Ultrazvuková lýza bioinžinierskych buniek v priemyselnej výrobe

Bioinžinierske druhy baktérií, ako je E. coli, ako aj geneticky modifikované typy cicavcov a rastlinných buniek, sa široko používajú v biotechnológiách na expresiu molekúl. Na uvoľnenie týchto syntetizovaných biomolekúl je potrebná spoľahlivá technika narušenia buniek. Vysokovýkonná ultrazvuková analýza je osvedčená metóda na efektívnu a spoľahlivú lýzu buniek – Ľahko škálovateľné na veľké výkony. Spoločnosť Hielscher Ultrasonics vám ponúka vysokovýkonné ultrazvukové zariadenia na efektívnu lýzu buniek s cieľom vyrobiť veľké objemy vysokokvalitných biomolekúl.

Extrakcia molekúl z bunkových tovární

Na výrobu širokej škály biomolekúl možno ako továrne na mikrobiálne bunky použiť rôzne upravené mikróby a rastlinné bunky, vrátane Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana a riasy a mnoho ďalších. Tieto bunkové továrne môžu vyrábať bielkoviny, lipidy, biochemikálie, polyméry, biopalivá a oleochemikálie, ktoré sa používajú ako potraviny alebo suroviny pre priemyselné aplikácie. Bunky používané ako bunkové továrne sa kultivujú v uzavretých bioreaktoroch, kde môžu dosiahnuť vysokú účinnosť, špecifickosť a nízke energetické nároky.
Na izoláciu cieľových molekúl z bioinžinierskych bunkových kultúr musia byť bunky narušené, aby sa uvoľnil intracelulárny materiál. Ultrazvukové disruptory buniek sú dobre zavedené ako vysoko spoľahlivá a účinná technika na rozpad buniek a uvoľňovanie zlúčenín.

Továrne na mikrobiálne bunky sú metabolicky upravené bunky používané na syntézu rôznych cenných zlúčenín. Ultrazvukové narušenie buniek je účinná a spoľahlivá metóda na uvoľnenie cenných zlúčenín z vnútra bunky.
štúdia a grafika: ©Villaverde, 2010.

Výhody ultrazvukových disruptorov buniek

Ako netepelná, mierna, ale vysoko účinná technológia sa ultrazvukové disruptory používajú v laboratóriu a priemysle na lýzu buniek a na výrobu vysokokvalitných extraktov, napr. používaných na izoláciu molekúl z bunkových tovární.

Výkonový ultrazvuk pre efektívne narušenie tovární na mikrobiálne bunky

Mechanizmus a účinky ultrazvukových disruptorov buniek:
Ultrazvukové narušenie buniek využívalo silu ultrazvukových vĺn. Ultrazvukový homogenizátor / disruptor buniek je vybavený sondou (alias sonotrodou) vyrobenou zo zliatiny titánu, ktorá osciluje na vysokej frekvencii cca. 20 kHz. To znamená, že ultrazvuková sonda spája 20 000 vibrácií za sekundu do sonikovanej kvapaliny. Ultrazvukové vlny spojené s kvapalinou sa vyznačujú striedavými vysokotlakovými / nízkotlakovými cyklami. Počas nízkotlakového cyklu sa kvapalina rozpína a vznikajú nepatrné vákuové bubliny. Tieto veľmi malé bubliny rastú počas niekoľkých striedavých tlakových cyklov, až kým nedokážu absorbovať žiadnu ďalšiu energiu. V tomto bode sa kavitačné bubliny prudko zrútia a lokálne vytvárajú mimoriadne energeticky husté prostredie. Tento jav je známy ako akustická kavitácia a je charakterizovaný lokálne veľmi vysokými teplotami, veľmi vysokými tlakmi a šmykovými silami. Tieto šmykové napätia účinne rozbíjajú bunkové steny a zvyšujú prenos hmoty medzi vnútrom bunky a okolitým rozpúšťadlom. Ako čisto mechanická technika sa široko používajú ultrazvukom generované šmykové sily a odporúčaný postup na narušenie bakteriálnych buniek, ako aj na izoláciu proteínov. Ako jednoduchá a rýchla metóda narušenia buniek je sonikácia ideálna na izoláciu malých, stredných a veľkých objemov. Digitálne ultrazvukové prístroje Hielscher sú vybavené prehľadnou ponukou nastavení pre presné ovládanie sonikácie. Všetky údaje o ultrazvuku sa automaticky ukladajú na vstavanú SD kartu a sú jednoducho prístupné. Sofistikované možnosti odvodu tepla, ako je externé chladenie, sonikácia v pulznom režime atď., počas procesu ultrazvukového rozpadu, zabezpečujú udržanie ideálnej procesnej teploty a tým aj neporušenosti extrahovaných zlúčenín citlivých na teplo.

Výskum zdôrazňuje silné stránky ultrazvukového narušenia a extrakcie buniek

Prof. Chemat a kol. (2017) vo svojej štúdii pokračujú, že "extrakcia s ultrazvukom je zelenou a ekonomicky životaschopnou alternatívou ku konvenčným technikám pre potraviny a prírodné produkty. Hlavnými výhodami sú skrátenie času extrakcie a spracovania, množstvo použitej energie a rozpúšťadiel, jednotkové operácie a CO₂ emisie."
Gabig-Ciminska et al. (2014) použili vysokotlakový homogenizátor a ultrazvukový bunkový dsintegrátor vo svojej štúdii na lýzu spór s cieľom uvoľniť DNA. Porovnaním oboch metód narušenia buniek výskumný tím dospel k záveru, že pokiaľ ide o lýzu buniek pre DNA spór, "analýza bola vykonaná použitím bunkových lyzátov z vysokotlakovej homogenizácie. Potom sme si uvedomili, že narušenie ultrazvukových buniek má na tento účel vynikajúce výhody. Je pomerne rýchly a dá sa spracovať na malé objemy vzoriek." (Gabig-Ciminska a kol., 2014)

Biomolekuly z bunkových tovární na výrobu potravín

Továrne na mikrobiálne bunky sú životaschopnou a efektívnou metodikou výroby využívajúcou mikrobiálne organizmy na výrobu vysokých výnosov natívnych a nenatívnych metabolitov metabolickým bioinžinierstvom mikrobiálnych mikroorganizmov, ako sú baktérie, kvasinky, huby atď. Hromadné enzýmy sa napríklad vyrábajú pomocou mikroorganizmov ako Aspergillus oryzae, huby a baktérie. Tieto hromadné enzýmy sa používajú na výrobu potravín a nápojov, ako aj v poľnohospodárstve, bioenergii a starostlivosti o domácnosť.
Niektoré baktérie, ako sú Acetobacter xylinum a Gluconacetobacter xylinus, produkujú celulózu počas fermentačného procesu, kde sa nanovlákna syntetizujú v procese zdola nahor. Bakteriálna celulóza (tiež známa ako mikrobiálna celulóza) je chemicky ekvivalentná rastlinnej celulóze, ale má vysoký stupeň kryštalinity a vysokej čistoty (bez lignínu, hemicelulózy, pektínu a iných biogénnych zložiek), ako aj jedinečnú štruktúru celulózovej nanovlákien tkanej trojrozmernej (3D) sieťovanej siete. (porovnaj Zhong, 2020) V porovnaní s celulózou rastlinného pôvodu je bakteriálna celulóza udržateľnejšia a vyrobená celulóza je čistá a nevyžaduje zložité čistiace kroky. Ultrazvuk a extrakcia rozpúšťadlom pomocou NaOH alebo SDS (dodecylsulfát sodný) sú veľmi účinné na izoláciu bakteriálnej celulózy z bakteriálnych buniek.

Biomolekuly z bunkových tovární na výrobu farmaceutických výrobkov a vakcín

Jedným z najvýznamnejších farmaceutických produktov pochádzajúcich z bunkových tovární je ľudský inzulín. Na bioinžiniersku výrobu inzulínu sa používajú prevažne E. coli a Saccharomyces cerevisiae. Keďže biosyntetizované molekuly nanoveľkosti ponúkajú vysokú biokompatibilitu, biologické nanočastice, ako je feritín, sú výhodné pre mnohé biovýrobné aplikácie. Okrem toho je produkcia metabolicky upravených mikróbov často výrazne účinnejšia pri získaných výťažkoch. Napríklad výroba kyseliny artemisínovej, resveratrolu a lykopénu sa zvýšila desaťnásobne až niekoľkostonásobne a je už zavedená alebo sa vyvíja na výrobu v priemyselnom meradle. (porovnaj Liu a kol.; Mikrob. Bunkový fakt. 2017)
Napríklad biomolekuly nanoveľkosti na báze proteínov so samoorganizujúcimi vlastnosťami, ako je feritín a častice podobné vírusom, sú obzvlášť zaujímavé pre vývoj vakcín, pretože napodobňujú veľkosť aj štruktúru patogénov a sú prístupné povrchovej konjugácii antigénov na podporu interakcie s imunitnými bunkami. Takéto molekuly sú exprimované v takzvaných bunkových továrňach (napr. upravené kmene E. coli), ktoré produkujú určitú cieľovú molekulu.

Protokol pre ultrazvukovú lýzu a E. coli BL21 na uvoľňovanie feritínu

Feritín je proteín, ktorého primárnou funkciou je ukladanie železa. Feritín vykazuje sľubné schopnosti ako samoorganizujúce sa nanočastice vo vakcínach, kde sa používa ako nosič vakcín (napr. proteíny hrotu SARS-Cov-2). Vedecký výskum Sun et. al. (2016) ukazuje, že rekombinantný feritín sa môže uvoľňovať ako rozpustná forma z Escherichia coli pri nízkych koncentráciách NaCl (≤50 mmol/l). Na expresiu feritínu v E. coli BL21 a na uvoľnenie ferrtínu bol úspešne aplikovaný nasledujúci protokol. Rekombinantný plazmid pET-28a/feritínu bol transformovaný na kmeň E. coli BL21 (DE3). Bunky feritínu E coli BL21 (DE3) boli kultivované v rastovom médiu LB s 0,5 % kanamycínom pri 37 °C a indukované pri OD600 0,6 s 0,4 % izopropyl-β-D-tiogalaktopiranozidem počas 3 hodín pri 37 °C. Konečná kultúra sa potom zozbierala centrifugáciou pri 8000 g počas 10 minút pri 4 °C a peleta sa zozbierala. Potom bola peleta resuspendovaná v médiu LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% kvasnicový extrakt)/lýzny pufr (20 mmol/l Tris, 50 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, pH 7,6) a v rôznych koncentráciách roztoku NaCl (0, 50, 100, 170 a 300 mmol/l). Na lýzu bakteriálnych buniek sa aplikovala sonikácia v pulznom režime: napr. pomocou Ultrazvuk UP400St pri 100 % amplitúde s pracovným cyklom 5 sekúnd ZAPNUTÉ, 10 sekúnd VYPNUTÉ, počas 40 cyklov) a potom odstredené pri 10 000 g počas 15 minút pri 4 °C. Supernatant a zrazenina boli analyzované polyakrylamidovou gélovou elektroforézou dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). Všetky gély zafarbené dodecylsulfanom sodným boli skenované skenerom s vysokým rozlíšením. Gélové obrázky boli analyzované pomocou softvéru Magic Chemi 1D. Pre optimálnu prehľadnosť boli proteínové pásy zistené úpravou parametrov. Údaje pre pásma boli generované z technických trojíc. (porovnaj Sun a kol., 2016)

Ultrazvukové disruptory buniek pre priemyselnú lýzu bunkových tovární

Ultrazvuková lýza a extrakcia je spoľahlivá a pohodlná metóda na uvoľňovanie metabolitov z bunkových tovární, čím pomáha účinnej produkcii cieľových molekúl. Ultrazvukové disruptory buniek sú k dispozícii od laboratórnych až po priemyselné veľkosti a procesy je možné škálovať úplne lineárne.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics je vaším kompetentným partnerom pre vysokovýkonné ultrazvukové disruptory a má dlhoročné skúsenosti v oblasti implantácie ultrazvukových systémov v stolovom a priemyselnom prostredí.
Pokiaľ ide o sofistikovaný hardvér a softvér, systémy na narušenie buniek Hielscher Ultrasonics spĺňajú všetky požiadavky na optimálne riadenie procesu, jednoduchú obsluhu a užívateľskú prívetivosť. Zákazníci a používatelia ultrazvukových prístrojov Hielscher oceňujú výhodu, ktorú ultrazvukové disruptory a extraktory Hielscher umožňujú presné monitorovanie a riadenie procesu – prostredníctvom digitálneho dotykového displeja a diaľkového ovládania prehliadača. Všetky dôležité údaje o sonikácii (napr. čistá energia, celková energia, amplitúda, trvanie, teplota, tlak) sa automaticky ukladajú ako súbor CSV na integrovanú SD kartu. To pomáha získať reprodukovateľné a opakovateľné výsledky a uľahčuje štandardizáciu procesov, ako aj dodržiavanie správnej výrobnej praxe (cGMP).
Ultrazvukové procesory Hielscher sú samozrejme skonštruované pre prevádzku 24 hodín denne, 7 dní v týždni pri plnom zaťažení, a preto ich možno spoľahlivo prevádzkovať v priemyselnej výrobe. Vďaka vysokej robustnosti a nízkej údržbe sú prestoje ultrazvukového zariadenia skutočne nízke. Funkcie CIP (čistenie na mieste) a SIP (sterilizácia na mieste) minimalizujú namáhavé čistenie, najmä preto, že všetky mokré časti sú hladké kovové povrchy (žiadne skryté otvory alebo trysky).

Nasledujúca tabuľka vám poskytuje približnú kapacitu spracovania našich ultrazvukových prístrojov: