Biosyntetická výroba oligosacharidov ľudského mlieka
Biosyntéza oligosacharidov ľudského mlieka (HMO) prostredníctvom fermentácie alebo enzymatických reakcií je zložitý, náročný a často nízkovýnosný proces. Ultrazvuk zvyšuje prenos hmoty medzi substrátom a bunkovými továrňami a stimuluje rast a metabolizmus buniek. Tým sonikácia zintenzívňuje fermentáciu a biochemické procesy, čo vedie k zrýchlenej a efektívnejšej produkcii HMO.
oligosacharidy ľudského mlieka
Oligosacharidy ľudského mlieka (HMO), tiež známe ako glykány ľudského mlieka, sú molekuly cukru, ktoré sú súčasťou skupiny oligosacharidov. Medzi významné príklady HMO patrí 2'-fukozyllaktóza (2′-FL), lakto-N-neotetraóza (LNnT), 3'-galaktozyllaktóza (3′-GL) a difukozyllaktózu (DFL).
Zatiaľ čo ľudské materské mlieko sa skladá z viac ako 150 rôznych štruktúr HMO, iba 2′-fukozyllaktóza (2′-FL) a lakto-N-neotetraóza (LNnT) sa v súčasnosti vyrábajú na komerčnej úrovni a používajú sa ako nutričné prísady v dojčenskej výžive.
Oligosacharidy ľudského mlieka (HMO) sú známe svojím významom vo výžive detí. Oligosacharidy ľudského mlieka sú jedinečným typom živín, ktoré pôsobia ako prebiotiká, antiadhézne antimikrobiálne látky a imunomodulátory v črevách dieťaťa a významne prispievajú k vývoju mozgu. HMO sa nachádzajú výlučne v ľudskom materskom mlieku; Iné mlieka cicavcov (napr. kravské, kozie, ovčie, ťavovité atď.) nemajú túto špecifickú formu oligosacharidov.
Oligosacharidy ľudského mlieka sú treťou najrozšírenejšou tuhou zložkou v ľudskom mlieku, ktorá môže byť prítomná vo vode v rozpustenej alebo emulgovanej alebo suspendovanej forme. Laktóza a mastné kyseliny sú najrozšírenejšie pevné látky nachádzajúce sa v ľudskom mlieku. HMO sú prítomné v koncentrácii 0,35–0,88 unce (9,9–24,9 g)/l. Je známych približne 200 štrukturálne odlišných oligosacharidov ľudského mlieka. Dominantný oligosacharid u 80 % všetkých žien je 2′-fukozyllaktóza, ktorá je prítomná v ľudskom materskom mlieku v koncentrácii približne 2,5 g/l.
Keďže HMO nie sú trávené, neprispievajú kaloricky k výžive. Keďže sú nestráviteľné sacharidy, fungujú ako prebiotiká a sú selektívne fermentované žiaducou črevnou mikroflórou, najmä bifidobaktériami.
- podporovať vývoj dojčiat
- sú dôležité pre vývoj mozgu
- má protizápalové a
- antiadhézne účinky v gastrointestinálnom trakte
- podporuje imunitný systém u dospelých
Tá ultrazvukový procesor UIP2000hdT zvyšuje prenos hmoty a aktivuje bunkové továrne pre vyššie výťažky biosyntetizovaných biologických molekúl, ako sú HMO
Biosyntéza oligosacharidov ľudského mlieka
Bunkové továrne a enzymatické / chemo-enzymatické systémy sú súčasné technológie používané na syntézu HMO. Pre výrobu HMO v priemyselnom meradle sú fermentácia tovární na mikrobiálne bunky, biochemická syntéza a rôzne enzymatické reakcie uskutočniteľnými spôsobmi biovýroby HMO. Z ekonomických dôvodov je biosyntéza prostredníctvom tovární na mikrobiálne bunky v súčasnosti jedinou technikou používanou na úrovni priemyselnej výroby HMO.
Fermentácia HMO pomocou tovární na mikrobiálne bunky
E.coli, Saccharomyces cerevisiae a Lactococcus lactis sú bežne používané bunkové továrne používané na biovýrobu biologických molekúl, ako sú HMO. Fermentácia je biochemický proces využívajúci mikroorganizmy na premenu substrátu na cielené biologické molekuly. Továrne na mikrobiálne bunky používajú ako substrát jednoduché cukry, ktoré premieňajú na HMO. Keďže jednoduché cukry (napr. laktóza) sú hojným a lacným substrátom, proces biosyntézy je nákladovo efektívny.
Rast a rýchlosť biokonverzie sú ovplyvnené najmä prenosom hmoty živín (substrátu) na mikroorganizmy. Rýchlosť prenosu hmoty je hlavným faktorom, ktorý ovplyvňuje syntézu produktu počas fermentácie. Ultrazvuk je dobre známy tým, že podporuje prenos hmoty.
Počas fermentácie je potrebné neustále monitorovať a regulovať podmienky v bioreaktore, aby bunky mohli čo najrýchlejšie rásť, aby sa potom mohli produkovať cieľové biomolekuly (napr. oligosacharidy, ako sú HMO, inzulín, rekombinantné proteíny). Teoreticky sa tvorba produktu začína hneď, ako bunková kultúra začne rásť. Avšak najmä v geneticky modifikovaných bunkách, ako sú upravené mikroorganizmy, sa zvyčajne vyvolá neskôr pridaním chemickej látky do substrátu, ktorá zvyšuje expresiu cieľovej biomolekuly. Ultrazvukové bioreaktory (sono-bioreaktor) je možné presne riadiť a umožňujú špecifickú stimuláciu mikróbov. To má za následok zrýchlenú biosyntézu a vyššie výnosy.
Ultrazvuková lýza a extrakcia: Fermentácia komplexných HMO môže byť obmedzená nízkymi fermentačnými titrami a produktmi zostávajúcimi intracelulárnymi. Ultrazvuková lýza a extrakcia sa používa na uvoľnenie intracelulárneho materiálu pred čistením a následnými procesmi.
Ultrazvukom podporovaná fermentácia
Rýchlosť rastu mikróbov, ako sú Escherichia coli, umelé E.coli, Saccharomyces cerevisiae a Lactococcus lactis, sa môže urýchliť zvýšením rýchlosti prenosu hmoty a priepustnosti bunkovej steny aplikáciou riadeného nízkofrekvenčného ultrazvuku. Ako mierna, netepelná technika spracovania aplikuje ultrazvuk do fermentačného vývaru čisto mechanické sily.
Akustická kavitácia: Princíp činnosti sonikácie je založený na akustickej kavitácii. Ultrazvuková sonda (sonotroda) spája nízkofrekvenčné ultrazvukové vlny do média. Ultrazvukové vlny prechádzajú kvapalinou a vytvárajú striedavé vysokotlakové (kompresné) / nízkotlakové (zriedené) cykly. Stláčaním a naťahovaním kvapaliny v striedavých cykloch vznikajú nepatrné vákuové bubliny. Tieto malé vákuové bubliny rastú počas niekoľkých cyklov, kým nedosiahnu veľkosť, pri ktorej nemôžu absorbovať žiadnu ďalšiu energiu. V tomto bode maximálneho rastu vákuová bublina prudko imploduje a vytvára lokálne extrémne podmienky, známe ako fenomén kavitácie. V kavitačnom "horúcom mieste" možno pozorovať vysoké tlakové a teplotné rozdiely a intenzívne šmykové sily s prúdmi kvapaliny až 280 m/s. Týmito kavitačnými účinkami sa dosiahne dôkladný prenos hmoty a sonoporácia (perforácia bunkových stien a bunkových membrán). Živiny substrátu sa dopĺňajú do a do živých celých buniek, takže bunkové továrne sú optimálne vyživované a rast a rýchlosť konverzie sa urýchľujú. Ultrazvukové bioreaktory sú jednoduchou, ale vysoko účinnou stratégiou na spracovanie biomasy v procese biosyntézy v jednom hrnci.
