Bioinžinierske baktérie, ako sú E. coli, ako aj geneticky modifikované typy cicavcov a rastlinných buniek, sa široko používajú v biotechnológiách na vyjadrenie molekúl. Na uvoľnenie týchto syntetizovaných bio-molekúl je potrebná spoľahlivá technika narušenia buniek. Vysoko výkon ultrazvukom je osvedčená metóda pre efektívnu a spoľahlivú bunkovú lýzu – ľahko škálovateľné na veľké priepustnosti. Hielscher Ultrasonics vám ponúka vysoko výkonné ultrazvukové zariadenia pre účinnú bunkovúlýzu s cieľom produkovať veľké objemy vysoko kvalitných bio-molekúl.

Extrakcia molekúl z bunkových tovární

Na výrobu širokej škály biomolekúl sa môžu ako mikrobiálne bunkové továrne použiť rôzne umelé mikróby a rastlinné bunky vrátane tovární mikrobiálnych buniek vrátane Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana a riasy, medzi mnohými inými. Tieto bunkové továrne môžu produkovať proteíny, lipidy, biochemické, polyméry, biopalivá a oleochemikálie, ktoré sa používajú ako potraviny alebo suroviny pre priemyselné aplikácie. Bunky používané ako bunkové továrne sú kultivované v uzavretých bioreaktoroch, kde môžu dosiahnuť vysokú účinnosť, špecifickosť a nízke energetické požiadavky.
Na izoláciu cieľových molekúl z bioinžinierovaných bunkových kultúr musia byť bunky narušené tak, aby sa intracelulárny materiál uvoľnil. Ultrazvukové bunkové disruptory sú dobre zavedené ako vysoko spoľahlivá a účinná technika pre rozpad buniek a uvoľňovanie zlúčenín.

Továrne na mikrobiálne bunky sú metabolicky navrhnuté bunky používané na syntézu rôznych cenných zlúčenín. Ultrazvukové narušenie buniek je efektívna a spoľahlivá metóda na uvoľnenie cenných zlúčenín z vnútra bunky.
Štúdia a grafika: ©Villaverde, 2010.

Výhody ultrazvukových bunkových disruptorov

Ako netepelná, mierna, ale vysoko efektívna technológia sa ultrazvukové disruptory používajú v laboratóriu a priemysle na lyzáciu buniek a na výrobu vysoko kvalitných extraktov, napr. používaných na izoláciu molekúl z bunkových tovární.

Power-ultrazvuk pre efektívne narušenie tovární mikrobiálnych buniek

Mechanizmus a účinky ultrazvukových bunkových disruptorov:
Ultrazvukové bunkové narušenie využívalo silu ultrazvukových vĺn. Ultrazvukový homogenizátor / bunkový disruptor je vybavený sondou (aka sonotrode) vyrobenou z titánovej zliatiny, ktorá osciluje pri vysokej frekvencii približne 20 kHz. To znamená, že ultrazvuková sonda páruje 20 000 vibrácií za sekundu do ultrazvukom kvapaliny. Ultrazvukové vlny spojené s kvapalinou sa vyznačujú striedavými vysokotlakovými / nízkotlakovými cyklami. Počas nízkotlakového cyklu sa kvapalina rozširuje a vznikajú minútové vákuové bubliny. Tieto veľmi malé bubliny rastú počas niekoľkých striedajúcich sa tlakových cyklov, kým nedokážu absorbovať žiadnu ďalšiu energiu. V tomto bode kavitačné bubliny násilne vybuchnú a vytvárajú lokálne mimoriadne energeticky husté prostredie. Tento jav je známy ako akustická kavitácia a vyznačuje sa lokálne veľmi vysokými teplotami, veľmi vysokými tlakmi a šmykovými silami. Tieto šmykové namáhanie účinne prerazia bunkové steny a zvyšujú prenos hmoty medzi interiérom bunky a okolitým rozpúšťadlom. Ako čisto mechanická technika sú rozpúšťadle generované šmykové sily široko používané a odporúčaný postup pre narušenie bakteriálnych buniek, ako aj pre izoláciu bielkovín. Ako jednoduchá a rýchla metóda narušenia buniek je ultrazvukom ideálna pre izoláciu malých, stredných a veľkých objemov. Hielscher digitálne ultrasonicators sú vybavené jasným menu nastavení pre presné ultrazvukom ovládanie. Všetky údaje o ultrazvukom sú automaticky uložené na vstavanej SD karte a sú jednoducho prístupné. Sofistikované možnosti odvodu tepla, ako je vonkajšie chladenie, ultrazvukom v režime pulzov atď. počas ultrazvukového procesu dezintegrácie zabezpečujú udržiavanie ideálnej teploty procesu a tým neporušenosť extrahovaných zlúčenín citlivých na teplo.

Výskum zdôrazňuje silné stránky ultrazvukových bunkových narušení a extrakcie

Chemat et al. (2017) vo svojej štúdii pokračuje, že "ultrazvukom asistovaná extrakcia je zelenou a ekonomicky životaschopnou alternatívou k konvenčným technikám pre potraviny a prírodné produkty. Hlavnými výhodami sú skrátenie času extrakcie a spracovania, množstvo použitej energie a rozpúšťadiel, jednotkové operácie a CO₂ emisie."
Gabig-Ciminska et al. (2014) použil vysokotlakový homogenizátor a ultrazvukový bunkový dsintegrator vo svojej štúdii na lýzu spór s cieľom uvoľniť DNA. Pri porovnaní oboch metód narušenia buniek výskumný tím dospel k záveru, že pokiaľ ide o bunkovú lýzu pre SPÓROVÚ DNA, "analýza bola vykonaná použitím bunkových lyzátov z homogenizácie vysokého tlaku. Potom sme si uvedomili, že ultrazvukové narušenie buniek má na tento účel vynikajúce výhody. Je pomerne rýchly a môže byť spracovaný pre malé objemy vzoriek." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekuly z bunkových tovární na výrobu potravín

Továrne na mikrobiálne bunky sú životaschopnou a účinnou výrobnou metodikou využívajúcej mikrobiálne organizmy na výrobu vysokých výnosov pôvodných a nepôvodných metabolitov metabolickým bioinžinierstvom mikrobiálnych mikroorganizmov, ako sú baktérie, kvasinky, huby atď. Voľne ložené enzýmy sa napríklad vyrábajú pomocou mikroorganizmov auch ako Aspergillus oryzae, huby a baktérie. Tieto voľne ložené enzýmy sa používajú na výrobu potravín a nápojov, ako aj v poľnohospodárstve, bioenergii a starostlivosti o domácnosť.
Niektoré baktérie ako Acetobacter xylinum a Gluconacetobacter xylinus produkujú celulózu počas fermentačného procesu, kde sa nanovlákny syntetizujú v procese zdola nahor. Bakteriálna celulóza (tiež známa ako mikrobiálna celulóza) je chemicky ekvivalentná rastlinnej celulóze, ale má vysoký stupeň kryštalickosti a vysokej čistoty (bez lignínu, hemicelulózy, pektínu a iných biogénnych zložiek), ako aj jedinečnú štruktúru trojrozmernej (3D) retikulovanej siete celulózového nanomfidovaného nanompozitu. (porovnaj Zhong, 2020) V porovnaní s celulózou odvodenou z rastlín je bakteriálna celulóza udržateľnejšia a produkovaná celulóza si nevyžaduje komplexné kroky čistenia. Ultrazvukom a extrakcia rozpúšťadlom pomocou NaOH alebo SDS (dodecyl sulfát) sú veľmi účinné pre izoláciu bakteriálnej celulózy z bakteriálnych buniek.

Biomolekuly z bunkových tovární pre farmaceutickú výrobu a výrobu vakcín

Jedným z najvýznamnejších farmaceutických produktov získaných z bunkových tovární je ľudský inzulín. Na produkciu bioinžinierovaného inzulínu sa používajú prevažne E. coli a Saccharomyces cerevisiae. Keďže bio-syntetizované nano-veľké molekuly ponúkajú vysokú biokompatibilitu, biologické nanočastice, ako je feritín, sú výhodné pre početné biomanufakturačné aplikácie. Okrem toho je produkcia v metabolicky upravených mikróboch často výrazne účinnejšia pri získaných výnosoch. Napríklad výroba kyseliny artemisinovej, resveratrolu a lykopénu sa desaťnásobne zvýšila na niekoľko stonásobne a už je stanovená alebo je vo vývoji priemyselnej výroby. (porovnaj Liu et al.; Mikrob. Bunkový fakt. 2017)
Napríklad nano-veľké biomolekuly na báze bielkovín so samozmontačnými vlastnosťami, ako sú feritín a častice podobné vírusom, sú obzvlášť zaujímavé pre vývoj vakcíny, pretože napodobňujú veľkosť a štruktúru patogénov a sú vhodné na povrchovú konjugáciu antigénov na podporu interakcie s imunitnými bunkami. Takéto molekuly sú vyjadrené v takzvaných bunkových továrňach (napr. skonštruované kmene E. coli), ktoré produkujú určitú cieľovú molekulu.

Protokol pre ultrazvukovú lýzu a E. coli BL21 pre uvoľnenie feritínu

Feritín je proteín, ktorého primárnou funkciou je skladovanie železa. Feritín vykazuje sľubné schopnosti ako samozmontovanie nanočastíc vo vakcínach, kde sa používa ako nosič vakcíny (napr. hrotové proteíny SARS-Cov-2). Vedecký výskum sun et. al. (2016) ukazuje, že rekombinantný feritín sa môže uvoľňovať ako rozpustná forma z Escherichia coli pri nízkych koncentráciách NaCl (≤50 mmol/l). Na vyjadrenie feritínu v E. coli BL21 a uvoľnenie fertínu sa úspešne použil nasledujúci protokol. Rekombinantný pET-28a/feritin plazmid sa transformoval na kmeň E coli BL21 (DE3). Feritínové bunky E coli BL21 (DE3) boli kultivované v rastových médiách LB s 0,5% kanamycínom pri 37 °C a indukované pri OD600 0, 6 s 0, 4% izopropyl-β-D-tiogalactopyranoidom počas 3 hodín pri 37 °C. Konečná kultúra sa potom zbierala odstreďovaním pri 8000 g počas 10 minút pri teplote 4 °C a peleta sa zbierala. Potom sa peleta resuspendovala v LB médiu (1% NaCl, 1% typón, 0,5% extrakt z kvasiniek)/tlmivý roztok (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) a rôzne koncentrácie roztoku NaCl (0, 50, 100, 170 a 300 mmol/l). V prípade bakteriálnej bunkovej lýzy sa ultrazvukom použilo v pulznom režime: napr. ultrasonicator UP400St pri 100 % amplitúde s pracovným cyklom 5 sekúnd ZAPNUTÝ, 10 sekúnd VYPNUTÝ, počas 40 cyklov) a potom odstreďovaný pri 10 000 g počas 15 minút pri teplote 4 °C. Supernatant a zrazenina boli analyzované dodecyl sulfátovým polyakrylamidovým gélom (SDS-PAGE). Všetky gély zafarbené dodecyl sulfátom sodným boli skenované skenerom s vysokým rozlíšením. Gélové obrázky boli analyzované pomocou softvéru Magic Chemi 1D. Pre optimálnu jasnosť boli proteínové pásy detekované úpravou parametrov. Údaje o pásmach boli generované z technických troch. (porovnaj Sun et al., 2016)

Ultrazvukové bunkové disruptory pre priemyselnú lýzu bunkových tovární

Ultrazvuková lýza a extrakcia je spoľahlivá a pohodlná metóda uvoľňovania metabolitov z bunkových tovární, čím pomáha efektívnej produkcii cieľových molekúl. Ultrazvukové bunkové disruptory sú k dispozícii od laboratória po priemyselnú veľkosť a procesy môžu byť zmenšené úplne lineárne.
Hielscher Ultrasonics je váš kompetentný partner pre vysoko výkonné ultrazvukové disruptory a má dlhoročné skúsenosti v oblasti implantácie ultrazvukových systémov v bench-top a priemyselné nastavenia.
Pokiaľ ide o sofistikovaný hardvér a softvér, systémy narušenia buniek Hielscher Ultrasonics spĺňa všetky požiadavky na optimálne riadenie procesov, jednoduchú prevádzku a užívateľskú prívetivosť. Zákazníci a užívateľ Hielscher ultrasonicators oceniť výhody, že Hielscher ultrazvukové bunkové disruptory a extraktory umožňujú presné monitorovanie a kontrolu procesov – prostredníctvom digitálneho dotykového displeja a diaľkového ovládania prehliadača. Všetky dôležité údaje o ultrazvukom (napr. čistá energia, celková energia, amplitúda, trvanie, teplota, tlak) sú automaticky uložené ako súbor CSV na integrovanej SD karte. To pomáha dosiahnuť reprodukovateľné a opakovateľné výsledky a uľahčuje štandardizáciu procesov, ako aj plnenie správnych výrobných postupov (cGMP).
Samozrejme, ultrazvukové procesory Hielscher sú postavené pre 24/7 prevádzku pri plnom zaťažení, a preto môžu byť spoľahlivo prevádzkované v priemyselných výrobných nastaveniach. Vzhľadom na vysokú robustnosť a nízku údržbu sú prestoje ultrazvukového zariadenia naozaj nízke. Funkcie CIP (clean-in-place) a SIP (sterilizovať na mieste) minimalizujú namáhavé čistenie, najmä preto, že všetky mokré časti sú hladké kovové povrchy (žiadne skryté otvory alebo trysky).

Nasledujúca tabuľka vám uvádza približnú spracovateľskú kapacitu našich ultrazvukov: