Hielscher Ultrazvukové technológie

Ultrazvuková lýza E. coli

  • E. coli baktérie sú najčastejšie používané baktérie v mikrobiológii a biotechnológii.
  • Ultrazvukový bunky disruptory poskytujú spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky pre lýzu E. coli.
  • Intenzívne, ale presne kontrolovateľné kavitácie a šmykové sily majú za následok úplné narušenie a vysoké výnosy extrakcie (napr. bielkoviny, DNA).

Bunkové narušenie Kavitácia

Baktérie Escherichia coli sú spoľahlivo zrolované pomocou ultrazvukových tkanív homogenizers.Ultrazvukové sondy-typ homogenizers pracovať s cca 20 000 cyklov za sekundu (na 20 kHz) a spôsobiť kavitácie v kvapalinách alebo supsensions. Akustické kavitácie mikroskopické oblasti vákuovo-ako tlaky a vysoké teploty, ktoré roztrhať bunky od seba. Hoci teploty môžu dosiahnuť niekoľko tisíc stupňov Celzia, Kavitácia objemy sú tak malé, že nie sú teplo procesu výrazne. Ultrazvuk generované akustické kavitácie a šmykovej sily perforovať alebo zlomiť bunkovej membrány E. coli – v závislosti od nastavenia zariadenia ultrazvukového homogenizéra.

Výhody Ultrazvukový rozpadu

  • presná kontrola lýzy (intenzita, amplitúda, teplota)
  • Optimálna adaptcia na špecifické vzorky
  • ovládanie teploty
  • pre veľmi malé až veľmi veľké vzorky (μL až litre)
  • Čistá mechanická liečba
  • Lineárna mierka-up z laboratória do výroby
Ultrazvukové zariadenie VialTweeter umožňuje simultánne prípravu vzoriek až do 10 injekčných liekoviek za rovnakých procesných podmienok. (Kliknite pre zväčšenie!)

VialTweeter pre ultrazvukovú lýzu

Žiadosť o informácie





Hoci chemická a enzymatická lýza môže byť problematické – pretože chemická lýza môže zmeniť proteínové štruktúry a zavádzať problémy s purifikáciou a enzymatická lýza vyžaduje dlhé inkubačné časy a nie je reprodukovateľná – ultrazvukové narušenie je sofistikovaný, rýchle prerušenie buniek metódou.
Ultrazvuková lyza je založená len na mechanických silách. Žiadne chemikálie sú pridané, ultrazvukom prestávky bunkovej steny shear sily. Chemická lyza môže zmeniť štruktúru bielkovín a zaviesť problémy s čistovaním. Enzymatické narušenie si vyžaduje dlhé inkubačné časy a nie je reprodukovateľné. Ultrazvukové bunkové narušenie buniek baktérií E.coli je rýchle, jednoduché, spoľahlivé a reprodukovateľné. To je dôvod, prečo Hielscher ultrasonicators sa používajú v biologických a biochemických laboratóriách po celom svete pre prípravu vzoriek, pre-ananlytiká, in-vitro diagonstics a rozmanité testy.

Všeobecné odporúčania

UP400St ultrasonicator s Prietokový reaktorUltrazvukom je najpopulárnejší technika pre rozkladový veľmi malé, stredné a veľké množstvo buniek suspenzií – z Pico-litrov až 100L/HR (pomocou ultrazvukového prietokovej bunky). Bunky sú zrezané kvapalnou šmyku a kavitácie. DNA je tiež strihaný počas ultrazvukom, takže nie je nutné pridať DNase do bunkovej suspenzie.
Regulácia teploty:
Pred ochladením vzorky a udržaním vzorky počas ultrazvukom na ľade sa môže ľahko predísť tepelnému degradácii vzorky.
V ideálnom prípade by sa vzorky mali uchovávať v chlade počas rozpadu, ale pre väčšinu vzoriek postačí, ak teplota nestúpne nad teplotu kultúry alebo zdroja tkaniva. Preto sa odporúča, aby pozastavenie na ľad a Sonikujte s niekoľkými krátkymi ultrazvukom impulzov 5-10 sec a pauzy 10-30 sec. Počas prestávk sa teplo môže rozptýliť, aby sa znovu vytvorila nízka teplota. Pri väčších vzorkách buniek sú k dispozícii rôzne reaktorov prietokového bunky s chladiacimi kabátormi.

Protokoly na prípravu E. coli Lysates

Analýza výrazov a čistenie rekombinantnej bielkoviny

Pelety E. coli bol sonicated s Ultrazvukový systém UP100H (Hielscher). Na tento účel sa bunková pelety resuspendovala v chladenej medzipamäti rozpadu (50 mM tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) a ochladí sa na ľad po dobu 10 min. Potom, bunka suspenzia bola sonicated s 10 krátkych výbuchy 10 s nasleduje interval 30 s pre chladenie. Nakoniec, bunky nečistoty boli odstránené ultracentodgation pri 4 ° c po dobu 15 min pri 14000 RPM. Pre potvrdenie rPR prejavu, supernatant bol prevádzkovaný na 12% polyakrylamidu gél a analyzoval SDS-PAGE a západné blotting. Čistenie rPR sa vykonalo pomocou ni2 +-NTA živica (Invitrogen, USA) podľa návodu výrobcu. V tejto fáze bola použitá natívna Metóda čistenia. Čistota purifikovanej bielkoviny sa hodnotila pomocou elektroforézy na 12% polyakrylamidového gélu a následné modré farbenie Coomassie. Vyčistená koncentrácia bielkovín bola meraná Micro BCA proteín Test Kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultrazvukový bunkovej disruptor UP100H (100W) pre lýzu, bunkové narušenie a DNA strihanie.

Ultrazvukový homogenizér UP100H 100W

Rast buniek, crosslinking a príprava extraktov E. coli buniek

Pre SeqA a RNA polymerázové ChIP-Chip E. coli MG1655 alebo MG1655 ΔseqA sa zvýšil pri teplote 37 ° c na OD600 približne 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2% glukóza) pred 27 μl formaldehydu (37%) na ml média boli pridané (Konečná koncentrácia 1%). Prekríženie sa vykonalo pri pomalom pretrepení (100 rpm) pri izbovej teplote 20 min nasledované kalením s 10 ml 2,5 M glycínu (Konečná koncentrácia 0,5 M). V prípade experimentov s tepelným otrasom sa E. coli MG1655 rozrástla v 65 ml LB média pri 30 ° c600 približne 0,3. Následne 30 ml kultúry bolo prevedené do vopred ohriaty banky pri 43 ° c a zvyšok udržiavaný pri 30 ° c. Krížovky a hasenie bolo popísané vyššie, okrem toho, že bunky boli držané pri 30 alebo 43 ° c 5 min pred ďalším pomalým pretrepávaním pri izbovej teplote. Bunky boli zhromaždené odstredenením a dvakrát sa umyjú studenou TBS (pH 7.5). Po resuspendácii v 1 ml tlmivého roztoku (10 mM tris (pH 8,0), 20% sacharózy, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lyzozýmu) a inkubácie pri 37 ° c po dobu 30 min, po ktorej nasleduje Pridanie 4 ml IP pufra, boli bunky sonicated na ľade s 12-násobne 30 na UP400St Ultrazvukový procesor (Hielscher Ultrasonics GmbH) s 100% energie. Po centrifugácii 10 min pri 9000 g sa pri teplote-20 ° c skladuje 800 μl alikotov supernatantu. (Waldminghaus 2010)

Nadprodukcia a čistenie enzýmov.

Pre nadprodukciu decahistidín (His10)-označili proteíny, E. coli BL21 (DE3) bol transformovaný s pET19b konštruktov. Jednodňové preculture sa zozbierala odstregáciou a 1% sa používalo na inokulovanie výrazu kultúry. Bunky nesúci pET19mgtB boli pestované pri 22 ° c až do optickej hustoty pri 600 nm (OD600) z 0,7. Kultúra bola prevedená na 17 ° c a indukoval 100 μM IPTG. Po 16 hodinách sa kultúra zozbierala odstregovaním pri teplote 7 500 × g pri teplote 4 ° c. Bunky boli resuspenvované v 50 mM fosfátový-pufrovaný soľný roztok (PBS) s 0,3 M NaCl pri pH 7,4 a narušený ultrazvukom s S2 mikro-tip sonotrode na UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Nemecko) v cykle 0,5 a amplitúda 75%.
Nadmerná produkcia decahistidínu-tagovaného GtfC bola indukovaná pri 37 ° c600 0,6 s 100 μM IPTG. Bunky boli potom inkubované na 4 h, zozbierané a vylúhované, ako je uvedené vyššie pre MgtB.
Výťažky z surových buniek sa odstreliali pri 15 000 × g a 4 ° c do sedimentu buniek trosiek. Objasnené výťažky boli naložené na 1-ml HisTrap FF surový stĺpce pomocou systému ÄKTAprime plus (GE Healthcare). Enzýmy boli vyčistené podľa výrobcu protokolu pre gradient Elučné jeho-označili proteíny. Eluované proteínové roztoky boli dialyzované dvakrát proti 1 000 objemom 50 mM PBS, pH 7,4, s 0,3 M NaCl pri teplote 4 ° c. Čistenie bolo analyzované 12% SDS-PAGE. Koncentrácia bielkovín bola stanovená metódou Bradford pomocou roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Nemecko). (Rabausch et al. 2013)

Extrakcia bielkovín z E. coli baktérie
Návnada proteín záujmu (v tomto prípade, MTV1 Arabidopsis thaliana) sa tavila na značku GST a vyjadrené v BL21 Escherichia coli (E. coli) bunky.
1. Vezmite jednu pelety GST-MTV1 a GST (čo zodpovedá 50 ml bakteriálnej kultúry) a resuspendujte každý v 2,5 mL extrakčného tlmivého roztoku ľadu.
2. Použite ultrasonicator UP100H (vybavený MS3 microtip-sonotrode pre malé objemy (2-5mL)) narušiť bakteriálne bunky, kým nie sú lúzované, čo je indikované zníženou opacity a zvýšenú viskozitu. To sa musí vykonať na ľade, a odporúča sa sonikovať v intervaloch (napr. 10 sec sonicating nasleduje 10 sec na ľad a tak ďalej). Je potrebné dbať na to, aby sonikoval s príliš vysokou intenzitou. Ak sa zistí spenenie alebo tvorba bielej zrazeniny, intenzita sa musí znížiť.
3. Preneste roztok lúzovaného baktérií do 1,5 mL mikroodstredivých rúr a odstreďte pri teplote 4 ° c, 16 000 x g počas 20 min.

Bielkoviny modifikovanej allikínom v E. coli

VialTweeter je pohodlný ultrasonicator pre malé homogenizácia vzoriekStanovenie sulfhydryl obsahu o 5,5 ′-Dithiobis (kyselina 2-nitrobenzoová) (DTNB) test
E. coli MG1655 noc kultúra bola použitá na inokulovať minimálne médium MOPS (1:100). Kultúra bola pestovaná aeróbne, kým sa nedosiahne A600 z 0,4. Kultúra bola rozdelená do 3 15-ml kultúr pre stresové ošetrenie. Neošetrená kultúra slúžila ako negatívna kontrola. 0,79 mM allikin (128 μg ml-1.) alebo 1 mM diamidu bol pridaný do jednej zo zostávajúcich dvoch kultúr. Kultúry boli inkubované 15 min. 5 ml každej kultúry boli zozbierané odstrel (8 525 × g, 4 ° c, 10 min). Bunky boli umývané dvakrát s 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, skladované anaeróbne pred použitím) a odstrel (13 000 × g, 4 ° c, 10 min). Bunky sa resuspendovali v pufrýze (PBS so 6 mM hydrochloridom guanidínia, pH 7,4) pred narušením pri teplote 4 ° c ultrazvukom (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Nemecko) (3 × 1 min). Bunkové nečistoty boli granulované odstrepanením (13 000 × g, 4 ° c, 15 min). Supernatant bol prevedený do 3,5-ml QS-makro kyvety (10 mm) s magnetickým miešaním Bar a zmiešané s 1 ml medzipamäte rozpadu. Vyhynutie vzoriek sa monitorovalo pri 412 nm s spektrofotometrom Jasco V-650, ktorý je vybavený držiakom na teplotu buniek PSC-718 (Jasco) pri izbovej teplote. bolo pridaných 100 μl 3 mM dithiobis (kyselina 2-nitrobenzoová). Zánik bol sledovaný až do dosiahnutia nasýtenia. Výpočet koncentrácie tiolu sa vykonal s použitím extinkčného koeficientu ε412 = 13 700 M-1. Cm-1. pre kyselinu thio-2-nitrobenzoic (TNB). Bunkové koncentrácie tiolu sa vypočítali na základe objemu E. coli buniek 6,7 × 10-15 liter a bunkovej hustoty a600 = 0,5 (ekvivalent 1 × 108 buniek ml-1. a kultúry). (Müller et al. 2016)

In vivo stanovenie glutatiónu

E. coli MG1655 sa rozrástla v minimálnom médiu MOPS v celkovom objeme 200ml, kým sa600 dosiahla 0,5. Kultúra bola rozdelená do 50-ml kultúr pre stresové ošetrenie. Po 15 minútach inkubácie s 0,79 mM allikín, 1 mM diamidom alebo dimetylsulfoxidom (kontrola) sa bunky zozbierali pri 4 000 g pri 4 ° c počas 10 min. bunky boli umývané dvakrát s KPE buffer pred resuspendáciou peliet v 700 μl KPE buffer. Pri deproteinácii sa pred narušením buniek ultrazvukom (3 x 1 min) pridali 300l 10% (w/v) kyseliny sulfosalicylovej. VialTweeter ultrasonicator). Supernatanty sa zozbierali po centrifugácii (30 min, 13, 000g, 4 ° c). Koncentrácie kyseliny sulfosalicylovej sa znížili na 1% pridaním 3 objemov KPE pufra. Merania celkového glutatiónu a GSSG sa vykonali podľa popisu vyššie. Bunkové glutatiónové koncentrácie boli vypočítané na základe objemu E. coli buniek 6,7×10-15 liter a bunkovej hustoty a600 0.5 (ekvivalent 1×108 buniek ml-1. a kultúry). Koncentrácie GSH boli vypočítané odčítaním 2 [GSSG] z celkového glutatiónu. (Müller et al. 2016)

Ultrazvukový disruptor pre bunkovú lýzu a ťažbu biologického materiálu (kliknite pre zväčšenie!)

Sonda typu ultrasonicator UP400St

Vyjadrenie ľudskej mAspAT v E. coli

Ultrazvukový bunkový disruptor UP400St (400W) na extrakciu intracelulárnej hmoty (napr. proteíny, organely, DNA, RNA atď.)Jedna kolónia E. coli BL21 (DE3), ktorá vyvrtne výraz vektor v 30 mL Luria-Bertani (LB) médium obsahujúce 100μg/mL ampicilín, a potom kultivovaný pri 37 º C až do optickej hustoty (OD600) dosiahla 0,6. Bunky boli zozbierané odstrepaním pri 4 000 × g po dobu 10 minút a resuspendovali v 3L čerstvej LB médium obsahujúce 100μg/mL ampicilín.
Následne bola indukovaná bielkovina s 1 mM izopropyl β-tetovaniaatramentumelecké-tiogalactopyranoside (IPTG) pri teplote 20 h pri 16 º C. Bunky sa zozbierali odstrel pri 8 000 × g po dobu 15 min a premyje sa tlmivým pufrom a (20 mM NaH2PO4, 0,5 M Nacla, pH 7,4). Približované 45g (mokrá váha) bunky boli získané z 3 L kultúry. Po centrifugácii sa bunkové pelety resuspendovali v 40 mL (pre 1 L kultúru) odsávací tlmivý roztok a a vylúzovaný ultrazvukom pri teplote ľadu A chladu pomocou UP400St nástroj (Dr. Hielscher GmbH, Nemecko). Bunková lýza bola odstrelianá pri 12 000 rpm na 15 min oddeliť rozpustné (supernatant) a vyzrážané (pelety) frakcie. (Jiang et al. 2015)

Nasledujúca tabuľka vám uvádza približnú spracovateľskú kapacitu našich ultrazvukov:

Objem šarže prietok Odporúčané Devices
0.5 až 1,5 mL neuv VialTweeter
1 až 500mL 10 až 200mL/min UP100H
10 až 2000mL 20 až 400mL/min UP200Ht, UP400St
0.1 až 20L 02 až 4 l / min UIP2000hdT
10 až 100L 2 až 10 l / min UIP4000
neuv 10 až 100 l / min UIP16000
neuv väčšia strapec UIP16000

Kontaktuj nás! / Opýtajte sa nás!

Ak chcete požiadať o dodatočné informácie o homogenizácii ultrazvukom, použite nižšie uvedený formulár. Radi Vám ponúkame ultrazvukový systém spĺňajúci Vaše požiadavky.









Vezmite prosím na vedomie naše Zásady ochrany osobných údajov,


Literatúra / Referencie



Fakty stojí za to vedieť

E. coli

Escherichia coli (E. coli) je gram-negatívny, facultatively anaeróbne, tyč-formoval, koliformná baktéria rodu Escherichia, ktorý sa bežne nachádza v spodnom čreve teplého-čistokrvných organizmov (endotherms). Existuje veľké množstvo E. coli kmeňov (alebo subtypov) s rôznymi vlastnosťami. Väčšina kmeňov E. coli je pre ľudí neškodná, napríklad kmene B a K-12, ktoré sa bežne používajú na výskumné aplikácie v laboratóriách. Avšak, niektoré kmene sú škodlivé a môže spôsobiť vážne ochorenie.
E. coli zohráva dôležitú úlohu v modernej biologické inžinierstvo a priemyselnej mikrobiológie, pretože baktérie je ľahko manipulovať. Spoločné laboratórne aplikácie, ktoré často zahŕňajú použitie E. coli, napríklad na vytvorenie rekombinantnej deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) alebo na pôsobiť ako modelový organizmus.
E. coli je veľmi všestranný hostiteľ pre produkciu heterológnych proteínov a na výrobu rekombinantných proteínov v E. coli sú k dispozícii systémy na vyjadrenie proteínového proteínu. Pomocou plazmidov, ktoré umožňujú vysokú úroveň prejavu bielkovín, gény môžu byť zavedené do baktérií, ktoré umožňuje produkovať takéto bielkoviny vo vysokých množstvách v priemyselných fermentačných procesoch.
E. coli sa používajú ako bunkové továrne na produkciu inzulínu. Ďalšie aplikácie zahŕňajú použitie modifikovanej E. coli buniek na vývoj a produkciu vakcín a imobilizovaných enzýmov, na výrobu biopalív, rovnako ako pre bioremediation.
Kmeň K-12 je mutant forma E. coli, že over-vyjadruje enzým alkalickej fosfatázy (ALP). Táto mutácia sa vyskytuje v dôsledku defektu génu, ktorý neustále kódy pre enzým. Ak gén produkuje výrobok bez akejkoľvek inhibície, je to známe ako konštitučné aktivity. Tento špecifický mutant forma sa používa pre izoláciu a čistenie ALP enzýmu.

Ultrazvukové DNA Strihanie

Ultrazvukové šmykové sily sú bežne používané metódy oddeliť od bunky a break DNA pramene na kúsky. Akustické kavitácie prestávky bunkovej steny a membrány extrahovať DNA z buniek a generovať fragmenty asi 600 – 800 BP na dĺžku, ktorá je ideálna pre analýzu.
Kliknite tu sa dozviete viac o ultrazvukové homogenizers pre fragmentáciu DNA!