Ultrazvuková lýza vzoriek Drosophila Melanogaster
Drosophila melanogaster je široko používaná v laboratóriách ako modelový organizmus. Preto sa musia často vykonávať kroky predanalytickej prípravy, ako je lýza, narušenie buniek, extrakcia proteínov a strihanie DNA vzoriek Drosophila melanogaster. Ultrazvukové dismembrátory sú spoľahlivé a efektívne a môžu sa používať na jednoduché vykonávanie rôznych úloh, ako je lýza, extrakcia proteínov alebo fragmentácia DNA, iba úpravou parametrov ultrazvukového procesu. Ultrazvukové homogenizátory sú preto flexibilné nástroje so širokou škálou aplikácií.
Ultrazvuková lýza a extrakcia bielkovín
Lýza, solubilizácia buniek, homogenizácia tkanív a extrakcia proteínov sú typické úlohy pre ultrazvukové dismembátory v biologických laboratóriách. Ultrazvukové dismembátory a bunkové disruptory sú vhodné na homogenizáciu živočíšnych tkanív, hmyzu (napr. Drosophila melanogaster, C. elegans) alebo rastlinných vzoriek. Následnými aplikáciami ultrazvuku sú lýza bunkových suspenzií a peliet, ako aj extrakcia intracelulárnych proteínov.
Ultrazvuková lýza a extrakcia proteínov sú vysoko spoľahlivé a reprodukovateľné procesy, ktoré je možné vykonávať na základe zavedených protokolov. Keďže intenzitu ultrazvukového procesu je možné presne nastaviť pomocou parametrov sonikácie, ako je amplitúda, režim cyklu / pulzu, teplota a objem vzorky, po overení protokolov sa môžu opakovať s rovnakým výsledkom znova a znova.
- Vysoko efektívny
- Nastaviteľné na konkrétny materiál vzorky
- Vhodné pre akýkoľvek objem
- netepelné spracovanie
- reprodukovateľné výsledky
- Jednoduché a bezpečné
Ultrazvuková fragmentácia DNA a RNA
Po lýze buniek a extrakcii proteínov je bežným požadovaným krokom pri príprave vzorky strihanie a fragmentácia DNA, RNA a chromatínu, napr. pred imunoprecipitáciou chromatínu (ChIP). Fragmentáciu DNA a RNA možno spoľahlivo dosiahnuť rozbitím kovalentných väzieb, ktoré držia DNA pohromade fyzickými silami. Pomocou fyzického strihania, ako je sonikacia, sa najprv rozbijú vlákna DNA, potom sa DNA rozpadne na menšie kúsky.
Ultrazvuková fragmentácia DNA je spoľahlivá a účinná pri strihaní DNA na cieľovú dĺžku, napr. 500 bp (páry báz). Medzi hlavné výhody ultrazvukovej fragmentácie DNA patrí presná kontrola parametrov a intenzity ultrazvukového procesu. Parametre ultrazvukového procesu je možné upraviť presným vyladením intenzity sonikácie, cyklov a času. To umožňuje vytvoriť požadované veľkosti DNA a cieľovú dĺžku DNA je možné spoľahlivo vyrobiť aj reprodukovať. Ultrazvukové strihanie DNA je tiež ideálne na vytváranie fragmentov DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou.
Protokoly pre ultrazvukovú lýzu Drosophila melanogaster
Nižšie nájdete rôzne protokoly pre ultrazvukom asistovanú lýzu, extrakciu proteínov a fragmentáciu DNA alebo chromatínu vzoriek Drosophila.
Ultrazvuková lýza pre test zosieťovacej imunoprecipitácie (CLIP)
Test CLIP bol vykonaný tak, ako bolo predtým oznámené, s niekoľkými úpravami. Približne 20 mg vaječníkov z 0- až 1-dňových samíc divokého typu bolo zosieťovaných UV žiarením (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizovaných na ľade v 1 ml tlmivého roztoku RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 % Triton X-100, 250 mM sacharózy, 1 mM DTT, 1× inhibítorov kompletnej proteázy bez EDTA, 1 mM PMSF) doplnených 300 U RNAseOUT a umiestnených na ľade na 30 minút. Homogenát bol sonikovaný na ľade pri 80% výkone päťkrát za 20 s dávky s 60 s odpočinkom medzi nimi pomocou Hielscherovho ultrazvukového procesora UP100H (100 W, 30 kHz) a odstredené (16000 × g počas 5 minút pri 4 °C). Rozpustný extrakt bol predčistený 20 μl Protein-G dynabeads počas 20 minút pri 4 °C. Po odobratí vzoriek na imunoblotáciu a kvantifikácii vstupu RNA (1 %) bol HP1 imunoprecipitovaný protilátkou anti-HP1 9A9 zo 450 μl predclearovaného extraktu inkubáciou počas 4 hodín s 50 μl Protein-G dynabeads. Imunoprecipitáty sa 4-krát premyli RCB. Na eluovanie imunoprecipitovaných RNA sa granulované guľôčky varili v 100 μl vody upravenej UltraPure DEPC po dobu 5 minút. Do supernatantu získaného na prípravu RNA sa pridalo 900 μl činidla Qiazol. Purifikovaná RNA bola použitá ako templát na syntézu cDNA pomocou oligo dT, náhodných hexamerov a reverznej transkriptázy SuperScript III podľa protokolu výrobcu.
(Cassale a kol. 2019)
Ultrazvuková lýza pre test imunoprecipitácie chromatínu
Imunoprecipitácia chromatínu bola vykonaná podľa metódy opísanej Menetom s malými úpravami. Približne 20 mg vaječníkov od 0- až 1-dňových samíc divokého typu bolo homogenizovaných v 1 ml pufra NEB (10 mM HEPES-Na pri pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pri pH 8, 0,5 mM EDTA-Na pri pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidínu, 0,15 mM spermínu, 1× inhibítorov kompletnej proteázy bez EDTA) s homogenizátorom / ponorným dispergátorom 1 min (pri 3000 ot./min). Homogenát sa preniesol do predchladeného skleneného pohára a 15 plných ťahov sa aplikovalo pevným tĺčikom. Voľné jadrá sa potom odstredili pri 6000xg počas 10 minút pri 4 °C. Pelety obsahujúce jadrá boli resuspendované v 1 ml NEB a odstredené pri 20000 × g počas 20 minút na gradiente sacharózy (0,65 ml z 1,6 M sacharózy v NEB, 0,35 ml z 0,8 M sacharózy v NEB). Peleta bola resuspendovaná v 1 ml NEB a formaldehydu na konečnú koncentráciu 1 %. Jadrá boli zosieťované 10 minút pri izbovej teplote a uhasené pridaním 1/10 obj. 1,375 M glycínu. Jadrá sa zbierali centrifugáciou pri 6000 × g počas 5 minút. Jadrá boli dvakrát premyté v 1 ml NEB a resuspendované v 1 ml lýzneho pufra (15 mM HEPES-Na pri pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pri pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na deoxycholát, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarkozín a 1× inhibítory kompletnej proteázy bez EDTA). Jadrá boli sonikované pomocou ultrazvukového procesora Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) šesťkrát na 20 s na ľade a 1 minútu na ľade. Sonikované jadrá sa odstredili pri 13000 × g po dobu 4 minút pri 4 °C. Väčšina sonikovaného chromatínu mala dĺžku 500 až 1000 párov báz (bp). Pre každú imunoprecipitaciu sa inkubovalo 15 μg chromatínu v prítomnosti 10 μg monoklonálnej protilátky HP1 9A9 (3 hodiny pri 4 °C v rotujúcom kolese). Potom sa pridalo 50 μl proteínu dynabeads G a inkubácia pokračovala cez noc pri 4 °C. Supernatanty sa zlikvidovali a vzorky sa dvakrát premyli v Lysis Buffer (každé umývanie 15 minút pri 4 °C) a dvakrát v TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pri pH 8). Chromatín bol eluovaný z guľôčok v dvoch krokoch; najprv v 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pri pH 8) pri 65 °C počas 15 minút, po ktorom nasleduje centrifugácia a regenerácia supernatantu. Materiál guľôčok bol opätovne extrahovaný v 100 μl TE + 0,67% SDS. Kombinovaný eluát (200 μl) sa inkuboval cez noc pri 65 °C na reverzné zosieťovanie a ošetroval 50 μg/ml RNázy počas 15 minút pri 65 °C a 500 μg/ml proteinázy K počas 3 hodín pri 65 °C. Vzorky boli extrahované fenol-chloroformom a vyzrážané etanolom. DNA bola resuspendovaná v 25 μl vody. Na maximalizáciu molekulárnych analýz s imunoprecipitovanou DNA boli kandidátske gény amplifikované v pároch prostredníctvom optimalizovaného duplexno-PCR protokolu pomocou dvoch rôznych sád primérov s podobnými teplotami topenia v jednej reakcii.
(Casale a kol. 2019)
Vysokovýkonné ultrazvukové disruptory buniek pre biologické vzorky
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics je vaším dlhoročným skúseným partnerom, pokiaľ ide o vysokovýkonné ultrazvukové prístroje na narušenie buniek, lýzu, extrakciu proteínov, fragmentáciu DNA, RNA a chromatínu, ako aj ďalšie kroky prípravy predanalytických vzoriek. Spoločnosť Hielscher ponúka komplexné portfólio ultrazvukových laboratórnych homogenizátorov a jednotiek na prípravu vzoriek a má ideálne ultrazvukové zariadenie pre vašu biologickú aplikáciu a požiadavky.
Klasický ultrazvukový prístroj sondového typu s mikrohrotom, ako je UP200St (200 W; pozri obrázok vľavo) alebo jednu z ultrazvukových jednotiek na prípravu vzoriek VialTweeter alebo UP200St_TD_CupHorn s VialHolder sú obľúbené modely vo výskumných a analytických laboratóriách. Ideálna je klasická ultrazvuková sonda, pri príprave je potrebné lyzovať, extrahovať alebo fragmentovať menej vzoriek. Jednotky na prípravu vzoriek VialTweeter a UP200St_TD_CupHorn umožňujú súčasnú sonikáciu až 10 alebo 5 injekčných liekoviek.
Ak sa musí spracovať vysoký počet vzoriek (napr. 96-jamkové platne, mikrotitračné platne atď.), UIP400MTP je ideálne nastavenie sonikácie. UIP400MTP funguje ako väčší hrnček, ktorý je naplnený vodou a má dostatok priestoru na uloženie mikrojamkových tanierov. UIP400MTP poháňaný 400 wattovým výkonným ultrazvukovým procesorom poskytuje veľmi rovnomernú a intenzívnu sonikáciu viacjamkových platničiek s cieľom narušiť bunky, lyzovať vzorky, rozpustiť pelety, extrahovať proteíny alebo šmykovú DNA.
Presné ovládanie pomocou inteligentného softvéru
Všetky ultrazvukové riešenia Hielscher od 200 W vyššie sú vybavené digitálnou farebnou dotykovou obrazovkou a inteligentným softvérom. Prostredníctvom inteligentného protokolovania údajov sa všetky parametre ultrazvukového procesu automaticky ukladajú ako súbor CSV na vstavanú SD kartu hneď po spustení ultrazvuku. Vďaka tomu je výskum a protokolovanie oveľa pohodlnejšie. Po pokusoch sonikácie alebo príprave vzoriek môžete jednoducho skontrolovať parametre sonikácie každého sonikácie a porovnať ich.
Prostredníctvom intuitívneho menu je možné pred sonikáciou prednastaviť množstvo parametrov: Napríklad na reguláciu teploty vo vzorke a zabránenie jej tepelnej degradácii je možné nastaviť hornú hranicu teploty vzorky. Zásuvný snímač teploty, ktorý sa dodáva s ultrazvukovou jednotkou, poskytuje ultrazvukovému procesoru spätnú väzbu o skutočnej teplote sonikácie. Po dosiahnutí hornej hranice teploty sa ultrazvukový prístroj pozastaví, kým sa nedosiahne dolná hranica nastaveného ∆T, a potom sa automaticky znova začne sonikovať.
Ak je potrebná sonikacia so špecifickým energetickým vstupom, môžete prednastaviť konečnú ultrazvukovú energiu sonikácie. Samozrejme, ultrazvukovú pulzáciu a režim cyklu je možné nastaviť aj individuálne.
Ak chcete znova použiť svoje najúspešnejšie parametre sonikácie, môžete uložiť rôzne režimy sonikácie (napr. čas sonikácie, intenzita, režim cyklu atď.) ako prednastavené režimy, aby sa dali ľahko a rýchlo znova spustiť.
Pre väčšie pohodlie pri obsluhe je možné všetky digitálne ultrazvukové jednotky ovládať pomocou diaľkového ovládača prehliadača v akomkoľvek bežnom prehliadači (napr. InternetExplorer, Safari, Chrome atď.). Pripojenie LAN je jednoduché nastavenie plug-n-play a nevyžaduje žiadnu ďalšiu inštaláciu softvéru.
My v spoločnosti Hielscher vieme, že úspešná sonikácia biologických vzoriek si vyžaduje presnosť a opakovateľnosť. Preto sme naše ultrazvukové prístroje navrhli ako inteligentné zariadenia so všetkými funkciami, ktoré umožňujú efektívnu, spoľahlivú, reprodukovateľnú a pohodlnú prípravu vzoriek.
Nasledujúca tabuľka uvádza približnú kapacitu spracovania našich ultrazvukových systémov od ultrazvukových mikrohrotov a klasických ultrazvukových homogenizátorov až po ultrazvukové ultrazvukové zariadenia MultiSample pre pohodlnú a spoľahlivú prípravu mnohých vzoriek:
Objem dávky | Prietok | Odporúčané zariadenia |
---|---|---|
96-jamkové / mikrotitračné platne | N.A. | UIP400MTP |
10 injekčných liekoviek s objemom 0,5 až 1,5 ml | N.A. | VialTweeter na UP200St |
CupHorn na nepriamu sonikáciu, napr. do 5 injekčných liekoviek | N.A. | UP200St_TD_CupHorn |
00,01 až 250 ml | 5 až 100 ml/min | UP50H |
001 až 500 ml | 10 až 200 ml/min | UP100H |
002 až 1 l | 20 až 400 ml/min | UP200Ht / UP200St |
10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
025 až 5 l | 00,05 až 1 l/min | UIP500hdT |
Kontaktujte nás! / Opýtajte sa nás!
Fakty, ktoré stoja za to vedieť
Metabolomika
Metabolomika je štúdium malých molekúl, známych ako metabolity, prítomných v bunkách, biotekutinách, tkanivách alebo organizmoch. Tieto malé molekuly a ich interakcie v biologickom systéme sú zhrnuté pod zastrešujúcim pojmom "metabolóm" a oblasť výskumu sa nazýva metabolomika. Výskum metabolómov je úzko spätý s rýchlo sa rozvíjajúcou oblasťou presnej medicíny. Pochopenie metabolómu a jeho vzťahu k rôznym chorobám pomáha rozvíjať stratégie prevencie chorôb a klinickej starostlivosti pri individuálnej variabilite prostredia, životného štýlu, genetiky a molekulárneho fenotypu. Na uvoľnenie molekúl metabolitov z buniek sa ultrazvuk často používa v biologických laboratóriách na predanalytickú prípravu vzoriek, ako je narušenie buniek, lýza a extrakcia proteínov, lipidov a iných molekúl.
Literatúra / Referencie
- Casale, A.M.; Cappucci, U.; Fanti, L.; Piacentini, L. (2019): Heterochromatin protein 1 (HP1) is intrinsically required for post-transcriptional regulation of Drosophila Germline Stem Cell (GSC) maintenance. Sci Rep 9, 4372 (2019).
- Ristola, M.; Arpiainen, S., Saleem, M.A.; Mathieson, P.W.; Welsh, G.I.; Lehtonen, S.; Holthöfer, H.(2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biol 10, 83 (2009).
- Kharchenko, P.V: et al. (2011): Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila. Nature. 2011 Mar 24; 471(7339): 480–485.