Ultrazvuková lýza E. coli

  • E. coli baktérie sú najčastejšie používané baktérie v mikrobiológii a biotechnológii.
  • Ultrazvukový bunky disruptory poskytujú spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky pre lýzu E. coli.
  • Intenzívne, ale presne kontrolovateľné kavitácie a šmykové sily majú za následok úplné narušenie a vysoké výnosy extrakcie (napr. bielkoviny, DNA).

Prečo je ultrazvukové bunkové narušenie E. coli preferovanou metódou?

Ultrazvukové homogenizátory alebo sondové ultrasonicators ponúkajú niekoľko výhod pre E. coli lýza, pretože intenzívny ultrazvuk účinne narušuje bunkové steny a membrány. Sondové ultrasonicators sú široko používané pre E. coli lýza z nasledujúcich dôvodov:

  • Efektívne narušenie bunkových stien: E. coli má polotuhú bunkovú stenu zloženú z peptidoglykánu, ktorú môže byť ťažké zlomiť pomocou tradičných metód lýzy. Ultrasonicator typu sondy generuje intenzívne ultrazvukové vlny, ktoré vytvárajú kavitačné bubliny v kvapaline obklopujúcej bunky. Keď sa tieto bubliny zrútia, vytvárajú vysokorýchlostné kvapalné trysky a rázové vlny, ktoré vedú k mechanickému narušeniu bunkových stien a účinne uvoľňujú bunkový obsah, ako sú biomolekuly.
  • Zvýšená penetrácia: Ultrazvukové vlny generované sondou / sonotródou môžu preniknúť hlboko do vzorky, dosiahnuť väčší počet buniek E. coli a zaobchádzať s nimi rovnomerne. To pomáha zabezpečiť, aby lýza bola rovnomernejšia v celej vzorke, čo vedie k vyššej účinnosti narušenia buniek.
  • Skrátený čas spracovania: Energia dodávaná ultrazvukom typu sondy je vysoko koncentrovaná a lokalizovaná, čo vedie k rýchlej a efektívnej lýze buniek. V porovnaní s inými metódami, ako je bitie guľôčok alebo enzymatická lýza, ultrazvukom môže dosiahnuť lýzu E. coli v priebehu niekoľkých minút alebo dokonca sekúnd. Zatiaľ čo mnohé alternatívne techniky, ako je zmrazenie-rozmrazovanie, vyžadujú niekoľko kôl liečby, ultrazvuková lýza otvára bunky v jednom procesnom kroku.
  • Regulácia teploty: Najmodernejšie ultrasonicators sú vybavené teplotnými senzormi a inteligentným softvérom, ktorý umožňuje nastaviť maximálnu procesnú teplotu. Ultrasonicator sa automaticky zastaví po dosiahnutí teplotného limitu a začne proces ultrazvukom, keď sa dosiahne nastavený teplotný bod. Chladenie vzoriek v ľadovom kúpeli je jednoduchá metóda na udržanie nízkej teploty vzorky a zabránenie degradácii vzorky vyvolanej teplom.
  • Škálovateľnosť: Sondové ultrasonicators sú k dispozícii v rôznych veľkostiach, od vreckových zariadení až po veľké priemyselné modely. Vďaka tomu sú vhodné na spracovanie malých objemov v laboratóriu alebo rozšírenie pre väčšie aplikácie biologického spracovania, napr. výroba vakcín alebo biosyntéza molekúl.
  • Univerzálnosť: Ultrasonicators môžu byť použité pre rôzne aplikácie mimo lýzy buniek, ako je strihanie DNA, extrakcia proteínov, homogenizácia tkaniva, disperzia nanočastíc a emulgácia. Preto investovanie do sondy-typ ultrasonicator poskytuje všestrannosť vo výskume alebo priemyselnom prostredí.
  • Ultrazvukom typu sondy, ako je UP200St sú spoľahlivé tkanivové homogenizátory a drviče buniek, preto sa široko používajú na prípravu vzoriek v genetike, napr. na lýzu E.coli

    Extrakcia proteínov z buniek E.coli sa účinne vykonáva pomocou ultrazvuková sonda UP200St

    Sonda-typ ultrasonicator ponúka mnoho výhod pre E. coli lýza. Spoľahlivá a presná kontrola parametrov ultrazvukového procesu umožňuje optimalizovať prevádzkové parametre, ako je výkon, trvanie a manipulácia so vzorkami, aby sa dosiahli požadované výsledky.
     

    Žiadosť o informácie





     

    Tento návod vysvetľuje, aký typ ultrazvukom je najlepší pre vaše úlohy prípravy vzoriek, ako je lýza, narušenie buniek, izolácia proteínov, fragmentácia DNA a RNA v laboratóriách, analýza a výskum. Vyberte si ideálny typ ultrazvukom pre vašu aplikáciu, objem vzorky, počet vzoriek a priepustnosť. Hielscher Ultrasonics má ideálny ultrazvukový homogenizátor pre vás!

    Ako nájsť perfektný sonikátor pre narušenie buniek a extrakciu bielkovín vo vede a analýze

    Miniatúra videa

    Ultrazvuková fragmentácia DNA sa často používa ako krok prípravy vzorky v sekvenovaní ďalšej generácie (NGS)

    Elektroforetické analýzy genómovej DNA E. coli EDL933 podrobené ultrazvukom 0 – 15 min. L označuje rebrík DNA.
    (štúdia a obrázok: ©Basselet et al. 2008)

    Narušenie buniek pomocou ultrazvukovej kavitácie

    Ultrazvukové sondové homogenizátory pracujú s približne 20 000 cyklami za sekundu (pri 20 kHz) a spôsobujú kavitáciu v kvapalinách alebo suspenziách. Akustická kavitácia, mikroskopické oblasti vákuových tlakov a vysokých teplôt, ktoré trhajú bunky na kusy. Hoci teploty môžu dosiahnuť niekoľko tisíc stupňov Celzia, objemy kavitácie sú také malé, že proces výrazne nezohrievajú. Ultrazvukom generovaná akustická kavitácia a šmykové sily perforujú alebo rozbíjajú bunkovú membránu bakteriálnych buniek, ako je E.coli. Hielscher ultrasonicators umožňujú presnú kontrolu nad parametrami procesu, ako je ultrazvuková intenzita, amplitúda, energetický vstup a teplota. Tým môže byť proces ultrazvukovej lýzy optimálne prispôsobený typu bunky, bunkovej kultúre a cieľu procesu.
     

    Výhody Ultrazvukový rozpadu

    • presná kontrola lýzy (intenzita, amplitúda, teplota)
    • spoľahlivé, reprodukovateľné výsledky
    • Optimálna adaptcia na špecifické vzorky
    • ovládanie teploty
    • pre veľmi malé až veľmi veľké vzorky (μL až litre)
    • Čisto mechanické spracovanie
    • užívateľsky prívetivá, bezpečná prevádzka
    • Lineárna mierka-up z laboratória do výroby
    Ultrazvukové zariadenie VialTweeter umožňuje simultánne prípravu vzoriek až do 10 injekčných liekoviek za rovnakých procesných podmienok. (Kliknite pre zväčšenie!)

    VialTweeter pre ultrazvukovú lýzu

    Žiadosť o informácie





    Ultrazvukový homogenizátor vs iné techniky lýzy

    Zatiaľ čo chemická a enzymatická lýza môže byť problematická – pretože chemická lýza môže zmeniť proteínové štruktúry a zavádzať problémy s purifikáciou a enzymatická lýza vyžaduje dlhé inkubačné časy a nie je reprodukovateľná – ultrazvukové narušenie je sofistikovaný, rýchle prerušenie buniek metódou.
    Ultrazvuková lýza je založená len na mechanických silách. Nepridávajú sa žiadne chemikálie, ultrazvukom rozbije bunkovú stenu šmykovými silami. Chemická lýza môže zmeniť štruktúru proteínov a zaviesť problémy s čistením. Enzymatické narušenie vyžaduje dlhé inkubačné časy a nie je reprodukovateľné. Ultrazvukové bunkové narušenie buniek baktérií E.coli je rýchle, jednoduché, spoľahlivé a reprodukovateľné. Preto Hielscher ultrasonicators sa používajú v biologických a biochemických laboratóriách po celom svete na prípravu vzoriek, pre-ananlytiká, in-vitro diagonstika a rozmanité testy.

    Všeobecné odporúčania pre ultrazvukovú lýzu

    Ultrazvukom je najpopulárnejší technika pre rozkladový veľmi malé, stredné a veľké množstvo buniek suspenzií – z Pico-litrov až 100L/HR (pomocou ultrazvukového prietokovej bunky). Bunky sú zrezané kvapalnou šmyku a kavitácie. DNA je tiež strihaný počas ultrazvukom, takže nie je nutné pridať DNase do bunkovej suspenzie.
     

    Regulácia teploty počas ultrazvukovej lýzy E.coli
    Ultrazvukový bunkový disruptor UP100H (100W) pre narušenie buniek a extrakciu rastlinných zlúčenín.Pred ochladením vzorky a udržaním vzorky počas ultrazvukom na ľade sa môže ľahko predísť tepelnému degradácii vzorky.
    V ideálnom prípade by sa vzorky mali počas lýzy uchovávať ľadovo chladné, ale pre väčšinu vzoriek stačí, ak teplota nestúpne nad teplotu kultúry alebo tkanivového zdroja. Preto sa odporúča udržiavať suspenziu na ľade a sonikovať niekoľkými krátkymi ultrazvukovými impulzmi 5-10 sekúnd a pauzami 10-30 sekúnd. Počas prestávok sa teplo môže rozptýliť, aby sa obnovila nízka teplota. Pre väčšie vzorky článkov sú k dispozícii rôzne reaktory s prietokovými článkami s chladiacimi plášťami.
    Prečítajte si tu podrobné tipy a odporúčania pre úspešnú ultrazvukovú lýzu!

    Protokoly pre ultrazvukovú prípravu lyzátov E. coli

    Výskumníci používajú Hielscher ultrazvukové homogenizátory pre narušenie buniek E.coli. Nižšie nájdete rôzne testované a osvedčené protokoly pre E.coli lýza pomocou Hielscher ultrazvukové homogenizátory pre rôzne aplikácie súvisiace s E. coli.
     

    Tento videoklip ukazuje Hielscher ultrazvukový homogenizátor UP100H, ultrazvukom široko používaný na prípravu vzoriek v laboratóriách.

    Ultrazvukový homogenizátor UP100H

    Miniatúra videa

    Rast buniek, zosieťovanie a príprava extraktov z buniek E. coli pomocou ultrazvuku

    Pre SeqA a RNA polymerázové ChIP-Chip E. coli MG1655 alebo MG1655 ΔseqA sa zvýšil pri teplote 37 ° c na OD600 približne 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2% glukóza) pred 27 μl formaldehydu (37%) na ml média boli pridané (Konečná koncentrácia 1%). Prekríženie sa vykonalo pri pomalom pretrepení (100 rpm) pri izbovej teplote 20 min nasledované kalením s 10 ml 2,5 M glycínu (Konečná koncentrácia 0,5 M). V prípade experimentov s tepelným otrasom sa E. coli MG1655 rozrástla v 65 ml LB média pri 30 ° c600 približne 0,3. Následne sa 30 ml kultúry prenieslo do predhriatej banky pri 43 °C a zvyšok sa udržiaval pri teplote 30 °C. Zosieťovanie a kalenie bolo opísané vyššie s tým rozdielom, že bunky sa udržiavali pri teplote 30 alebo 43 °C počas 5 minút pred ďalším pomalým trepaním pri izbovej teplote. Bunky boli zozbierané centrifugáciou a dvakrát premyté studenou TBS (pH 7,5). Po resuspendovaní v 1 ml tlmivého roztoku na lýzu (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sacharózy, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lyzozýmu) a inkubácii pri teplote 37 ° C počas 30 minút, po ktorej nasledovalo pridanie 4 ml IP tlmivého roztoku, bunky boli sonikované na ľade s 12 krát 30 sekúnd a 30 sekúnd prestávky pomocou Hielscher ultrazvukový procesor UP400St pri 100% nastavení výkonu. Po 10-minútovej centrifugácii pri 9000 g sa 800 μl podiely supernatantu skladovali pri teplote -20 °C. (Waldminghaus 2010)
     

    Nadprodukcia a čistenie enzýmov ultrazvukovou sondou

    Ultrasonicator UP100H je laboratórny homogenizátor, ktorý sa často používa na prípravu vzoriek dosiek bunkových kultúr.Pri nadprodukcii proteínov označených dekahistidínom (His10) sa E. coli BL21(DE3) transformovala pomocou konštrukcií pET19b. Nočná predkultúra bola zozbieraná centrifugáciou a 1% sa použilo na naočkovanie expresívnej kultúry. Bunky nesúce pET19mgtB boli pestované pri teplote 22 °C až do optickej hustoty pri 600 nm (OD600) 0,7. Kultúra bola prenesená na 17 °C a indukovaná 100 μM IPTG. Po 16 hodinách sa kultúra zozbierala odstreďovaním pri teplote 7 500 × g pri 4 °C. Bunky boli resuspendované v 50 mM fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) s 0,3 M NaCl pri pH 7,4 a narušené ultrazvukom s mikro-hrotom sonotródy S2 na Hielscher ultrasonicator UP200St v cykle 0,5 a amplitúde 75%.
    Nadmerná produkcia decahistidínu-tagovaného GtfC bola indukovaná pri 37 ° c600 0,6 s 100 μM IPTG. Bunky boli potom inkubované na 4 h, zozbierané a vylúhované, ako je uvedené vyššie pre MgtB.
    Extrakty surových buniek boli odstredené pri teplote 15 000 × g a 4 °C, aby sa usadili bunkové zvyšky. Vyčírené extrakty boli naložené na 1-ml kolóny HisTrap FF Crude pomocou systému ÄKTAprime Plus. Enzýmy boli purifikované podľa protokolu výrobcu pre gradientovú elúciu proteínov označených His. Eluované proteínové roztoky boli dialyzované dvakrát oproti 1000 objemom 50 mM PBS, pH 7,4, s 0,3 M NaCl pri 4 °C. Čistenie bolo analyzované 12% SDS-PAGE. Koncentrácia proteínu bola stanovená Bradfordovou metódou s použitím Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
     

    Ultrazvuková extrakcia proteínu z baktérií E. coli
    Návnada proteín záujmu (v tomto prípade, MTV1 Arabidopsis thaliana) sa tavila na značku GST a vyjadrené v BL21 Escherichia coli (E. coli) bunky.

    1. Vezmite jednu peletu GST-MTV1 a GST (čo zodpovedá 50 ml bakteriálnej kultúry) a každú resuspendujte v 2,5 ml ľadovo studeného extrakčného tlmivého roztoku.
    2. Použite ultrasonicator UP100H (vybavený MS3 microtip-sonotrode pre malé objemy cca. 2-5ml) narušiť bakteriálne bunky, kým nie sú lyzované, čo je indikované zníženou opacitou a zvýšenou viskozitou. Toto sa musí vykonať na ľade a odporúča sa sonikovať v intervaloch (napr. 10 sekúnd ultrazvukom, po ktorom nasleduje 10 sekúnd pauza na ľade atď.). Je potrebné dbať na to, aby nedošlo k ultrazvukom s príliš vysokou intenzitou. Ak sa zistí penenie alebo tvorba bielej zrazeniny, intenzita sa musí znížiť.
    3. Preneste roztok lyzovaných baktérií do 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmaviek a odstreďte pri teplote 4 °C, 16 000 x g počas 20 minút.

     

    Ultrazvukové sondy využívajú sily akustickej kavitácie na narušenie bunky a extrakciu molekúl a DNA z E.coli.

    Sondové ultrasonicators ako UP400St použiť pracovný princíp akustickej kavitácie pre efektívnu lýzu E.coli.

    Expresná analýza a purifikácia rekombinantného proteínu pomocou ultrazvukom

    Peleta E. coli bola sonikovaná ultrazvukom Hielscher UP100H. Za týmto účelom sa bunkové pelety resuspendovali v chladenom tlmivom roztoku na lýzu (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) a 10 minút sa ochladili na ľade. Potom bola bunková suspenzia sonikovaná s 10 krátkymi dávkami 10 s, po ktorých nasledoval interval 30 s na chladenie. Nakoniec boli bunkové zvyšky odstránené ultracentrifugáciou pri teplote 4 °C počas 15 minút pri 14000 ot./min. Na potvrdenie expresie rPR bol supernatant aplikovaný na 12% polyakrylamidový gél a analyzovaný SDS-PAGE a Western blottingom. Čistenie rPR bolo vykonané pomocou živice Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) podľa príručky výrobcu. V tejto fáze bola použitá natívna metóda čistenia. Čistota purifikovaného proteínu bola hodnotená pomocou elektroforézy na 12% polyakrylamidovom géli a následnom farbení Coomassie modrou. Purifikovaná koncentrácia proteínu bola meraná testovacou súpravou proteínu Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Toto video ukazuje ultrazvukový cuphorn s výkonom 200 wattov na rozptýlenie, homogenizáciu, extrakciu alebo odplynenie laboratórnych vzoriek.

    Ultrazvukový cuphorn (200 wattov)

    Miniatúra videa

    Ultrazvukové homogenizátory pre E. coli Lysis

    Hielscher Ultrasonics navrhuje, vyrába a dodáva vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory pre spoľahlivú a účinnú lýzu baktérií E. coli a iných typov buniek, tkanív a bunkových kultúr.
    Široké portfólio ultrazvukových sond, rovnako ako nepriame ultrazvukom systémy nám umožňuje ponúknuť vám ideálny ultrazvukový tkanivový homogenizátor pre vaše bunkové narušenie a extrakciu aplikácie.

    Dizajn, výroba a poradenstvo – Kvalita vyrobená v Nemecku

    Hielscher ultrasonicators môžu byť diaľkovo ovládané prostredníctvom ovládania prehliadača. Parametre ultrazvukom je možné monitorovať a presne prispôsobiť požiadavkám procesu.Hielscher ultrasonicators sú dobre známe pre svoju najvyššiu kvalitu a dizajnové štandardy. Inteligentný softvér, intuitívne menu, programovateľné nastavenia a automatické protokolovanie údajov sú len niektoré z funkcií Hielscher ultrasonicators. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú hladkú integráciu našich ultrasonicators do výskumných a biotechnologických zariadení. Dokonca aj drsné podmienky a náročné prostredie sú ľahko zvládnuteľné Hielscher ultrasonicators.

    Hielscher Ultrasonics je spoločnosť certifikovaná podľa ISO a kladie osobitný dôraz na vysoko výkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a užívateľskou prívetivosťou. Samozrejme, Hielscher ultrasonicators sú v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.

    Nasledujúca tabuľka vám uvádza približnú spracovateľskú kapacitu našich ultrazvukov:

    Objem šarže prietok Odporúčané Devices
    viacvrstvové / mikrotiterové platne neuv UIP400MTP (UIP400MTP)
    CupHorn na injekčné liekovky alebo kadičky neuv Ultrazvukový CupHorn
    Ultrazvukový mikro-prietokový reaktor neuv GDmini2
    až 10 injekčných liekoviek s objemom 0,5 až 1,5 ml neuv VialTweeter
    0.5 až 1,5 mL neuv VialTweeter
    1 až 500mL 10 až 200mL/min UP100H
    10 až 2000mL 20 až 400mL/min UP200Ht, UP400St
    0.1 až 20L 02 až 4 l / min UIP2000hdT
    10 až 100L 2 až 10 l / min UIP4000
    neuv 10 až 100 l / min UIP16000
    neuv väčšia strapec UIP16000

    Kontaktuj nás! / Opýtajte sa nás!

    Požiadajte o ďalšie informácie

    Použite nižšie uvedený formulár a požiadajte o ďalšie informácie o ultrazvukových tkanivových homogenizátoroch a drvičoch buniek, aplikáciách lýzy a cenách. Radi s vami prediskutujeme váš proces a ponúkneme vám ultrazvukový homogenizátor, ktorý spĺňa vaše požiadavky!









    Vezmite prosím na vedomie naše Zásady ochrany osobných údajov,


    Video ukazuje ultrazvukový systém prípravy vzoriek UIP400MTP, ktorý umožňuje spoľahlivú prípravu vzoriek akýchkoľvek štandardných multi-well dosiek pomocou ultrazvuku s vysokou intenzitou. Typické aplikácie UIP400MTP zahŕňajú bunkovú lýzu, DNA, RNA a strihanie chromatínu, ako aj extrakciu bielkovín.

    Ultrasonicator UIP400MTP pre multi-well dosky ultrazvukom

    Miniatúra videa

    Ďalšie protokoly pre ultrazvukovú lýzu E. coli

    Proteíny modifikované alicínom v E. coli pomocou ultrazvukového výškového reproduktora

    VialTweeter na ultrazvukovom procesore UP200STStanovenie sulfhydryl obsahu o 5,5 ′-Dithiobis (kyselina 2-nitrobenzoová) (DTNB) test
    Kultúra E. coli MG1655 cez noc bola použitá na naočkovanie minimálneho média MOPS (1:100). Kultúra sa pestovala aeróbne, až kým sa nedosiahla hodnota A600 0,4. Kultúra bola rozdelená do troch 15 ml kultúr na liečbu stresu. Neošetrená kultúra slúžila ako negatívna kontrola. 0,79 mM alicínu (128 μg ml-1) alebo 1 mM diamid sa pridal do jednej zo zvyšných dvoch kultúr. Kultúry sa inkubovali 15 min. Odstreďovaním sa zozbieralo 5 ml každej kultúry (8 525 × g, 4 °C, 10 min). Bunky boli dvakrát premyté 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, anaeróbne uskladnené pred použitím) a odstredené (13 000 × g, 4 °C, 10 min). Bunky boli resuspendované v tlmivom roztoku lýzy (PBS s 6 mM guanidínium HCl, pH 7,4) pred narušením pri teplote 4 °C ultrazvukom (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Nemecko) (3 × 1 min). Bunkový odpad bol peletovaný centrifugáciou (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant sa preniesol do 3,5 ml QS-makro kyvety (10 mm) s magnetickou miešacou tyčinkou a zmiešal sa s 1 ml tlmivého roztoku na lýzu. Extinkcia vzoriek bola monitorovaná pri 412 nm spektrofotometrom Jasco V-650 vybaveným teplotne regulovaným držiakom buniek PSC-718 pri izbovej teplote. Pridalo sa 100 μl roztoku 3 mM ditiobis(2-nitrobenzoovej). Vyhynutie bolo monitorované, kým nedosiahne saturáciu. Výpočet koncentrácie tiolu bol vykonaný pomocou koeficientu extinkcie ε412 = 13 700 M-1. Cm-1. pre kyselinu thio-2-nitrobenzoic (TNB). Bunkové koncentrácie tiolu sa vypočítali na základe objemu E. coli buniek 6,7 × 10-15 liter a hustota buniek A600 = 0,5 (ekvivalent 1 × 108 buniek ml-1. a kultúry). (Müller et al. 2016)
     

    In vivo stanovenie glutatiónu pomocou drviča ultrazvukových buniek

    E.coli MG1655 sa pestovala v minimálnom médiu MOPS v celkovom objeme 200 ml, kým sa nedosiahla hodnota A600 0,5. Kultúra bola rozdelená na 50 ml kultúry na liečbu stresu. Po 15 minútach inkubácie s 0,79 mM alicínom, 1 mM diamidom alebo dimetylsulfoxidom (kontrola) sa bunky zbierali pri 4 000 g pri 4 °C počas 10 minút. Bunky boli dvakrát premyté pufrom KPE pred resuspendovaním peliet v 700 μl tlmivého roztoku KPE. Na deproteináciu sa pridalo 300l 10% (w/v) kyseliny sulfosalicylovej pred narušením buniek ultrazvukom (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatanty sa zozbierali po centrifugácii (30 min, 13, 000g, 4 ° c). Koncentrácie kyseliny sulfosalicylovej sa znížili na 1% pridaním 3 objemov KPE pufra. Merania celkového glutatiónu a GSSG sa vykonali podľa popisu vyššie. Bunkové glutatiónové koncentrácie boli vypočítané na základe objemu E. coli buniek 6,7×10-15 liter a hustota buniek A600 0,5 (ekvivalent 1×108 buniek ml-1. a kultúry). Koncentrácie GSH boli vypočítané odčítaním 2 [GSSG] z celkového glutatiónu. (Müller et al. 2016)

    Expresia ľudského mAspAT v E. coli pomocou ultrazvukového homogenizátora

    Ultrazvukový bunkový disruptor UP400St (400W) na extrakciu intracelulárnej hmoty (napr. proteíny, organely, DNA, RNA atď.)Jedna kolónia E. coli BL21 (DE3), ktorá vyvrtne výraz vektor v 30 mL Luria-Bertani (LB) médium obsahujúce 100μg/mL ampicilín, a potom kultivovaný pri 37 º C až do optickej hustoty (OD600) dosiahla 0,6. Bunky boli zozbierané odstrepaním pri 4 000 × g po dobu 10 minút a resuspendovali v 3L čerstvej LB médium obsahujúce 100μg/mL ampicilín.
    Následne bola indukovaná expresia proteínu 1 mM izopropylom β-ᴅ-1-tiogalaktopyranozidom (IPTG) počas 20 hodín pri teplote 16 °C. Bunky boli zozbierané centrifugáciou pri 8 000 × g počas 15 minút a premyté tlmivým roztokom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Z 3 l kultúry sa získali približne 45 g buniek (mokrá hmotnosť). Po centrifugácii boli bunkové pelety resuspendované v 40 ml (pre 1 l kultúru) ľadovo studený extrakčný tlmivý roztok A a lyzovaný ultrazvukom pri ľadovo chladnej teplote pomocou Hielscher ultrazvukový bunkový drvič UP400St. Lýza buniek bola centrifugovaná pri 12 000 ot./min. počas 15 minút, aby sa oddelili rozpustné (supernatant) a vyzrážané (pelety) frakcie. (Jiang et al. 2015)
     



    Fakty stojí za to vedieť

    E. coli

    Escherichia coli (E. coli) je gram-negatívny, facultatively anaeróbne, tyč-formoval, koliformná baktéria rodu Escherichia, ktorý sa bežne nachádza v spodnom čreve teplého-čistokrvných organizmov (endotherms). Existuje veľké množstvo E. coli kmeňov (alebo subtypov) s rôznymi vlastnosťami. Väčšina kmeňov E. coli je pre ľudí neškodná, napríklad kmene B a K-12, ktoré sa bežne používajú na výskumné aplikácie v laboratóriách. Avšak, niektoré kmene sú škodlivé a môže spôsobiť vážne ochorenie.
    E. coli zohráva dôležitú úlohu v modernej biologické inžinierstvo a priemyselnej mikrobiológie, pretože baktérie je ľahko manipulovať. Spoločné laboratórne aplikácie, ktoré často zahŕňajú použitie E. coli, napríklad na vytvorenie rekombinantnej deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) alebo na pôsobiť ako modelový organizmus.
    E. coli je veľmi všestranný hostiteľ pre produkciu heterológnych proteínov a na výrobu rekombinantných proteínov v E. coli sú k dispozícii systémy na vyjadrenie proteínového proteínu. Pomocou plazmidov, ktoré umožňujú vysokú úroveň prejavu bielkovín, gény môžu byť zavedené do baktérií, ktoré umožňuje produkovať takéto bielkoviny vo vysokých množstvách v priemyselných fermentačných procesoch.
    E.coli sa používajú ako bunkové továrne na výrobu inzulínu. Ďalšie aplikácie zahŕňajú použitie modifikovaných buniek E. coli na vývoj a výrobu vakcín a imobilizovaných enzýmov, na výrobu biopalív, ako aj na bioremediáciu.
    Kmeň K-12 je mutant forma E. coli, že over-vyjadruje enzým alkalickej fosfatázy (ALP). Táto mutácia sa vyskytuje v dôsledku defektu génu, ktorý neustále kódy pre enzým. Ak gén produkuje výrobok bez akejkoľvek inhibície, je to známe ako konštitučné aktivity. Tento špecifický mutant forma sa používa pre izoláciu a čistenie ALP enzýmu.
    Baktérie E. coli sú tiež široko používané ako bunkové továrne. Skonštruované mikróby (napr. baktérie) a rastlinné bunky môžu byť použité ako takzvané bunkové továrne. Tieto geneticky modifikované bunky produkujú molekuly, chemikálie, polyméry, bielkoviny a iné látky, ktoré sa používajú napríklad vo farmaceutickom, potravinárskom a chemickom priemysle. S cieľom uvoľniť molekuly produkované vo vnútri takýchto bioinžinierskych buniek je ultrazvuková lýza bežnou metódou na narušenie bunkových stien a prenos cieľových látok do okolitej kvapaliny. Prečítajte si viac o lýze bioinžinierskych buniek!

    Ultrazvukové DNA Strihanie

    Ultrazvukové šmykové sily sú bežne používanou metódou na uvoľnenie molekúl, organel a proteínov z vnútra bunky, ako aj na rozbitie vlákien DNA na kúsky. Akustická kavitácia rozbije bunkové steny a membrány, aby extrahovala DNA z buniek a vytvorila fragmenty asi 600 – 800 BP na dĺžku, ktorá je ideálna pre analýzu.
    Kliknite tu sa dozviete viac o ultrazvukové homogenizers pre fragmentáciu DNA!

    Literatúra/referencie


    Vysoko výkonné ultrazvukom! Produktový rad Hielscher pokrýva celé spektrum od kompaktného laboratórneho ultrasonicator cez stolové jednotky až po plne priemyselné ultrazvukové systémy.

    Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizers z laboratórium na priemyselnej veľkosti.


    Radi prediskutujeme váš proces.

    Poďme sa skontaktovať.