Ultrazvuková lýza bioinžiniersky upravených buniek v priemyselnej výrobe

Bioinžiniersky upravené druhy baktérií, ako je E. coli, ako aj geneticky modifikované typy cicavčích a rastlinných buniek sa v biotechnológiách široko používajú na expresiu molekúl. Na uvoľnenie týchto syntetizovaných biomolekúl je potrebná spoľahlivá technika rozrušovania buniek. Vysokovýkonné ultrazvukové spracovanie je osvedčenou metódou účinnej a spoľahlivej lýzy buniek – s možnosťou jednoduchého škálovania na spracovanie veľkých objemov. Hielscher Ultrasonics vám ponúka vysokovýkonné ultrazvukové zariadenia na účinnú lýzu buniek s cieľom produkovať veľké objemy vysokokvalitných biomolekúl.

Extrakcia molekúl z bunkových tovární

Na produkciu širokého spektra biomolekúl možno ako mikrobiálne bunkové továrne použiť rôzne upravené mikroorganizmy a rastlinné bunky vrátane Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, siníc, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana a rias, ako aj mnohých ďalších. Tieto bunkové továrne môžu produkovať proteíny, lipidy, biochemické látky, polyméry, biopalivá a oleochemikálie, ktoré sa používajú ako potraviny alebo suroviny na priemyselné aplikácie. Bunky používané ako bunkové továrne sa kultivujú v uzavretých bioreaktoroch, kde môžu dosahovať vysokú účinnosť, špecificitu a nízke energetické nároky.
Na izoláciu cieľových molekúl z bioinžiniersky upravených bunkových kultúr sa bunky musia rozrušiť, aby sa uvoľnil vnútrobunkový materiál. Používanie ultrazvukových dezintegrátorov buniek je osvedčenou, vysoko spoľahlivou a účinnou technikou dezintegrácie buniek a uvoľňovania zlúčenín.

Mikrobiálne bunkové továrne sú bunky upravené metabolickým inžinierstvom, ktoré sa používajú na syntézu rôznych cenných zlúčenín. Ultrazvukové rozrušovanie buniek je účinná a spoľahlivá metóda uvoľňovania cenných zlúčenín z vnútra buniek.
štúdia a grafika: ©Villaverde, 2010.

Výhody ultrazvukových dezintegrátorov buniek

Ultrazvukové dezintegrátory sa ako netepelná, šetrná, no vysoko účinná technológia používajú v laboratóriách a priemysle na lýzu buniek a výrobu vysokokvalitných extraktov, napr. na izoláciu molekúl z bunkových tovární.

Výkonový ultrazvuk na účinné rozrušovanie mikrobiálnych bunkových tovární

Mechanizmus a účinky ultrazvukových dezintegrátorov buniek:
Ultrazvukové narúšanie buniek využíva silu ultrazvukových vĺn. Ultrazvukový homogenizátor / dezintegrátor buniek je vybavený sondou (nazývanou aj sonotróda) z titánovej zliatiny, ktorá kmitá pri vysokej frekvencii približne 20 kHz. To znamená, že ultrazvuková sonda prenáša do sonikovanej kvapaliny 20 000 kmitov za sekundu. Ultrazvukové vlny prenášané do kvapaliny sa vyznačujú striedaním cyklov vysokého a nízkeho tlaku. Počas nízkotlakového cyklu sa kvapalina rozpína a vznikajú drobné vákuové bubliny. Tieto veľmi malé bubliny rastú počas niekoľkých striedajúcich sa tlakových cyklov, až kým už nedokážu absorbovať ďalšiu energiu. V tomto okamihu kavitačné bubliny prudko implodujú a lokálne vytvárajú prostredie s mimoriadne vysokou hustotou energie. Tento jav je známy ako akustická kavitácia a vyznačuje sa lokálne veľmi vysokými teplotami, veľmi vysokými tlakmi a šmykovými silami. Tieto šmykové napätia účinne narúšajú bunkové steny a zvyšujú prenos hmoty medzi vnútrom bunky a okolitým rozpúšťadlom. Využitie šmykových síl vytváraných ultrazvukom je čisto mechanickou technikou, ktorá sa široko používa a odporúča na narúšanie bakteriálnych buniek, ako aj na izoláciu proteínov. Sonikácia je jednoduchá a rýchla metóda narúšania buniek, ideálna na izoláciu v malých, stredných a veľkých objemoch. Digitálne ultrazvukové prístroje Hielscher sú vybavené prehľadnou ponukou nastavení na presné riadenie sonikácie. Všetky údaje o sonikácii sa automaticky ukladajú na zabudovanú SD kartu a sú ľahko dostupné. Pokročilé možnosti odvádzania tepla počas procesu ultrazvukovej dezintegrácie, ako napríklad externé chladenie, sonikácia v pulznom režime atď., zabezpečujú udržiavanie ideálnej procesnej teploty, a tým aj zachovanie neporušenosti extrahovaných zlúčenín citlivých na teplo.

Výskum zdôrazňuje silné stránky ultrazvukového narúšania buniek a extrakcie

Prof. Chemat a kol. (2017) vo svojej štúdii zhŕňajú, že „ultrazvukom asistovaná extrakcia je ekologickou a ekonomicky životaschopnou alternatívou ku konvenčným technikám spracovania potravín a prírodných produktov. Hlavnými prínosmi sú skrátenie času extrakcie a spracovania, zníženie množstva spotrebovanej energie a použitých rozpúšťadiel, počtu jednotkových operácií a emisií CO₂ .”
Gabig-Ciminska a kol. (2014) vo svojej štúdii použili vysokotlakový homogenizátor a ultrazvukový dezintegrátor buniek na lýzu spór s cieľom uvoľniť DNA. Pri porovnaní oboch metód narúšania buniek výskumný tím v súvislosti s lýzou buniek na získanie DNA zo spór dospel k záveru, že „analýza sa vykonala s použitím bunkových lyzátov z vysokotlakovej homogenizácie. Následne sme si uvedomili, že ultrazvukové narúšanie buniek má na tento účel vynikajúce výhody. Je pomerne rýchle a možno ho použiť na spracovanie malých objemov vzoriek.“ (Gabig-Ciminska a kol., 2014)

Biomolekuly z bunkových tovární na výrobu potravín

Mikrobiálne bunkové továrne predstavujú životaschopnú a účinnú výrobnú metódu, ktorá využíva mikrobiálne organizmy na dosahovanie vysokých výťažkov prirodzených aj neprirodzených metabolitov prostredníctvom metabolického bioinžinierstva mikroorganizmov, ako sú baktérie, kvasinky, huby atď. Enzýmy vo veľkých objemoch sa napríklad vyrábajú pomocou mikroorganizmov, ako sú Aspergillus oryzae, huby a baktérie. Tieto enzýmy vyrábané vo veľkých objemoch sa používajú pri výrobe potravín a nápojov, ako aj v poľnohospodárstve, bioenergetike a pri starostlivosti o domácnosť.
Niektoré baktérie, ako sú Acetobacter xylinum a Gluconacetobacter xylinus, produkujú celulózu počas fermentácie, pri ktorej sa nanovlákna syntetizujú postupom zdola nahor. Bakteriálna celulóza (známa aj ako mikrobiálna celulóza) je chemicky ekvivalentná rastlinnej celulóze, má však vysoký stupeň kryštalinity a vysokú čistotu (neobsahuje lignín, hemicelulózu, pektín ani iné biogénne zložky), ako aj jedinečnú štruktúru trojrozmernej (3D) siete utkanej z celulózových nanovlákien. (porov. Zhong, 2020) V porovnaní s celulózou rastlinného pôvodu je bakteriálna celulóza udržateľnejšia a vyprodukovaná celulóza je čistá, takže nevyžaduje zložité kroky čistenia. Ultrazvukové spracovanie a extrakcia rozpúšťadlom s použitím NaOH alebo SDS (dodecylsíranu sodného) sú veľmi účinné pri izolácii bakteriálnej celulózy z bakteriálnych buniek.

Biomolekuly z bunkových tovární na výrobu liečiv a vakcín

Jedným z najvýznamnejších farmaceutických produktov získavaných z bunkových tovární je ľudský inzulín. Na bioinžiniersku výrobu inzulínu sa používajú prevažne E. coli a Saccharomyces cerevisiae. Keďže biosyntetizované molekuly s nanometrovými rozmermi vykazujú vysokú biokompatibilitu, biologické nanočastice, ako je feritín, sú výhodné pre mnohé aplikácie biologickej výroby. Okrem toho je výroba pomocou metabolicky upravených mikroorganizmov často výrazne účinnejšia z hľadiska dosahovaných výťažkov. Napríklad produkcia kyseliny artemisínovej, resveratrolu a lykopénu sa zvýšila desaťnásobne až niekoľko stonásobne a ich výroba v priemyselnom meradle je už zavedená alebo sa vyvíja. (porov. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Napríklad biomolekuly na báze proteínov s nanometrovými rozmermi a schopnosťou samousporiadania, ako sú feritín a častice podobné vírusom, sú obzvlášť zaujímavé pre vývoj vakcín, pretože napodobňujú veľkosť aj štruktúru patogénov a umožňujú konjugáciu antigénov na svojom povrchu na podporu interakcie s imunitnými bunkami. Takéto molekuly sa exprimujú v takzvaných bunkových továrňach (napr. v upravených kmeňoch E. coli), ktoré produkujú určitú cieľovú molekulu.

