prednosť priamej alebo nepriamej ultrazvukom a aký je cieľ ultrazvukovej liečby vzoriek. Odporúčame vám najvhodnejšiu ultrazvukovú jednotku pre vašu každodennú pracovnú rutinu!
Digitálne ultrazvukové procesory Hielscher Ultrasonics sú vybavené inteligentným softvérom, automatickým záznamom dát, jednoduchými možnosťami prednastavenia pre reguláciu teploty, dĺžkou ultrazvukom, režimom cyklu/impulzu, ako aj ilustráciou vzoriek a diaľkovým ovládaním prehliadača. Snažíme sa, aby naše ultrazvukové zariadenia boli čo najaustrejšie, aby sa váš výskum a pracovná rutina stala čo naju pohodlnejšou a úspešnejšou.
Kliknite tu, nájsť viac aplikácií, vrátane protokolov ultrazvukové prípravy vzoriek s VialTweeter!