Ultrazvuková lýza vzoriek Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster sa v laboratóriách široko používa ako modelový organizmus. Preto sa pri vzorkách Drosophila melanogaster musia často vykonávať predanalytické prípravné kroky, ako sú lýza, rozrušovanie buniek, extrakcia proteínov a štiepenie DNA strihovými silami. Ultrazvukové dezintegrátory sú spoľahlivé a účinné a umožňujú jednoducho vykonávať rôzne úlohy, ako sú lýza, extrakcia proteínov alebo fragmentácia DNA, len úpravou parametrov ultrazvukového procesu. Ultrazvukové homogenizátory sú tak flexibilnými nástrojmi so širokým rozsahom použitia.

Ultrazvuková lýza a extrakcia proteínov

Lýza, solubilizácia buniek, homogenizácia tkanív a extrakcia proteínov sú typickými úlohami ultrazvukových dezintegrátorov v biologických laboratóriách. Ultrazvukové dezintegrátory a zariadenia na rozrušovanie buniek sú vhodné na homogenizáciu živočíšnych tkanív, hmyzu (napr. Drosophila melanogaster, C. elegans) alebo rastlinných vzoriek. Ďalšími aplikáciami ultrazvuku sú lýza bunkových suspenzií a peliet, ako aj extrakcia vnútrobunkových proteínov.
Ultrazvuková lýza a extrakcia proteínov sú vysoko spoľahlivé a reprodukovateľné procesy, ktoré možno vykonávať na základe zavedených protokolov. Keďže intenzitu ultrazvukového procesu možno presne nastaviť pomocou parametrov sonikácie, ako sú amplitúda, cyklický / pulzný režim, teplota a objem vzorky, overené protokoly možno opakovane používať s rovnakým výsledkom.

Ultrazvuková fragmentácia DNA a RNA

Po lýze buniek a extrakcii proteínov je bežne požadovaným krokom pri príprave vzoriek štiepenie strihovými silami a fragmentácia DNA, RNA a chromatínu, napr. pred chromatínovou imunoprecipitáciou (ChIP). Fragmentáciu DNA a RNA možno spoľahlivo dosiahnuť rozrušením kovalentných väzieb, ktoré držia DNA pohromade, pôsobením fyzikálnych síl. Pri použití fyzikálneho štiepenia strihovými silami, napríklad pri sonikácii, sa najprv prerušia vlákna DNA a následne sa DNA fragmentuje na menšie časti.
Ultrazvuková fragmentácia DNA je spoľahlivá a účinná pri štiepení DNA strihovými silami na cieľovú dĺžku, napr. 500bp (párov báz). Medzi hlavné výhody ultrazvukovej fragmentácie DNA patrí presné riadenie parametrov a intenzity ultrazvukového procesu. Parametre ultrazvukového procesu možno nastaviť presným doladením intenzity, cyklov a času sonikácie. To umožňuje vytvárať fragmenty DNA požadovanej veľkosti a spoľahlivo dosahovať aj reprodukovať cieľovú dĺžku DNA. Ultrazvukové štiepenie DNA strihovými silami je ideálne aj na tvorbu fragmentov DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou.

Protokoly ultrazvukovej lýzy Drosophila melanogaster

Nižšie nájdete rôzne protokoly na ultrazvukom podporovanú lýzu, extrakciu proteínov a fragmentáciu DNA alebo chromatínu vo vzorkách Drosophila.

Ultrazvuková lýza na analýzu imunoprecipitáciou so zosieťovaním (CLIP)

Analýza CLIP sa vykonala podľa predchádzajúceho opisu s určitými úpravami. Približne 20 mg vaječníkov samičiek divokého typu vo veku 0 až 1 deň sa zosieťovalo UV žiarením (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizovalo na ľade v 1 mL pufra RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sacharóza, 1 mM DTT, 1× inhibítory proteáz Complete bez EDTA, 1 mM PMSF) doplneného o 300 U RNAseOUT a umiestnilo na ľad na 30 min. Homogenát sa sonikoval na ľade pri 80% výkone päťkrát v 20 s pulzoch so 60 s prestávkami medzi nimi pomocou ultrazvukového procesora Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) a centrifugoval sa (16 000 × g počas 5 min pri 4°C). Rozpustný extrakt sa predbežne prečistil pomocou 20 μl Protein-G dynabeads počas 20 min pri 4°C. Po odobratí vzoriek na imunoblotovanie a kvantifikáciu vstupnej RNA (1%) sa HP1 imunoprecipitoval protilátkou anti-HP1 9A9 zo 450 μl predbežne prečisteného extraktu inkubáciou počas 4 h s 50 μl Protein-G dynabeads. Imunoprecipitáty sa 4-krát premyli pufrom RCB. Na elúciu imunoprecipitovaných RNA sa guľôčky v pelete varili v 100 μL UltraPure DEPC-treated Water počas 5 min. K supernatantu získanému na prípravu RNA sa pridalo 900 μL Qiazol Reagent. Purifikovaná RNA sa použila ako templát na syntézu cDNA pomocou oligo dT, náhodných hexamérov a reverznej transkriptázy SuperScript III podľa protokolu výrobcu.
(Cassale et al. 2019)

Ultrazvuková lýza na analýzu chromatínovou imunoprecipitáciou

Chromatínová imunoprecipitácia sa vykonala podľa metódy opísanej Menetom s malými úpravami. Približne 20 mg vaječníkov samičiek divokého typu vo veku 0 až 1 deň sa homogenizovalo v 1 mL pufra NEB (10 mM HEPES-Na pri pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pri pH 8, 0,5 mM EDTA-Na pri pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidínu, 0,15 mM spermínu, 1× Complete Protease Inhibitors bez EDTA) pomocou homogenizátora / ponorného dispergátora počas 1 min (pri 3000 rpm). Homogenát sa preniesol do vopred vychladeného skleneného Dounceovho homogenizátora a vykonalo sa 15 úplných zdvihov tesne priliehajúcim piestom. Voľné jadrá sa potom centrifugovali pri 6000xg počas 10 min pri 4°C. Pelety obsahujúce jadrá sa resuspendovali v 1 mL pufra NEB a centrifugovali pri 20 000 × g počas 20 min na sacharózovom gradiente (0,65 mL 1,6 M sacharózy v pufri NEB, 0,35 mL 0,8 M sacharózy v pufri NEB). Peleta sa resuspendovala v 1 mL pufra NEB s formaldehydom s konečnou koncentráciou 1%. Jadrá sa zosieťovali počas 10 min pri izbovej teplote a reakcia sa zastavila pridaním 1/10 objemu 1,375 M glycínu. Jadrá sa zozbierali centrifugáciou pri 6000 × g počas 5 min. Jadrá sa dvakrát premyli v 1 mL pufra NEB a resuspendovali v 1 mL lyzačného pufra (15 mM HEPES-Na pri pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pri pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% deoxycholátu sodného, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarkozínu a 1× Complete Protease Inhibitors bez EDTA). Jadrá sa sonikovali pomocou ultrazvukového procesora Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) šesťkrát po 20 s so zapnutým ultrazvukom a s prestávkami po 1 min na ľade. Sonikované jadrá sa centrifugovali pri 13 000 × g počas 4 min pri 4°C. Väčšina sonikovaného chromatínu mala dĺžku 500 až 1000 párov báz (bp). Pri každej imunoprecipitácii sa 15 μg chromatínu inkubovalo v prítomnosti 10 μg monoklonálnej protilátky HP1 9A9 (3 h pri 4°C na rotačnom kolese). Potom sa pridalo 50 μl dynabeads protein G a inkubácia pokračovala cez noc pri 4°C. Supernatanty sa odstránili a vzorky sa dvakrát premyli v lyzačnom pufri (každé premývanie počas 15 min pri 4 °C) a dvakrát v pufri TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pri pH 8). Chromatín sa eluoval z guľôčok v dvoch krokoch; najprv v 100 μl elučného pufra 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pri pH 8) pri 65°C počas 15 min, po čom nasledovala centrifugácia a odobratie supernatantu. Materiál guľôčok sa opätovne extrahoval v 100 μl TE + 0,67% SDS. Spojený eluát (200 μl) sa inkuboval cez noc pri 65°C na zrušenie priečnych väzieb a ošetril sa 50 μg/ml RNaseA počas 15 min pri 65°C a 500 μg/ml proteinázy K počas 3 h pri 65°C. Vzorky sa extrahovali fenolom a chloroformom a precipitovali etanolom. DNA sa resuspendovala v 25 μl vody. Na maximalizáciu molekulárnych analýz imunoprecipitovanej DNA sa kandidátne gény amplifikovali v pároch podľa optimalizovaného protokolu duplex-PCR s použitím dvoch rôznych súborov primérov s podobnými teplotami topenia v jednej reakcii.
(Casale et al. 2019)
 

Vysokovýkonné ultrazvukové dezintegrátory buniek na biologické vzorky

Hielscher Ultrasonics je vaším partnerom s dlhoročnými skúsenosťami v oblasti vysokovýkonných ultrazvukových prístrojov na rozrušovanie buniek, lýzu, extrakciu proteínov, fragmentáciu DNA, RNA a chromatínu, ako aj ďalšie kroky predanalytickej prípravy vzoriek. Vďaka komplexnému portfóliu ultrazvukových laboratórnych homogenizátorov a jednotiek na prípravu vzoriek má Hielscher ideálne ultrazvukové zariadenie pre vašu biologickú aplikáciu a vaše požiadavky.
Klasický sondový ultrazvukový prístroj s mikrohrotom, napríklad UP200St (200W; pozri obrázok vľavo), alebo niektorá z ultrazvukových jednotiek na prípravu vzoriek VialTweeter alebo UP200ST_TD_CupHorn s držiakom VialHolder patria medzi obľúbené modely vo výskumných a analytických laboratóriách. Klasická ultrazvuková sonda je ideálna, keď je potrebné vykonať lýzu, extrakciu alebo fragmentáciu menšieho počtu vzoriek. Jednotky na prípravu vzoriek VialTweeter a UP200St_TD_CupHorn umožňujú súčasnú sonikáciu až 10, respektíve 5 liekoviek.
Ak je potrebné spracovať veľké počty vzoriek (napr. 96-jamkové platničky, mikrotitračné platničky atď.), UIP400MTP je ideálnou sonikačnou zostavou. UIP400MTP funguje ako väčší pohárový sonikátor, ktorý je naplnený vodou a má dostatok priestoru na umiestnenie platničiek s mikrojamkami. UIP400MTP, poháňaný výkonným ultrazvukovým procesorom s výkonom 400 wattov, zabezpečuje veľmi rovnomernú a intenzívnu sonikáciu viacjamkových platničiek na rozrušovanie buniek, lýzu vzoriek, solubilizáciu peliet, extrakciu proteínov alebo strihanie DNA.

Presné riadenie pomocou inteligentného softvéru

Všetky sonikačné riešenia Hielscher s výkonom od 200 wattov sú vybavené digitálnou farebnou dotykovou obrazovkou a inteligentným softvérom. Vďaka inteligentnému zaznamenávaniu údajov sa všetky parametre ultrazvukového procesu automaticky ukladajú ako súbor CSV na vstavanú kartu SD hneď po spustení ultrazvukového prístroja. Výskum a vedenie záznamov sú tak oveľa pohodlnejšie. Po sonikačných skúškach alebo príprave vzoriek si môžete jednoducho prezrieť parametre každého sonikačného cyklu a porovnať ich.
Prostredníctvom intuitívnej ponuky možno pred sonikáciou vopred nastaviť množstvo parametrov: napríklad na reguláciu teploty vo vzorke a zabránenie jej tepelnej degradácii možno nastaviť hornú hranicu teploty vzorky. Pripojiteľný snímač teploty, ktorý sa dodáva s ultrazvukovou jednotkou, poskytuje ultrazvukovému procesoru spätnú väzbu o aktuálnej teplote pri sonikácii. Po dosiahnutí hornej hranice teploty ultrazvukové zariadenie preruší činnosť, kým sa nedosiahne dolná hranica nastaveného ∆T, a potom automaticky znova spustí sonikáciu.
Ak sa vyžaduje sonikácia so špecifickým energetickým vstupom, môžete vopred nastaviť konečnú ultrazvukovú energiu sonikačného cyklu. Samozrejme, individuálne možno nastaviť aj ultrazvukovú pulzáciu a cyklický režim.
Na opätovné použitie vašich najúspešnejších sonikačných parametrov môžete uložiť rôzne režimy sonikácie (napr. čas sonikácie, intenzitu, cyklický režim atď.) ako prednastavené režimy, aby sa dali ľahko a rýchlo znova spustiť.
Pre väčšie pohodlie pri obsluhe možno všetky digitálne ultrazvukové jednotky ovládať na diaľku prostredníctvom ľubovoľného bežného prehliadača (napr. InternetExplorer, Safari, Chrome atď.). Pripojenie LAN sa jednoducho nastavuje spôsobom plug-n-play a nevyžaduje inštaláciu ďalšieho softvéru.
V spoločnosti Hielscher vieme, že úspešná sonikácia biologických vzoriek vyžaduje presnosť a opakovateľnosť. Preto sme naše ultrazvukové prístroje navrhli ako inteligentné zariadenia so všetkými funkciami, ktoré umožňujú efektívnu, spoľahlivú, reprodukovateľnú a pohodlnú prípravu vzoriek.

Nasledujúca tabuľka vám poskytuje predstavu o približnej kapacite spracovania našich ultrazvukových systémov, od ultrazvukových mikrohrotov a klasických ultrazvukových homogenizátorov až po ultrazvukové prístroje MultiSample na pohodlnú a spoľahlivú prípravu veľkého počtu vzoriek: