Protokol pre inaktiváciu koronavírusu SARS-CoV-2 sonikáciou

Hielscher VialTweeter je jedinečná ultrazvuková jednotka na prípravu viacerých vzoriek, ktorá sa používa na inaktiváciu koronavírusu SARS-COV-2. VialTweeter umožňuje pripraviť až 10 injekčných liekoviek so vzorkami súčasne a je tak ideálnou jednotkou na hromadné spracovanie vzoriek.

Inaktivácia koronavírusu SARS-CoV-2 pomocou VialTweeter

Po odstránení fixačného prostriedku sa monovrstvy trikrát premyli fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS) pred zoškrabaním článkov na 1 ml MEM/5% FBS a sonikovali (3 × 10 sekúnd zapnuté, 10 sekúnd vypnuté pri 100% výkone a amplitúde) pomocou ultrazvukového procesora Hielscher UP200St s VialTweeter príslušenstvo. Supernatanty sa čírili odstreďovaním pri 3000 × g počas 10 minút. 

Prečítajte si celý protokol o inaktivácii koronavírusu SARS-CoV-2 od Welcha a kol. (2020) nižšie:

Bunky a vírusy

Bunky Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) boli kultivované v modifikovanom Eagleovom minimálnom esenciálnom médiu (MEM) doplnenom o 10% (v/v) fetálneho teľacieho séra (FCS). Použitým vírusom bol kmeň SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, izolovaný PHE z prvého zhluku pacientov v Spojenom kráľovstve dňa 29. 1. 2020. Tento vírus bol získaný pri pasáži 1 a použitý na inaktivačné štúdie pri prechode 2 alebo 3.
Informácie o činidlách a chemikáliách používaných na inaktiváciu SARS-CoV-2, ako aj na odstránenie cytotoxicity činidiel nájdete vo vedeckej správe Welch et al. (2020).

Inaktivácia vírusu čistiacimi prostriedkami – Protokol inaktivácie koronavírusu SARS-CoV-2 od Welcha a kol. 2020

Inaktivácia SARS-CoV-2

V prípade komerčných výrobkov, vírusových prípravkov (tekutina z tkanivových kultúr, titre v rozmedzí od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) boli ošetrené v troch vyhotoveniach činidlami v koncentráciách a na kontaktné časy odporúčané v návode výrobcu na použitie, ak sú k dispozícii, alebo pre koncentrácie a časy osobitne požadované skúšobnými laboratóriami. Ak výrobca uviedol rozsah koncentrácií, testoval sa najnižší pomer produktu k vzorke (t. j. najnižšia odporúčaná koncentrácia testovaného produktu). Činidlá pre transportné skúmavky na vzorky boli testované s použitím pomeru jeden objem tekutiny z tkanivovej kultúry k desiatim objemom činidla, pokiaľ výrobca nešpecifikoval objemový pomer tekutiny vzorky k činidlu. Čistiace prostriedky, fixačné prostriedky a rozpúšťadlá boli testované v uvedených koncentráciách na uvedené časy. Všetky kroky inaktivácie boli vykonané pri izbovej teplote okolia (18 – 25 °C). Na testovanie alternatívnych typov vzoriek bol vírus nabodnutý do uvedenej matrice vzorky v pomere 1:9 a potom ošetrený testovacími činidlami, ako je uvedené vyššie. Všetky experimenty zahŕňali trojnásobné kontrolné simulované vzorky s ekvivalentným objemom PBS namiesto testovacieho činidla. Ihneď po požadovanom čase kontaktu bol spracovaný 1 ml ošetrenej vzorky pomocou vhodne zvolenej filtračnej matrice. Odstránenie činidiel na inaktivačné testovanie sa uskutočnilo vo väčšom formáte odstreďovacej kolóny pomocou odstreďovacích kolónok Pierce 4 ml na odstraňovanie čistiaceho prostriedku (Thermo Fisher) alebo naplnením prázdnych odstredivkových kolón Pierce s kapacitou 10 ml (Thermo Fisher) pomocou SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR alebo Sephadex LH-20, aby sa získali 4 ml balené guľôčky/živica. Na čistenie pomocou filtrov Amicon sa 2 vzorky × 500 μl vyčistili pomocou dvoch odstredivých filtrov vyššie opísanou metódou a potom sa spojili. Pre formaldehyd a formaldehyd s odstránením glutaraldehydu sa použil jeden filter s objemom vzorky 1× 500 μl, resuspendovaný po spracovaní v 500 μl PBS a pridaný do 400 ul MEM/5 % FBS. Na inaktiváciu infikovaných jednovrstvové, 12,5 cm² banky s bunkami Vero E6 (2,5 × 10⁶ bunky/banka v 2,5 ml MEM/5 % FBS) boli infikované pri MOI 0,001 a inkubované pri 37 °C/5 % CO₂ po dobu 24 hodín. Supernatant bol odstránený a bunky fixované pomocou 5 ml formaldehydu alebo formaldehydu a glutaraldehydu pri izbovej teplote počas 15 alebo 60 minút. Fixačný prostriedok bol odstránený a monovrstvy sa trikrát premyli PBS pred zoškrabaním buniek na 1 ml MEM/5% FBS a sonikovali (3 × 10 sekúnd zapnuté, 10 sekúnd vypnuté pri 100% výkone a amplitúde) pomocou UP200St s nástavcom VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanty sa čírili odstreďovaním pri 3000 × g počas 10 minút.

Podrobnosti o činidle použitom na inaktiváciu koronavírusu SARS-CoV-2 ultrazvukovým VialTweeterom podľa protokolu Welch et al. 2020

Celý protokol vrátane použitia Hielscher VialTweeter nájdete tu:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofistikované ultrazvukové dismembrátory a bunkové disruptory

Viacvzorkový ultrazvuk VialTweeter je len jedným z mnohých ultrazvukových roztokov na prípravu vzoriek v biologických, biochemických a klinických laboratóriách. Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka ideálny ultrazvukový disembrator pre vašu aplikáciu, napr. lýza buniek, extrakcia buniek, homogenizácia tkanív, rozpustenie lyzátu, rozpúšťanie, odplyňovanie vzoriek atď.
Dajte nám vedieť, koľko vzoriek musíte spracovať za hodinu a deň, či uprednostňujete priamu alebo nepriamu sonikaciu a aký je cieľ ošetrenia ultrazvukovou vzorkou. Odporučíme vám najvhodnejšiu ultrazvukovú jednotku pre vašu každodennú pracovnú rutinu!
Digitálne ultrazvukové procesory Hielscher Ultrasonics sú vybavené inteligentným softvérom, automatickým zaznamenávaním údajov, jednoduchými možnosťami prednastavenia pre reguláciu teploty, trvaním sonikácie, režimom cyklu/pulzu, ako aj osvetlením vzorky a diaľkovým ovládaním prehliadača. Snažíme sa, aby naše ultrazvukové zariadenia boli čo najinteligentnejšie, aby bol váš výskum a pracovná rutina čo najpohodlnejšia a najúspešnejšia.
Kliknite sem a nájdite ďalšie aplikácie vrátane protokolov o ultrazvukovej príprave vzoriek pomocou VialTweeter!