Je dobre známe, že presne kontrolovaná, mierna sonikácia zintenzívňuje fermentačné procesy.
Sonikácia zlepšuje "produktivitu mnohých bioprocesov zahŕňajúcich živé bunky prostredníctvom zvýšenia absorpcie substrátu, zvýšenej produkcie alebo rastu zvýšením pórovitosti buniek a potenciálne zvýšeným uvoľňovaním bunkových zložiek." (Naveena a kol. 2015)
Prečítajte si viac o ultrazvukom asistovanej fermentácii!
- Zvýšený výnos
- Zrýchlená fermentácia
- Bunkovo špecifická stimulácia
- Zvýšená absorpcia substrátu
- Zvýšená pórovitosť buniek
- Jednoduchá obsluha
- Bezpečný
- Jednoduchá dodatočná montáž
- Lineárne škálovanie
- Dávkové alebo individuálne spracovanie
- Rýchla návratnosť investícií
Naveena et al. (2015) zistili, že ultrazvuková intenzifikácia ponúka niekoľko výhod počas biologického spracovania, vrátane nízkych prevádzkových nákladov v porovnaní s inými vylepšenými možnosťami liečby, jednoduchosti obsluhy a skromných požiadaviek na energiu.
The MultiSonoReactor MSR-4 je priemyselný inline homogenizátor vhodný na zvýšenú biosyntézu oligosacharidov ľudského mlieka (HMO).
Vysokovýkonné ultrazvukové fermentačné reaktory
Fermentačné procesy zahŕňajú živé mikroorganizmy, ako sú baktérie alebo kvasinky, ktoré fungujú ako bunkové továrne. Zatiaľ čo sonikácia sa používa na podporu prenosu hmoty a zvýšenie rastu a rýchlosti premeny mikroorganizmov, je dôležité presne kontrolovať intenzitu ultrazvuku, aby sa zabránilo zničeniu bunkových tovární.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics sa špecializuje na navrhovanie, výrobu a distribúciu vysokovýkonných ultrazvukových prístrojov, ktoré je možné presne kontrolovať a monitorovať, aby sa zabezpečili vynikajúce výťažky fermentácie.
Riadenie procesu je nevyhnutné nielen pre vysoké výnosy a vynikajúcu kvalitu, ale umožňuje opakovať a reprodukovať výsledky. Najmä pokiaľ ide o stimuláciu bunkových tovární, je na dosiahnutie vysokých výnosov a zabránenie degradácii buniek nevyhnutná adaptácia parametrov sonikácie špecifická pre bunky. Preto sú všetky digitálne modely ultrazvukových prístrojov Hielscher vybavené inteligentným softvérom, ktorý umožňuje nastavovať, monitorovať a revidovať parametre sonikácie. Parametre ultrazvukového procesu, ako je amplitúda, teplota, tlak, trvanie sonikácie, pracovné cykly a energetický vstup, sú nevyhnutné na podporu výroby HMO prostredníctvom fermentácie.
Inteligentný softvér ultrazvuku Hielscher automaticky zaznamenáva všetky dôležité procesné parametre na integrovanú SD kartu. Automatické zaznamenávanie údajov o procese sonikácie je základom pre štandardizáciu procesov a reprodukovateľnosť / opakovateľnosť, ktoré sú potrebné pre správnu výrobnú prax (GMP).
Ultrazvukové rektory na fermentáciu
Spoločnosť Hielscher ponúka ultrazvukové sondy rôznych veľkostí, dĺžok a geometrií, ktoré možno použiť na dávkové aj kontinuálne prietokové ošetrenie. Ultrazvukové reaktory, tiež známe ako sono-bioreaktory, sú k dispozícii pre akýkoľvek objem pokrývajúci ultrazvukové biologické spracovanie od malých laboratórnych vzoriek až po pilotnú a plne komerčnú úroveň výroby.
Je dobre známe, že umiestnenie ultrazvukovej sonotródy v reakčnej nádobe ovplyvňuje distribúciu kavitácie a mikroprúdenia v médiu. Sonotróda a ultrazvukový reaktor by sa mali zvoliť v súlade so spracovateľským objemom bunkového vývaru. Zatiaľ čo sonikáciu je možné vykonávať v dávkovom aj nepretržitom režime, pri veľkých objemoch výroby sa odporúča použitie inštalácie s nepretržitým prietokom. Pri prechode cez ultrazvukovú prietokovú bunku je všetko bunkové médium vystavené presne rovnakému pôsobeniu sonikácie, čo zaisťuje najúčinnejšiu liečbu. Široká škála ultrazvukových sond a reaktorov prietokových buniek Hielscher Ultrasonics umožňuje zostaviť ideálne nastavenie ultrazvukového biologického spracovania.
Hielscher Ultrasonics – Od laboratória cez pilotný projekt až po výrobu
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics pokrýva celé spektrum ultrazvukových zariadení, ktoré ponúkajú kompaktné ručné ultrazvukové homogenizátory na prípravu vzoriek až po stolové a pilotné systémy, ako aj výkonné priemyselné ultrazvukové jednotky, ktoré ľahko spracujú nákladné vozidlá za hodinu. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú všestranné a flexibilné v možnostiach inštalácie a montáže, takže ich možno ľahko integrovať do všetkých druhov vsádkových reaktorov, podávaných dávok alebo kontinuálnych prietokových nastavení.
Rôzne príslušenstvo, ako aj prispôsobené diely umožňujú ideálne prispôsobenie vášho ultrazvukového nastavenia požiadavkám vášho procesu.
Ultrazvukové procesory Hielscher, ktoré sú skonštruované pre prevádzku 24 hodín denne, 7 dní v týždni pri plnom zaťažení a náročných podmienkach, sú spoľahlivé a vyžadujú len nízku údržbu.
Nasledujúca tabuľka vám poskytuje približnú kapacitu spracovania našich ultrazvukových prístrojov:
| Objem dávky | Prietok | Odporúčané zariadenia |
|---|---|---|
| 1 až 500 ml | 10 až 200 ml/min | UP100H |
| 10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 až 20 l | 00,2 až 4 l/min | UIP2000hdT |
| 10 až 100 l | 2 až 10 l/min | UIP4000hdT |
| N.A. | 10 až 100 l/min | UIP16000 |
| N.A. | väčší | Zhluk UIP16000 |
Kontaktujte nás! / Opýtajte sa nás!
Vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratórium do pilot a priemyselný stupnica.
Literatúra / Referencie
- Muschiol, Jan; Meyer, Anne S. (2019): A chemo-enzymatic approach for the synthesis of human milk oligosaccharide backbone structures. Zeitschrift für Naturforschung C, Volume 74: Issue 3-4, 2019. 85-89.
- Birgitte Zeuner, David Teze, Jan Muschiol, Anne S. Meyer (2019): Synthesis of Human Milk Oligosaccharides: Protein Engineering Strategies for Improved Enzymatic Transglycosylation. Molecules 24, 2019.
- Yun Hee Choi, Bum Seok Park, Joo‐Hyun Seo, Byung‐Gee Ki (2019): Biosynthesis of the human milk oligosaccharide 3‐fucosyllactose in metabolically engineered Escherichia coli via the salvage pathway through increasing GTP synthesis and β‐galactosidase modification. Biotechnology and Bioengineering Volume 116, Issue 12. December 2019.
- Balakrishnan Naveena, Patricia Armshaw, J. Tony Pembroke (2015): Ultrasonic intensification as a tool for enhanced microbial biofuel yields. Biotechnology of Biofuels 8:140, 2015.
- Shweta Pawar, Virendra K. Rathod (2020): Role of ultrasound in assisted fermentation technologies for process enhancements. Preparative Biochemistry & Biotechnology 50(6), 2020. 1-8.
Fakty, ktoré stoja za to vedieť
Biosyntéza pomocou bunkových tovární
Továreň na mikrobiálne bunky je metóda bioinžinierstva, ktorá využíva mikrobiálne bunky ako výrobné zariadenie. Genetickým inžinierstvom mikróbov sa modifikuje DNA mikroorganizmov, ako sú baktérie, kvasinky, huby, bunky cicavcov alebo riasy, čím sa mikróby menia na bunkové továrne. Bunkové továrne sa používajú na premenu substrátov na cenné biologické molekuly, ktoré sa používajú napr. v potravinárstve, farmácii, chémii a výrobe palív. Rôzne stratégie biosyntézy založenej na bunkových továrňach sa zameriavajú na produkciu natívnych metabolitov, expresiu heterológnych biosyntetických dráh alebo expresiu proteínov.
Bunkové továrne možno použiť buď na syntézu natívnych metabolitov, na expresiu heterológnych biosyntetických dráh alebo na expresiu proteínov.
Biosyntéza natívnych metabolitov
Natívne metabolity sú definované ako biologické molekuly, ktoré bunky používané ako bunková továreň produkujú prirodzene. Bunkové továrne produkujú tieto biologické molekuly buď intracelulárne, alebo vylučovanú látku. Ten je preferovaný, pretože uľahčuje separáciu a čistenie cieľových zlúčenín. Príkladmi natívnych metabolitov sú aminokyseliny a nukleové kyseliny, antibiotiká, vitamíny, enzýmy, bioaktívne zlúčeniny a proteíny produkované z anabolických dráh buniek.
Heterologické biosyntetické dráhy
Pri pokuse o výrobu zaujímavej zlúčeniny je jedným z najdôležitejších rozhodnutí výber produkcie v natívnom hostiteľovi a optimalizácia tohto hostiteľa alebo prenos cesty na iného známeho hostiteľa. Ak je možné pôvodného hostiteľa prispôsobiť priemyselnému fermentačnému procesu a neexistujú pri tom žiadne zdravotné riziká (napr. výroba toxických vedľajších produktov), môže to byť preferovaná stratégia (ako to bolo napr. v prípade penicilínu). V mnohých moderných prípadoch však potenciál použitia priemyselne preferovanej továrne na bunky a súvisiacich platformových procesov prevažuje nad náročnosťou prenosu cesty.
Expresia bielkovín
Expresiu proteínov možno dosiahnuť homológnymi a heterológnymi spôsobmi. Pri homológnej expresii je gén, ktorý je prirodzene prítomný v organizme, nadmerne exprimovaný. Prostredníctvom tejto nadmernej expresie je možné dosiahnuť vyšší výťažok určitej biologickej molekuly. Pre heterológnu expresiu sa špecifický gén prenáša do hostiteľskej bunky v tom zmysle, že gén nie je prirodzene prítomný. Pomocou bunkového inžinierstva a technológie rekombinantnej DNA sa gén vloží do DNA hostiteľa tak, aby hostiteľská bunka produkovala (veľké) množstvo proteínu, ktorý by prirodzene neprodukovala. Expresia bielkovín sa uskutočňuje v rôznych hostiteľoch z baktérií, napr. E. coli a Bacillis subtilis, kvasiniek, napr. Klyuveromyces lactis, Pichia pastoris, S. cerevisiae, vláknitých húb, napr. ako A. niger, a buniek odvodených z mnohobunkových organizmov, ako sú cicavce a hmyz. Innumérne proteíny sú veľmi komerčne zaujímavé, vrátane objemových enzýmov, komplexných biofarmaceutík, diagnostiky a výskumných činidiel. (porovnaj A.M. Davy et al. 2017)