Protokol ultrazvukovej lýzy E. coli BL21 na uvoľnenie feritínu

Feritín je proteín, ktorého hlavnou funkciou je ukladanie železa. Feritín vykazuje sľubné možnosti využitia vo forme samousporadúvajúcich sa nanočastíc vo vakcínach, kde sa používa ako nosič na doručovanie vakcín (napr. spike proteínov SARS-Cov-2). Vedecký výskum Sun et al. (2016) ukazuje, že rekombinantný feritín sa môže uvoľniť z Escherichia coli v rozpustnej forme pri nízkych koncentráciách NaCl (≤50 mmol/L). Na expresiu feritínu v E. coli BL21 a jeho uvoľnenie sa úspešne použil nasledujúci protokol. Rekombinantný plazmid pET-28a/ferritin sa transformáciou vniesol do kmeňa E coli BL21 (DE3). Bunky E coli BL21 (DE3) produkujúce feritín sa kultivovali v rastovom médiu LB s 0,5% kanamycínu pri 37°C a pri OD600 0,6 sa indukovali pomocou 0,4% izopropyl-β-D-tiogalaktopyranozidu počas 3 hodín pri 37°C. Výsledná kultúra sa potom zozbierala centrifugáciou pri 8000g počas 10 minút pri 4°C a získal sa pelet. Následne sa pelet resuspendoval v médiu LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% kvasničného extraktu)/lyzačnom pufri (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) a v roztokoch NaCl s rôznymi koncentráciami (0, 50, 100, 170 a 300 mmol/L). Na lýzu bakteriálnych buniek sa použila sonikácia v pulznom režime: napr. pomocou ultrazvukového prístroja UP400St pri 100% amplitúde s pracovným cyklom 5 sekúnd ZAPNUTÉ, 10 sekúnd VYPNUTÉ, počas 40 cyklov) a následne sa vykonala centrifugácia pri 10 000g počas 15 minút pri 4°C. Supernatant a precipitát sa analyzovali elektroforézou v polyakrylamidovom géli s dodecylsíranom sodným (SDS-PAGE). Všetky gély zafarbené dodecylsíranom sodným sa naskenovali skenerom s vysokým rozlíšením. Snímky gélov sa analyzovali pomocou softvéru Magic Chemi 1D. Na dosiahnutie optimálnej zreteľnosti sa proteínové pásy detegovali úpravou parametrov. Údaje pre pásy sa získali z troch technických opakovaní. (porov. Sun et al., 2016)

Ultrazvukové dezintegrátory buniek na priemyselnú lýzu bunkových tovární

Ultrazvuková lýza a extrakcia predstavujú spoľahlivú a pohodlnú metódu uvoľňovania metabolitov z bunkových tovární, čím podporujú účinnú výrobu cieľových molekúl. Ultrazvukové dezintegrátory buniek sú dostupné v laboratórnych až priemyselných veľkostiach a procesy možno škálovať úplne lineárne.
Hielscher Ultrasonics je vaším kompetentným partnerom v oblasti vysokovýkonných ultrazvukových dezintegrátorov a má dlhoročné skúsenosti so zavádzaním ultrazvukových systémov do stolových a priemyselných zariadení.
Pokiaľ ide o sofistikovaný hardvér a softvér, systémy Hielscher Ultrasonics na rozrušovanie buniek spĺňajú všetky požiadavky na optimálne riadenie procesu, jednoduchú obsluhu a používateľskú prívetivosť. Zákazníci a používatelia ultrazvukových prístrojov Hielscher oceňujú, že ultrazvukové dezintegrátory buniek a extraktory Hielscher umožňujú presné monitorovanie a riadenie procesu – prostredníctvom digitálneho dotykového displeja a diaľkového ovládania cez prehliadač. Všetky dôležité údaje o sonikácii (napr. čistá energia, celková energia, amplitúda, trvanie, teplota, tlak) sa automaticky ukladajú ako súbor CSV na integrovanú kartu SD. To pomáha dosahovať reprodukovateľné a opakovateľné výsledky a uľahčuje štandardizáciu procesov, ako aj plnenie požiadaviek aktuálnej správnej výrobnej praxe (cGMP).
Ultrazvukové procesory Hielscher sú samozrejme skonštruované na prevádzku 24/7 pri plnom zaťažení, a preto ich možno spoľahlivo prevádzkovať v podmienkach priemyselnej výroby. Vďaka vysokej odolnosti a nízkym nárokom na údržbu sú prestoje ultrazvukových zariadení skutočne minimálne. Funkcie CIP (čistenie na mieste) a SIP (sterilizácia na mieste) minimalizujú prácne čistenie, najmä preto, že všetky časti prichádzajúce do kontaktu s kvapalinou majú hladké kovové povrchy (bez skrytých otvorov alebo dýz).

Nasledujúca tabuľka poskytuje predstavu o približnej spracovateľskej kapacite našich ultrazvukových prístrojov: