Ultrazvuková lýza E. coli

Baktérie E. coli sú najčastejšie používanými baktériami v mikrobiológii a biotechnológiách.
Ultrazvukové dezintegrátory buniek poskytujú spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky pri lýze E. coli.
Intenzívna, no presne regulovateľná kavitácia a šmykové sily vedú k úplnej dezintegrácii a vysokým výťažkom extrakcie (napr. proteínov, DNA).

Prečo je ultrazvuková dezintegrácia buniek E. coli preferovanou metódou?

Ultrazvukové homogenizátory alebo sondové ultrazvukové prístroje ponúkajú pri lýze E. coli viacero výhod, pretože intenzívny ultrazvuk účinne narúša bunkové steny a membrány. Sondové ultrazvukové prístroje sa vo veľkej miere používajú na lýzu E. coli z nasledujúcich dôvodov:

Účinné narušenie bunkových stien: E. coli má polotuhú bunkovú stenu zloženú z peptidoglykánu, ktorú môže byť ťažké narušiť tradičnými metódami lýzy. Sondový ultrazvukový prístroj generuje intenzívne ultrazvukové vlny, ktoré v kvapaline obklopujúcej bunky vytvárajú kavitačné bubliny. Pri kolapse týchto bublín vznikajú vysokorýchlostné prúdy kvapaliny a rázové vlny, ktoré spôsobujú mechanické narušenie bunkových stien a účinne uvoľňujú bunkový obsah, napríklad biomolekuly.

Lepšie prenikanie: Ultrazvukové vlny generované sondou / sonotródou môžu prenikať hlboko do vzorky, zasiahnuť väčší počet buniek E. coli a rovnomerne ich spracovať. To pomáha zabezpečiť rovnomernejšiu lýzu v celej vzorke, čo vedie k vyššej účinnosti dezintegrácie buniek.

Kratší čas spracovania: Energia dodávaná sondovým ultrazvukovým prístrojom je vysoko koncentrovaná a lokalizovaná, čo vedie k rýchlej a účinnej lýze buniek. V porovnaní s inými metódami, ako je mechanické rozbíjanie guľôčkami alebo enzymatická lýza, možno sonikáciou dosiahnuť lýzu E. coli v priebehu minút alebo dokonca sekúnd. Zatiaľ čo mnohé alternatívne techniky, napríklad zmrazovanie a rozmrazovanie, vyžadujú niekoľko cyklov spracovania, ultrazvuková lýza otvára bunky v jedinom procesnom kroku.

Regulácia teploty: Najmodernejšie ultrazvukové prístroje sú vybavené snímačmi teploty a inteligentným softvérom, ktorý umožňuje nastaviť maximálnu procesnú teplotu. Ultrazvukový prístroj sa pri dosiahnutí teplotného limitu automaticky pozastaví a po dosiahnutí nastavenej teploty spustí proces sonikácie. Chladenie vzoriek v ľadovom kúpeli je jednoduchou metódou na udržiavanie nízkej teploty vzorky a zabránenie jej degradácii spôsobenej teplom.

Škálovateľnosť: Sondové ultrazvukové prístroje sú dostupné v rôznych veľkostiach, od ručných zariadení až po veľkokapacitné priemyselné modely. Vďaka tomu sú vhodné na spracovanie malých objemov v laboratóriu aj na zväčšovanie mierky pre rozsiahlejšie bioprocesné aplikácie, napr. výrobu vakcín alebo biosyntézu molekúl.

Všestrannosť: Ultrazvukové prístroje možno okrem lýzy buniek použiť aj na rôzne ďalšie aplikácie, ako sú fragmentácia DNA šmykovými silami, extrakcia proteínov, homogenizácia tkanív, dispergovanie nanočastíc a emulgácia. Investícia do sondového ultrazvukového prístroja preto poskytuje všestranné využitie vo výskumnom alebo priemyselnom prostredí.

Sondové ultrazvukové prístroje, ako je UP200St, sú spoľahlivé homogenizátory tkanív a dezintegrátory buniek, a preto sa vo veľkej miere používajú na prípravu vzoriek v genetike, napr. na lýzu E.coli

Extrakcia proteínov z buniek E.coli sa účinne vykonáva pomocou ultrazvukovej sondy UP200St

Sondový ultrazvukový prístroj ponúka pri lýze E. coli mnoho výhod. Spoľahlivá a presná regulácia parametrov ultrazvukového procesu umožňuje optimalizovať prevádzkové parametre, ako sú výkon, trvanie a manipulácia so vzorkou, na dosiahnutie požadovaných výsledkov.

Tento návod vysvetľuje, ktorý typ sonikátora je najvhodnejší na vaše úlohy pri príprave vzoriek, ako sú lýza, rozrušovanie buniek, izolácia proteínov a fragmentácia DNA a RNA v laboratóriách, analytike a výskume. Vyberte si ideálny typ sonikátora podľa svojej aplikácie, objemu a počtu vzoriek a požadovanej kapacity spracovania. Hielscher Ultrasonics má pre vás ideálny ultrazvukový homogenizátor!

Ultrazvuková fragmentácia DNA sa často používa ako krok prípravy vzoriek pri sekvenovaní novej generácie (NGS)

Elektroforetické analýzy genómovej DNA E. coli EDL933 vystavenej pôsobeniu ultrazvuku počas 0 – 15 min. L označuje veľkostný marker DNA.
(štúdia a obrázok: ©Basselet et al. 2008)

Dezintegrácia buniek pomocou ultrazvukovej kavitácie

Ultrazvukové sondové homogenizátory pracujú s približne 20 000 cyklami za sekundu (pri 20kHz) a vyvolávajú kavitáciu v kvapalinách alebo suspenziách. Pri akustickej kavitácii vznikajú mikroskopické oblasti s tlakmi podobnými vákuu a vysokými teplotami, ktoré rozrušujú bunky. Hoci teploty môžu dosiahnuť niekoľko tisíc stupňov Celzia, kavitačné objemy sú také malé, že proces významne nezahrievajú. Akustická kavitácia a šmykové sily vyvolané ultrazvukom perforujú alebo narúšajú bunkovú membránu bakteriálnych buniek, napríklad E.coli. Ultrazvukové prístroje Hielscher umožňujú presné riadenie procesných parametrov, ako sú intenzita ultrazvuku, amplitúda, energetický vstup a teplota. Proces ultrazvukovej lýzy sa tak dá optimálne prispôsobiť typu buniek, bunkovej kultúre a cieľu procesu.

Výhody ultrazvukovej lýzy

presné riadenie lýzy (intenzita, amplitúda, teplota)
spoľahlivé, reprodukovateľné výsledky
optimálne prispôsobenie konkrétnym vzorkám
regulácia teploty
pre veľmi malé až veľmi veľké vzorky (od µL po litre)
čisto mechanické spracovanie
jednoduchá a bezpečná obsluha
lineárne zväčšovanie rozsahu z laboratória do výroby

Ultrazvukový prístroj VialTweeter umožňuje súčasnú prípravu vzoriek až v 10 liekovkách za rovnakých procesných podmienok. (Kliknutím zväčšíte!)

VialTweeter na ultrazvukovú lýzu

Ultrazvukový homogenizátor v porovnaní s inými technikami lýzy

Zatiaľ čo chemická a enzymatická lýza môžu byť problematické – keďže chemická lýza môže meniť štruktúry proteínov a spôsobovať problémy pri purifikácii a enzymatická lýza vyžaduje dlhé inkubačné časy a nie je reprodukovateľná – ultrazvuková dezintegrácia je sofistikovaná, rýchla metóda rozrušovania buniek.
Ultrazvuková lýza je založená výlučne na mechanických silách. Nepridávajú sa žiadne chemikálie, sonikácia narúša bunkovú stenu pôsobením šmykových síl. Chemická lýza môže meniť štruktúru proteínov a spôsobovať problémy pri purifikácii. Enzymatické rozrušovanie vyžaduje dlhé inkubačné časy a nie je reprodukovateľné. Ultrazvukové rozrušovanie buniek baktérie E.coli je rýchle, jednoduché, spoľahlivé a reprodukovateľné. Preto sa ultrazvukové prístroje Hielscher používajú v biologických a biochemických laboratóriách na celom svete na prípravu vzoriek, predanalytické postupy, diagnostiku in vitro a rozmanité analytické stanovenia.

Všeobecné odporúčania pre ultrazvukovú lýzu

Sonikácia je najobľúbenejšia technika lýzy veľmi malých, stredných a veľkých množstiev bunkových suspenzií – od pikolitrov až po 100L/hr (pri použití ultrazvukovej prietokovej cely). Bunky sa lyzujú pôsobením šmykových síl v kvapaline a kavitácie. Počas sonikácie sa šmykovými silami fragmentuje aj DNA, takže do bunkovej suspenzie nie je potrebné pridávať DNázu.

Regulácia teploty počas ultrazvukovej lýzy E.coli
Predchladením vzorky a jej udržiavaním na ľade počas sonikácie možno ľahko zabrániť tepelnej degradácii vzorky.
V ideálnom prípade by sa vzorky mali počas lýzy udržiavať ľadovo chladné, ale pri väčšine vzoriek postačuje, ak teplota nestúpne nad teplotu kultúry alebo zdrojového tkaniva. Preto sa odporúča udržiavať suspenziu na ľade a sonikovať niekoľkými krátkymi ultrazvukovými impulzmi s trvaním 5–10 sec a prestávkami 10–30 sec. Počas prestávok sa môže teplo rozptýliť, čím sa opäť dosiahne nízka teplota. Pre väčšie bunkové vzorky sú k dispozícii rôzne reaktory s prietokovou celou a chladiacimi plášťami.
Tu si prečítajte podrobné tipy a odporúčania na úspešnú ultrazvukovú lýzu!

Protokoly na ultrazvukovú prípravu lyzátov E. coli

Výskumníci používajú ultrazvukové homogenizátory Hielscher na rozrušovanie buniek E.coli. Nižšie nájdete rôzne otestované a overené protokoly lýzy E.coli pomocou ultrazvukových homogenizátorov Hielscher pre rôzne aplikácie súvisiace s E. coli.

Rast buniek, zosieťovanie a príprava bunkových extraktov E. coli pomocou ultrazvuku

Na analýzu SeqA a RNA polymerázy metódou ChIP-Chip sa E. coli MG1655 alebo MG1655 ΔseqA kultivovali pri 37°C na hodnotu OD₆₀₀ približne 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2% glukózy), potom sa pridalo 27 μl formaldehydu (37%) na ml média (konečná koncentrácia 1%). Zosieťovanie prebiehalo pri pomalom trepaní (100 rpm) pri izbovej teplote počas 20 min, po ktorom nasledovalo zastavenie reakcie pridaním 10 ml 2,5 M glycínu (konečná koncentrácia 0,5 M). Pri experimentoch s tepelným šokom sa E. coli MG1655 kultivovala v 65 ml média LB pri 30°C až do dosiahnutia OD₆₀₀ približne 0,3. Následne sa 30 ml kultúry prenieslo do predhriatej banky pri 43°C a zvyšok sa udržiaval pri 30°C. Zosieťovanie a zastavenie reakcie prebiehali podľa vyššie uvedeného postupu s tým rozdielom, že bunky sa pred ďalším pomalým trepaním pri izbovej teplote udržiavali pri 30 alebo 43°C počas 5 min. Bunky sa zozbierali centrifugáciou a dvakrát sa premyli studeným TBS (pH7.5). Po resuspendovaní v 1 ml lyzačného pufra (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sacharózy, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lyzozýmu) a inkubácii pri 37°C počas 30 min, po ktorej nasledovalo pridanie 4 ml IP pufra, sa bunky sonikovali na ľade 12-krát po 30 sec s prestávkami 30 sec pomocou ultrazvukového procesora Hielscher UP400St pri nastavení výkonu na 100%. Po centrifugácii počas 10 min pri 9000 g sa alikvotné podiely supernatantu s objemom 800 μl uchovávali pri -20°C. (Waldminghaus 2010)

Nadprodukcia a purifikácia enzýmov pomocou ultrazvukovej sondy

Na nadprodukciu proteínov s dekahistidínovou značkou (His10) sa E. coli BL21(DE3) transformovala konštruktmi pET19b. Predkultúra kultivovaná cez noc sa zozbierala centrifugáciou a 1% sa použilo na inokuláciu expresnej kultúry. Bunky nesúce pET19mgtB sa kultivovali pri 22°C až do dosiahnutia optickej hustoty pri 600 nm (OD600) 0,7. Kultúra sa preniesla do prostredia s teplotou 17°C a expresia sa indukovala pomocou 100 μM IPTG. Po 16 h sa kultúra zozbierala centrifugáciou pri 7 500 × g a 4°C. Bunky sa resuspendovali v 50 mM fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) s 0,3 M NaCl pri pH 7,4 a rozrušili sa ultrazvukom pomocou sonotródy S2 s mikrohrotom na ultrazvukovom prístroji Hielscher UP200St pri pracovnom cykle 0,5 a amplitúde 75%.
Nadprodukcia GtfC s dekahistidínovou značkou sa indukovala pri 37°C pri OD₆₀₀ 0,6 pomocou 100 μM IPTG. Bunky sa potom inkubovali počas 4 h, zozbierali sa a lyzovali podľa vyššie uvedeného postupu pre MgtB.
Surové bunkové extrakty sa centrifugovali pri 15 000 × g a 4°C, aby sa sedimentovali bunkové zvyšky. Vyčírené extrakty sa naniesli na kolóny HisTrap FF Crude s objemom 1 ml pomocou systému ÄKTAprime Plus. Enzýmy sa purifikovali podľa protokolu výrobcu pre gradientovú elúciu proteínov s histidínovou značkou. Eluované proteínové roztoky sa dvakrát dialyzovali proti 1 000-násobnému objemu 50 mM PBS, pH 7,4, s 0,3 M NaCl pri 4°C. Purifikácia sa analyzovala pomocou 12% SDS-PAGE. Koncentrácia proteínu sa stanovila Bradfordovou metódou pomocou Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Ultrazvuková extrakcia proteínu z baktérií E. coli
Cieľový návnadový proteín (v tomto prípade MTV1 z Arabidopsis thaliana) sa fúzuje so značkou GST a exprimuje sa v bunkách Escherichia coli (E. coli) BL21.

Odoberte po jednej pelete GST-MTV1 a GST (zodpovedajúcej 50 ml bakteriálnej kultúry) a každú resuspendujte v 2.5 mL ľadovo studeného extrakčného pufra.
Použite ultrazvukový prístroj UP100H (vybavený sonotródou MS3 s mikrohrotom pre malé objemy približne 2–5mL) na rozrušenie bakteriálnych buniek až do ich lýzy, ktorú indikuje znížený zákal a zvýšená viskozita. Tento postup sa musí vykonávať na ľade a odporúča sa sonikovať v intervaloch (napr. 10 sec sonikácie, po ktorých nasleduje 10 sec prestávka na ľade, a tak ďalej). Je potrebné dbať na to, aby intenzita sonikácie nebola príliš vysoká. Ak sa zistí penenie alebo tvorba bielej zrazeniny, intenzitu treba znížiť.
Preneste roztok lyzovaných baktérií do 1,5 mL mikrocentrifugačných skúmaviek a centrifugujte pri 4°C a 16 000 x g počas 20 min.

Ultrazvukové sondy využívajú sily akustickej kavitácie na narúšanie buniek a na extrakciu molekúl a DNA z E.coli.

Ultrazvukové prístroje so sondou, ako napríklad UP400St, využívajú princíp akustickej kavitácie na účinnú lýzu E.coli.

Analýza expresie a purifikácia rekombinantného proteínu pomocou sonikácie

Peleta E. coli bola sonikovaná ultrazvukovým prístrojom Hielscher UP100H. Na tento účel bola bunková peleta resuspendovaná vo vychladenom lyzačnom pufri (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) a chladená na ľade počas 10 min. Potom bola bunková suspenzia sonikovaná 10 krátkymi impulzmi trvajúcimi 10 s s následnými intervalmi 30 s na chladenie. Nakoniec boli bunkové zvyšky odstránené ultracentrifugáciou pri 4°C počas 15 min pri 14 000 rpm. Na potvrdenie expresie rPR bol supernatant podrobený elektroforéze na 12% polyakrylamidovom géli a analyzovaný metódami SDS-PAGE a Western blot. Purifikácia rPR sa uskutočnila pomocou živice Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) podľa pokynov výrobcu. V tejto fáze bola použitá metóda purifikácie za natívnych podmienok. Čistota purifikovaného proteínu bola hodnotená elektroforézou na 12% polyakrylamidovom géli a následným farbením Coomassieho modrou. Koncentrácia purifikovaného proteínu bola meraná pomocou súpravy na stanovenie proteínov Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Toto video ukazuje ultrazvukovú nádobovú sonotródu s výkonom 200 wattov na dispergáciu, homogenizáciu, extrakciu alebo odplyňovanie laboratórnych vzoriek.

Ultrazvukové homogenizátory na lýzu E. coli

Hielscher Ultrasonics navrhuje, vyrába a dodáva vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory na spoľahlivú a účinnú lýzu baktérií E. coli a iných typov buniek, tkanív a bunkových kultúr.
Široké portfólio ultrazvukových sond aj systémov na nepriamu sonikáciu nám umožňuje ponúknuť vám ideálny ultrazvukový homogenizátor tkanív pre vašu aplikáciu rozrušovania buniek a extrakcie.

Návrh, výroba a poradenstvo – kvalita vyrobená v Nemecku

Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojimi najvyššími štandardmi kvality a konštrukcie. Inteligentný softvér, intuitívne menu, programovateľné nastavenia a automatické zaznamenávanie údajov sú len niektorými z funkcií ultrazvukových prístrojov Hielscher. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémové začlenenie našich ultrazvukových prístrojov do výskumných a biotechnologických pracovísk. Ultrazvukové prístroje Hielscher si ľahko poradia aj s drsnými podmienkami a náročnými prostrediami.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť certifikovaná podľa ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a jednoduchým používaním. Samozrejme, ultrazvukové prístroje Hielscher sú v súlade s požiadavkami CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.

Nasledujúca tabuľka poskytuje predstavu o približnej spracovateľskej kapacite našich ultrazvukových prístrojov:

Objem dávky	Prietok	Odporúčané prístroje
viacjamkové / mikrotitračné platničky	n.a.	UIP400MTP
CupHorn na liekovky alebo kadičku	n.a.	Ultrasonic CupHorn
ultrazvukový mikroprietokový reaktor	n.a.	GDmini2
až 10 liekoviek s objemom 0,5 až 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 až 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 až 500mL	10 až 200mL/min	UP100H
10 až 2000mL	20 až 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 až 20L	0,2 až 4L/min	UIP2000hdT
10 až 100L	2 až 10L/min	UIP4000
n.a.	10 až 100L/min	UIP16000
n.a.	vyšší	zoskupenie prístrojov UIP16000

Kontaktujte nás! / Opýtajte sa nás!

Video predstavuje ultrazvukový systém na prípravu vzoriek UIP400MTP, ktorý umožňuje spoľahlivú prípravu vzoriek vo všetkých štandardných viacjamkových platničkách pomocou ultrazvuku s vysokou intenzitou. Medzi typické aplikácie zariadenia UIP400MTP patrí lýza buniek, fragmentácia DNA, RNA a chromatínu, ako aj extrakcia proteínov.

Ďalšie protokoly na ultrazvukovú lýzu E. coli

Proteíny modifikované alicínom v E. coli s použitím ultrazvukového prístroja VialTweeter

Stanovenie obsahu sulfhydrylových skupín pomocou testu s kyselinou 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoovou) (DTNB)
Nočná kultúra E. coli MG1655 bola použitá na inokuláciu minimálneho média MOPS (1:100). Kultúra bola kultivovaná aeróbne až do dosiahnutia A600 0,4. Kultúra bola rozdelená na tri 15-ml kultúry na vystavenie stresu. Neošetrená kultúra slúžila ako negatívna kontrola. Do jednej zo zostávajúcich dvoch kultúr bol pridaný 0,79 mM alicín (128 μg ml-1) a do druhej 1 mM diamid. Kultúry boli inkubované počas 15 min. Z každej kultúry bolo odobratých 5 ml a bunky boli získané centrifugáciou (8 525 × g, 4°C, 10 min). Bunky boli dvakrát premyté 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, pred použitím uchovávaný anaeróbne) a centrifugované (13 000 × g, 4°C, 10 min). Pred rozrušením pri 4°C ultrazvukom boli bunky resuspendované v lyzačnom pufri (PBS so 6 mM guanidínium HCl, pH 7,4) (VialTweeter ultrazvukový homogenizátor, Hielscher GmbH, Nemecko) (3 × 1 min). Bunkové zvyšky sa sedimentovali centrifugáciou (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant sa preniesol do 3,5-ml makrokyvety QS (10 mm) s magnetickým miešadielkom a zmiešal sa s 1 ml lyzačného pufra. Extinkcia vzoriek sa sledovala pri 412 nm pomocou spektrofotometra Jasco V-650 vybaveného teplotne regulovaným držiakom kyviet PSC-718 pri izbovej teplote. Pridalo sa 100μl 3 mM roztoku kyseliny ditiobis(2-nitrobenzoovej). Extinkcia sa sledovala až do dosiahnutia saturácie. Koncentrácia tiolov sa vypočítala pomocou extinkčného koeficientu ϵ₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 pre kyselinu tio-2-nitrobenzoovú (TNB). Bunkové koncentrácie tiolov sa vypočítali na základe objemu buniek E. coli 6,7 × 10^-15 litra a hustoty buniek A600 = 0,5 (zodpovedajúcej 1 × 10⁸ buniek ml^-1 kultúry). (Müller et al. 2016)

Stanovenie glutatiónu in vivo pomocou ultrazvukového dezintegrátora buniek

E.coli MG1655 sa kultivovala v minimálnom médiu MOPS s celkovým objemom 200ml až do dosiahnutia A600 0,5. Kultúra sa rozdelila na 50-ml kultúry na vystavenie stresu. Po 15 min inkubácie s 0,79 mM alicínom, 1 mM diamidom alebo dimetylsulfoxidom (kontrola) sa bunky zozbierali centrifugáciou pri 4 000g a 4°C počas 10 min. Bunky sa dvakrát premyli pufrom KPE a následne sa pelety resuspendovali v 700µl pufra KPE. Na odstránenie proteínov sa pred rozrušením buniek ultrazvukom pridalo 300l 10% (w/v) kyseliny sulfosalicylovej (3 x 1 min; VialTweeter ultrazvukový homogenizátor). Supernatanty sa odobrali po centrifugácii (30 min, 13 000g, 4°C). Koncentrácie kyseliny sulfosalicylovej sa znížili na 1% pridaním 3 objemov pufra KPE. Merania celkového glutatiónu a GSSG sa vykonali podľa vyššie uvedeného postupu. Bunkové koncentrácie glutatiónu sa vypočítali na základe objemu buniek E. coli 6,7×10^-15 litra a hustoty buniek A600 0,5 (zodpovedajúcej 1×10⁸ buniek ml^-1 kultúry). Koncentrácie GSH sa vypočítali odpočítaním 2[GSSG] od celkového glutatiónu. (Müller et al. 2016)

Expresia ľudskej mAspAT v E. coli pomocou ultrazvukového homogenizátora

Jedna kolónia E. coli BL21 (DE3) nesúca expresný vektor sa následne kultivovala v 30 mL média Luria-Bertani (LB) obsahujúceho 100μg/mL ampicilínu pri 37ºC, kým optická hustota (OD₆₀₀) nedosiahla 0,6. Bunky sa zozbierali centrifugáciou pri 4 000 × g počas 10 min a resuspendovali sa v 3L čerstvého média LB obsahujúceho 100μg/mL ampicilínu.
Následne sa expresia proteínu indukovala 1 mM izopropyl β-ᴅ-1-tiogalaktopyranozidom (IPTG) počas 20 h pri 16ºC. Bunky sa zozbierali centrifugáciou pri 8 000 × g počas 15 min a premyli sa pufrom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Z 3 L kultúry sa získalo približne 45g buniek (mokrá hmotnosť). Po centrifugácii sa bunkové pelety resuspendovali v 40 mL (na 1 L kultúry) ľadovo studeného extrakčného pufra A a lyzovali sa ultrazvukom pri ľadovo studenej teplote pomocou ultrazvukového dezintegrátora buniek Hielscher UP400St. Bunkový lyzát sa centrifugoval pri 12 000 rpm počas 15 min na oddelenie rozpustných (supernatant) a vyzrážaných (peleta) frakcií. (Jiang et al. 2015)

Súvisiace témy

Užitočné fakty

E.coli

Escherichia coli (E. coli) je gramnegatívna, fakultatívne anaeróbna, tyčinkovitá koliformná baktéria rodu Escherichia, ktorá sa bežne vyskytuje v dolnej časti čreva teplokrvných organizmov (endotermov). Existuje veľké množstvo kmeňov (alebo podtypov) E. coli s rôznymi vlastnosťami. Väčšina kmeňov E. coli je pre ľudí neškodná, napr. kmene B a K-12, ktoré sa bežne používajú na výskumné účely v laboratóriách. Niektoré kmene sú však škodlivé a môžu spôsobiť závažné ochorenia.
E. coli zohráva dôležitú úlohu v modernom biologickom inžinierstve a priemyselnej mikrobiológii, pretože s touto baktériou sa ľahko manipuluje. Medzi bežné laboratórne aplikácie, pri ktorých sa E. coli často používa, patrí napr. tvorba rekombinantnej deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) alebo využitie ako modelového organizmu.
E. coli je veľmi všestranným hostiteľom na produkciu heterológnych proteínov a na produkciu rekombinantných proteínov v E. coli sú dostupné rozmanité systémy expresie proteínov. Pomocou plazmidov, ktoré umožňujú vysokú úroveň expresie proteínov, možno do baktérií zaviesť gény, čo umožňuje produkovať takéto proteíny vo veľkých množstvách v priemyselných fermentačných procesoch.
E.coli sa používajú ako bunkové továrne na produkciu inzulínu. Ďalšie aplikácie zahŕňajú použitie modifikovaných buniek E. coli na vývoj a výrobu vakcín a imobilizovaných enzýmov, na výrobu biopalív, ako aj na bioremediáciu.
Kmeň K-12 je mutantná forma E. coli, ktorá nadmerne exprimuje enzým alkalickú fosfatázu (ALP). Táto mutácia vzniká v dôsledku poruchy génu, ktorý neustále kóduje tento enzým. Ak gén produkuje produkt bez akejkoľvek inhibície, označuje sa to ako konštitutívna aktivita. Táto špecifická mutantná forma sa používa na izoláciu a purifikáciu enzýmu ALP.
Baktérie E. coli sa tiež vo veľkej miere používajú ako bunkové továrne. Upravené mikroorganizmy (napr. baktérie) a rastlinné bunky sa môžu používať ako takzvané bunkové továrne. Tieto geneticky modifikované bunky produkujú molekuly, chemické látky, polyméry, proteíny a ďalšie látky, ktoré sa využívajú napríklad vo farmaceutickom, potravinárskom a chemickom priemysle. Na uvoľnenie molekúl produkovaných vo vnútri takýchto bioinžiniersky upravených buniek sa bežne používa ultrazvuková lýza, ktorá narúša bunkové steny a prenáša cieľové látky do okolitej kvapaliny. Prečítajte si viac o lýze bioinžiniersky upravených buniek!

Ultrazvuková fragmentácia DNA šmykovými silami

Pôsobenie ultrazvukových šmykových síl je bežne používanou metódou na uvoľnenie molekúl, organel a proteínov z vnútra buniek, ako aj na rozštiepenie vlákien DNA na fragmenty. Akustická kavitácia narúša bunkové steny a membrány s cieľom extrahovať DNA z buniek a vytvárať fragmenty s dĺžkou približne 600 – 800 bp, čo je ideálne na analýzu.
Kliknite sem a zistite viac o ultrazvukových homogenizátoroch na fragmentáciu DNA!

Literatúra / Referencie

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Vysokovýkonná ultrazvuková technika! Sortiment produktov Hielscher pokrýva celé spektrum od kompaktného laboratórneho ultrazvukového prístroja cez stolové jednotky až po plne priemyselné ultrazvukové systémy.

Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratórnej až po priemyselnú veľkosť.