Biosyntetická produkcia oligosacharidov ľudského mlieka

Biosyntéza oligosacharidov ľudského mlieka (HMO) prostredníctvom fermentácie alebo enzymatických reakcií je zložitý, náročný proces, ktorý má často nízku výťažnosť. Pôsobenie ultrazvuku zvyšuje prenos hmoty medzi substrátom a bunkovými továrňami a stimuluje rast a metabolizmus buniek. Sonikácia tak zintenzívňuje fermentáciu a biochemické procesy, čo vedie k rýchlejšej a efektívnejšej produkcii HMO.

Oligosacharidy ľudského mlieka

Oligosacharidy ľudského mlieka (HMO), známe aj ako glykány ľudského mlieka, sú molekuly cukrov patriace do skupiny oligosacharidov. Medzi významné príklady HMO patria 2’-fukozyl laktóza (2′-FL), lakto-N-neotetraóza (LNnT), 3’-galaktozyl laktóza (3′-GL) a difukozyl laktóza (DFL).
Hoci ľudské materské mlieko obsahuje viac ako 150 rôznych štruktúr HMO, v súčasnosti sa na komerčnej úrovni vyrábajú a ako výživové prísady v dojčenskej výžive používajú len 2′-fukozyl laktóza (2′-FL) a lakto-N-neotetraóza (LNnT).
Oligosacharidy ľudského mlieka (HMO) sú známe svojím významom vo výžive dojčiat. Oligosacharidy ľudského mlieka sú jedinečným typom živín, ktoré v čreve dojčaťa pôsobia ako prebiotiká, antiadhezívne antimikrobiálne látky a imunomodulátory a významne prispievajú k vývoju mozgu. HMO sa nachádzajú výlučne v ľudskom materskom mlieku; mlieka iných cicavcov (napr. kráv, kôz, oviec, tiav atď.) neobsahujú tieto špecifické formy oligosacharidov.
Oligosacharidy ľudského mlieka sú treťou najviac zastúpenou pevnou zložkou ľudského mlieka a vo vode môžu byť prítomné v rozpustenej, emulgovanej alebo suspendovanej forme. Laktóza a mastné kyseliny sú najviac zastúpenými pevnými látkami v ľudskom mlieku. HMO sú prítomné v koncentrácii 0,35–0,88 uncí (9,9–24,9 g)/ L. Známych je približne 200 štruktúrne odlišných oligosacharidov ľudského mlieka. Dominantným oligosacharidom u 80% všetkých žien je 2′-fukozyl laktóza, ktorá je v ľudskom materskom mlieku prítomná v koncentrácii približne 2,5 g/ L.
Keďže HMO sa netrávia, neprispievajú ku kalorickému príjmu z potravy. Ako nestráviteľné sacharidy fungujú ako prebiotiká a sú selektívne fermentované žiaducou črevnou mikroflórou, najmä bifidobaktériami.

Biosyntéza oligosacharidov ľudského mlieka

Bunkové továrne a enzymatické / chemoenzymatické systémy sú súčasné technológie používané na syntézu HMO. Pri produkcii HMO v priemyselnom meradle sú fermentácia pomocou mikrobiálnych bunkových tovární, biochemická syntéza a rôzne enzymatické reakcie uskutočniteľnými spôsobmi biologickej produkcie HMO. Z ekonomických dôvodov je biosyntéza prostredníctvom mikrobiálnych bunkových tovární v súčasnosti jedinou technikou používanou pri priemyselnej produkcii HMO.

Fermentácia HMO pomocou mikrobiálnych bunkových tovární

E.coli, Saccharomyces cerevisiae a Lactococcus lactis sú bežne používané bunkové továrne na biologickú produkciu biologických molekúl, ako sú HMO. Fermentácia je biochemický proces, pri ktorom mikroorganizmy premieňajú substrát na cieľové biologické molekuly. Mikrobiálne bunkové továrne využívajú ako substrát jednoduché cukry, ktoré premieňajú na HMO. Keďže jednoduché cukry (napr. laktóza) sú dostupným a lacným substrátom, proces biosyntézy zostáva nákladovo efektívny.
Rýchlosť rastu a biokonverzie ovplyvňuje najmä prenos hmoty v podobe živín (substrátu) k mikroorganizmom. Rýchlosť prenosu hmoty je hlavným faktorom, ktorý ovplyvňuje syntézu produktu počas fermentácie. Je dobre známe, že pôsobenie ultrazvuku podporuje prenos hmoty.
Počas fermentácie sa podmienky v bioreaktore musia neustále monitorovať a regulovať, aby bunky mohli rásť čo najrýchlejšie a následne produkovať cieľové biomolekuly (napr. oligosacharidy, ako sú HMO; inzulín; rekombinantné proteíny). Teoreticky sa tvorba produktu začína hneď, ako bunková kultúra začne rásť. Najmä pri geneticky modifikovaných bunkách, ako sú geneticky upravené mikroorganizmy, sa však zvyčajne indukuje neskôr pridaním chemickej látky do substrátu, ktorá zvyšuje expresiu cieľovej biomolekuly. Ultrazvukové bioreaktory (sonobioreaktory) možno presne riadiť a umožňujú špecifickú stimuláciu mikroorganizmov. Výsledkom je zrýchlená biosyntéza a vyššie výťažky.
Ultrazvuková lýza a extrakcia: Fermentáciu komplexných HMO môžu obmedzovať nízke fermentačné titre a produkty zostávajúce vo vnútri buniek. Ultrazvuková lýza a extrakcia sa používajú na uvoľnenie vnútrobunkového materiálu pred purifikáciou a následnými procesmi spracovania.

Fermentácia podporovaná ultrazvukom

Rýchlosť rastu mikroorganizmov, ako sú Escherichia coli, geneticky upravené E.coli, Saccharomyces cerevisiae a Lactococcus lactis, možno zvýšiť zvýšením rýchlosti prenosu hmoty a priepustnosti bunkovej steny pomocou riadeného pôsobenia nízkofrekvenčného ultrazvuku. Pôsobenie ultrazvuku ako šetrná, netepelná technika spracovania vnáša do fermentačnej pôdy výlučne mechanické sily.
Akustická kavitácia: Princíp fungovania sonikácie je založený na akustickej kavitácii. Ultrazvuková sonda (sonotróda) prenáša nízkofrekvenčné ultrazvukové vlny do média. Ultrazvukové vlny prechádzajú kvapalinou a vytvárajú striedajúce sa cykly vysokého tlaku (stláčanie) / nízkeho tlaku (zrieďovanie). Stláčaním a rozpínaním kvapaliny v striedajúcich sa cykloch vznikajú nepatrné vákuové bubliny. Tieto malé vákuové bubliny rastú počas niekoľkých cyklov, až kým nedosiahnu veľkosť, pri ktorej už nedokážu absorbovať ďalšiu energiu. V tomto bode maximálneho rastu vákuová bublina prudko imploduje a vytvára lokálne extrémne podmienky známe ako jav kavitácie. V kavitačnom „horúcom mieste“ možno pozorovať vysoké rozdiely tlaku a teploty a intenzívne šmykové sily s prúdmi kvapaliny s rýchlosťou až 280m/sec. Tieto kavitačné účinky zabezpečujú dôkladný prenos hmoty a sonoporáciu (perforáciu bunkových stien a bunkových membrán). Živiny zo substrátu sú unášané k živým celým bunkám a do ich vnútra, takže bunkové továrne sú optimálne zásobované živinami a zvyšuje sa rýchlosť rastu aj premeny. Ultrazvukové bioreaktory predstavujú jednoduchý, no vysoko účinný spôsob spracovania biomasy v procese biosyntézy v jednej nádobe.
Je dobre známe, že presne riadená, šetrná sonikácia zintenzívňuje fermentačné procesy.
Sonikácia zlepšuje „produktivitu mnohých bioprocesov zahŕňajúcich živé bunky prostredníctvom zlepšeného príjmu substrátu, zvýšenej produkcie alebo rastu vďaka zvýšeniu pórovitosti buniek a potenciálne aj zvýšeného uvoľňovania bunkových zložiek.“ (Naveena et al. 2015)
Prečítajte si viac o fermentácii podporovanej ultrazvukom!

Naveena a kol. (2015) zistili, že ultrazvuková intenzifikácia ponúka pri biologickom spracovaní niekoľko výhod vrátane nízkych prevádzkových nákladov v porovnaní s inými možnosťami zintenzívnenia procesu, jednoduchej obsluhy a nízkych požiadaviek na príkon.

Vysokovýkonné ultrazvukové fermentačné reaktory

Fermentačné procesy zahŕňajú živé mikroorganizmy, ako sú baktérie alebo kvasinky, ktoré fungujú ako bunkové továrne. Keďže sa sonikácia používa na podporu prenosu hmoty a zvýšenie rýchlosti rastu a konverzie mikroorganizmov, je nevyhnutné presne regulovať intenzitu ultrazvuku, aby sa zabránilo zničeniu bunkových tovární.
Hielscher Ultrasonics sa špecializuje na návrh, výrobu a distribúciu vysokovýkonných ultrazvukových zariadení, ktoré možno presne regulovať a monitorovať s cieľom zabezpečiť vynikajúce výťažky fermentácie.

Riadenie procesu je nevyhnutné nielen na dosiahnutie vysokých výťažkov a vynikajúcej kvality, ale umožňuje aj opakovať a reprodukovať výsledky. Najmä pri stimulácii bunkových tovární je na dosiahnutie vysokých výťažkov a zabránenie degradácii buniek nevyhnutné prispôsobiť parametre sonikácie konkrétnym bunkám. Preto sú všetky digitálne modely ultrazvukových zariadení Hielscher vybavené inteligentným softvérom, ktorý umožňuje nastavovať, monitorovať a upravovať parametre sonikácie. Parametre ultrazvukového procesu, ako sú amplitúda, teplota, tlak, trvanie sonikácie, pracovné cykly a prívod energie, sú nevyhnutné na podporu produkcie HMO fermentáciou.
Inteligentný softvér ultrazvukových zariadení Hielscher automaticky zaznamenáva všetky dôležité parametre procesu na integrovanú SD kartu. Automatický záznam údajov o procese sonikácie je základom štandardizácie procesu a reprodukovateľnosti / opakovateľnosti, ktoré sa vyžadujú v rámci správnej výrobnej praxe (GMP).

Ultrazvukové reaktory na fermentáciu

Hielscher ponúka ultrazvukové sondy rôznych veľkostí, dĺžok a geometrií, ktoré možno použiť na dávkové aj kontinuálne prietokové spracovanie. Ultrazvukové reaktory, známe aj ako sonobioreaktory, sú dostupné pre akýkoľvek objem a pokrývajú ultrazvukové biologické spracovanie od malých laboratórnych vzoriek až po poloprevádzkovú a plne komerčnú výrobu.
Je dobre známe, že umiestnenie ultrazvukovej sonotródy v reakčnej nádobe ovplyvňuje rozloženie kavitácie a mikroprúdenia v médiu. Sonotróda a ultrazvukový reaktor by sa mali zvoliť podľa spracovávaného objemu bunkového kultivačného média. Hoci sa sonikácia môže vykonávať v dávkovom aj kontinuálnom režime, pri veľkých výrobných objemoch sa odporúča použitie kontinuálneho prietokového zariadenia. Pri prechode ultrazvukovou prietokovou komorou je celé bunkové kultivačné médium vystavené presne rovnakému pôsobeniu sonikácie, čo zabezpečuje najúčinnejšie spracovanie. Široký sortiment ultrazvukových sond a reaktorov s prietokovou komorou od Hielscher Ultrasonics umožňuje zostaviť ideálnu zostavu na ultrazvukové biologické spracovanie.

Hielscher Ultrasonics – od laboratória cez poloprevádzku až po výrobu

Hielscher Ultrasonics pokrýva celé spektrum ultrazvukových zariadení a ponúka kompaktné ručné ultrazvukové homogenizátory na prípravu vzoriek, stolové a poloprevádzkové systémy, ako aj výkonné priemyselné ultrazvukové jednotky, ktoré bez problémov spracujú náklady celých nákladných vozidiel za hodinu. Vďaka všestrannosti a flexibilným možnostiam inštalácie a montáže možno ultrazvukové zariadenia Hielscher ľahko integrovať do všetkých druhov vsádzkových reaktorov, vsádzkových systémov s prítokom substrátu alebo kontinuálnych prietokových zostáv.
Rôzne príslušenstvo, ako aj diely vyrobené na mieru umožňujú ideálne prispôsobiť vašu ultrazvukovú zostavu požiadavkám vášho procesu.
Ultrazvukové procesory Hielscher sú skonštruované na nepretržitú prevádzku 24/7 pri plnom zaťažení a intenzívnom používaní v náročných podmienkach, sú spoľahlivé a vyžadujú len nenáročnú údržbu.
Nasledujúca tabuľka poskytuje prehľad o približnej spracovateľskej kapacite našich ultrazvukových zariadení: