Syntéza peptidov v pevnej fáze – Vyššia efektívnosť vďaka sonikácii
Syntéza peptidov v pevnej fáze (SPPS) je bežná metóda syntézy peptidov. Ultrazvuk je spoľahlivý nástroj na zintenzívnenie syntézy peptidov v pevnej fáze, čo vedie k vyšším výťažkom, zlepšenej čistote, žiadnej racemizácii a výrazne zrýchlenej rýchlosti reakcie. Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové roztoky na syntézu, štiepenie a rozpúšťanie peptidov.
Ultrasonic Solid-Phase Peptide Synthesis
Ultrazvuk je už široko používaný ako zintenzívňujúca metóda v organickej syntéze a je dobre známy svojimi výhodami, ako sú drasticky skrátené reakčné časy, vyššie výťažky, menej vedľajších produktov, iniciácia dráh, ktoré by sa nedali dosiahnuť inými spôsobmi, a/alebo lepšia selektivita. Veľké výhody možno dosiahnuť aj vtedy, keď sa sonikácia spojí s reakciami syntézy peptidov. Výsledky výskumu preukázali, že ultrazvukom asistovaná syntéza peptidov dosahuje optimalizovaný výťažok peptidov s vysokou čistotou, bez racemizácie v krátkom reakčnom čase.
- Vysoké výťažky peptidov
- Výrazne rýchlejšia syntéza
- Vyššia čistota peptidov
- Žiadna racemizácia
- Paralelná syntéza rôznych peptidov
- Scalable to any volume
Ultrazvukový cuphorn pre rovnomernú sonikáciu niekoľkých reaktorových nádob pre lepšiu syntézu peptidov.
Graphic demonstrating the Merrifield solid phase peptide synthesis. Ultrasonication is used to promote and enhance the synthesis reaction as well as for cleavage of the synthesized peptides from the resin.
Grafika: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Study | Peptide(s) Studied | Reaction Time (Classical vs US-SPPS) | Crude Purity (Classical vs US-SPPS) | Racemization and Side Reactions | Key Takeaways |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkephalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorphin | 600–1920 min → 48–284 min | 24.2–71.3% → 60.6–89.9% | None observed for Cys/His, even at 70°C | ~7–12x faster synthesis; major purity improvements, especially for aggregation-prone sequences like TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (US only) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Not tested; slight purity drop in Pep2 noted | 14x time reduction for Pep1; crude yields significantly increased. |
| Merlino et al. (2019) | Model pentapeptides, peptides up to 44-mer, “Náročné sekvencie” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (model) | 84% → 93% (model); significantly higher than thermal heating (~45°C) | No significant increase for Cys/His enantiomers | Highly effective for difficult/aggregation-prone sequences; allows reduced reagent excess while maintaining high purity. |
Syntéza peptidov v pevnej fáze vylepšená ultrazvukom
Syntéza peptidov v pevnej fáze (SPPS) je chemická reakcia, ktorá umožňuje zostavenie peptidového reťazca prostredníctvom postupných reakcií derivátov aminokyselín na nerozpustnom pórovitom podklade. Tradičná syntéza peptidov v pevnej fáze je však relatívne neefektívny a pomalý proces. Preto je ultrazvuková intenzifikácia syntézy peptidov vysoko uznávaným nástrojom pre efektívnejšiu a rýchlejšiu syntézu peptidov.
Silva a kol. (2021) porovnali “klasický” syntéza peptidov v pevnej fáze (SPPS) s použitím fluorenylmetoxykarbonylu (Fmoc) (US) založená na príprave troch peptidov, a to peptidu Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) špecifického pre receptor rastového faktoru fibroblastov 3 (FGFR3) a nových peptidov Pep2 (RQMATADEA-NH2) a Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS s podporou USA viedol k 14-násobnému (Pep1) a 4-násobnému skráteniu času (Pep2) potrebného na zostavenie peptidu v porovnaní s “klasický” metóda. Zaujímavé je, že metóda SPPS s využitím ultrazvuku poskytla Pep1 s vyššou čistotou (82 %) ako “klasický” SPPS (73 %). Výrazné skrátenie času v kombinácii s dosiahnutou vysokou čistotou surového peptidu podnietilo výskumný tím k tomu, aby metódu SPPS podporovanú ultrazvukom uplatnil na veľký peptid Pep3, ktorý vykazuje vysoký počet hydrofóbnych aminokyselín a homooligosekvencií. Pozoruhodné je, že syntézu tohto 25-merového peptidu sa podarilo dosiahnuť za menej ako 6 hodín (347 minút) pri strednej čistote (približne 49 %).
Rýchlejšia syntéza peptidov prostredníctvom syntézy peptidov v pevnej fáze pomocou ultrazvukového miešania.
(Štúdia a analýza: Wołczański et al., 2019)
Merlino a kol. (2019) takisto vykonali komplexnú štúdiu vplyvu ultrazvuku na syntézu peptidov v pevnej fáze založenú na Fmoc, čo umožnilo syntézu rôznych biologicky aktívnych peptidov (až do dĺžky 44 merov) s výraznou úsporou materiálu a reakčného času. Preukázali, že ultrazvuková ožiarenie nezhoršilo hlavné vedľajšie reakcie a zlepšilo syntézu peptidov s “Náročné sekvencie”, čím sa ultrazvukom podporovaná syntéza peptidov v pevnej fáze (US-SPPS) zaraďuje medzi súčasné vysoko účinné stratégie syntetickej syntézy peptidov.
Dostupnosť vysokovýkonných systémov na ultrazvukovú (zvukovú) syntézu peptidov umožňuje výrazne zlepšiť rýchlosť syntézy a zvýšiť čistotu surovín. (porovnaj Wołczański a kol., 2019)
Vyšetrovanie racemizácie. Porovnanie významných 1H NMR spektier modelových peptidov syntetizovaných manuálne pomocou klasického prístupu pri izbovej teplote oproti ultrazvukovej metóde pri zvýšenej teplote. Chemické posuny α-protónov His a Cys a metylénovej skupiny Acm (ľavé panely), ɣ-metylprotóny Val (pravé panely) ukazujú, že sonikacia pri 70 °C nespôsobuje racemizáciu.
(Štúdia a analýza: Wołczański et al., 2019)
Ultrazvukové štiepenie peptidov
Po syntéze peptidov v pevnej fáze (SPPS) sa musia syntetizované peptidy štiepiť od polymérnych živíc. Tento krok je známy aj ako deprotekcia. Pri porovnaní bežného trepania a ultrazvuku pre štiepenie peptidov zo živice vyžaduje metóda trepania cca. 1 hodina, zatiaľ čo ultrazvukové štiepenie je možné dosiahnuť za 15 až 20 minút. Ultrazvukové štiepenie peptidov je možné aplikovať na štiepenie chránených aminokyselín a peptidov spojených s polystyrénskymi živicami prostredníctvom väzieb benzylových esterov.
Ultrazvukové štiepenie peptidov z polystyrénovej živice poskytuje vysoké výťažky peptidov vo vysokej čistote, bez racemizácie, v rámci rýchleho postupu.
(štúdia a grafika: ©Anuradha a Ravindranath, 1995)
Ultrazvukovo miešaný reaktor pre lepšiu a zrýchlenú syntézu peptidov. Na obrázku je zobrazená ultrazvuk UP200St v reaktore s miešaným sklom.
Vysokovýkonné ultrazvukové prístroje na syntézu peptidov
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové riešenia pre priamu a nepriamu sonikáciu. Výkonné a presne ovládateľné ultrazvukové procesory dodávajú do reakčnej nádoby presne správne množstvo ultrazvukovej energie. Či už používate injekčné striekačky, skúmavky, viacjamkové platne alebo sklenené reaktory ako syntéznu nádobu, Hielscher Ultrasonics ponúka najvhodnejší ultrazvuk pre vašu peptidovú aplikáciu.
- prispôsobené peptidy
- výroba peptidov vo veľkom meradle
- Knižnice peptidov
Mnoho peptidových syntéz sa vykonáva v injekčných striekačkách (napr. fritované injekčné reaktory). Hielscherovo ultrazvukové miešadlo do injekčnej striekačky sonikuje peptidový roztok a spája ultrazvukové vlny cez stenu injekčnej striekačky do kvapaliny. Ultrazvukové striekačkové miešadlo je jedným z najpopulárnejších ultrazvukových riešení pre ultrazvukom asistovanú syntézu peptidov.
Ultrazvukový cuphorn je vhodným nástrojom na sonikáciu až 5 reaktorových nádob, zatiaľ čo VialTweeter pojme až desať reakčných trubíc a navyše päť väčších nádob pomocou upínacieho príslušenstva.
For other reactor types such as the Merrifield or Kamysz solid-phase reactor and other polypropylene or borosilicate vessels and reactors, Hielscher offers sonicators for indirect and direct sonication with customized clamp-on mounting or flange.
Samozrejme, väčšie sklenené reaktory s miešaním, napríklad určené na syntézu v roztoku, možno ľahko vybaviť ultrazvukovými sondami (tiež známymi ako sonotrody alebo ultrazvukové rohy) akejkoľvek veľkosti.
- rôzne typy ultrazvuku
- priama a nepriama sonikácia
- presná regulácia intenzity
- presná regulácia teploty
- kontinuálny alebo pulzný ultrazvuk
- Inteligentné funkcie, programovateľné zariadenia
- K dispozícii pre akýkoľvek objem
- lineárna škálovateľnosť
Pre syntézu peptidov v pevnej fáze v multiwellových/mikrotitračných platniach je zariadenie UIP400MTP ideálnou voľbou. Ultrazvuková kavitácia je nepriamo a rovnomerne prenášaná do početných jamiek na vzorky, čo zabezpečuje vynikajúci prenos hmoty a syntetickú reakciu. Pozrite si nižšie uvedené video, aby ste videli, ako to funguje. Ultrazvukový prístroj pre mikrotitračné platničky UIP400MTP v akcii!
Kontaktujte nás! / Opýtajte sa nás!
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory na miešanie, disperziu, emulgáciu a extrakciu v laboratórnom, pilotnom a priemyselnom meradle.
Zaujímavé fakty o ultrazvukovej syntéze peptidov
Čo sú peptidy?
Peptidy sú zlúčeniny, kde je viaceré aminokyseliny spojené amidovými väzbami, takzvanými peptidovými väzbami. Pri viazaní v zložitých štruktúrach – Zvyčajne pozostávajúce z 50 alebo viac aminokyselín - tieto veľké peptidové štruktúry sa nazývajú proteíny. Peptidy sú základným stavebným kameňom života a plnia v tele množstvo funkcií.
Ako funguje syntéza peptidov?
V organickej chémii, molekulárnej biológii a prírodných vedách je syntéza peptidov procesom výroby peptidov. Peptidy sa chemicky syntetizujú kondenzačnou reakciou karboxylovej skupiny jednej aminokyseliny na aminoskupinu inej aminokyseliny. Stratégie ochranných skupín (tiež ochranných skupín) sa zvyčajne používajú, aby sa predišlo nežiaducim vedľajším reakciám s rôznymi bočnými reťazcami aminokyselín.
Chemická (in-vitro) syntéza peptidov sa najčastejšie začína spojením karboxylovej skupiny prichádzajúcej aminokyseliny (C-koniec) s N-koncom rastúceho peptidového reťazca. Na rozdiel od tejto syntézy C-to-N prebieha prirodzená biosyntéza proteínov dlhých peptidov v živých organizmoch opačným smerom. To znamená, že pri biosyntéze je N-koniec prichádzajúcej aminokyseliny spojený s C-koncom proteínového reťazca (N-to-C).
Väčšina výskumných a vývojových protokolov pre syntézu peptidov je založená na metódach v pevnej fáze, zatiaľ čo metódy syntézy vo fáze roztoku možno nájsť vo veľkom priemyselnej výrobe peptidov.
Aký je súčasný stav v oblasti syntézy peptidov?
SUS-SPPS (udržateľná SPPS s využitím ultrazvuku) has been demonstrated to reduce the process to just two steps per cycle (combined coupling/capping/deprotection + single wash), significantly reducing solvent consumption and time. (cf. Mottola et al., 2025)
TAPS s využitím ultrazvuku ide o novú kombináciu, ktorá preukázala úspešnosť pri totálnych syntézach (napr. lipobaktín) a ktorú spoločnosti CDMO skúmajú z hľadiska výroby aktívnych farmaceutických látok (API).
Objavte výhody syntézy peptidov pomocou ultrazvuku v rámci metódy TAGGING!
kontinuálne spracovanie sa skúma ako ďalšie vylepšenie – Boli opísané platformy na kontinuálnu jednokrokovú syntézu s využitím silylovaných značiek.
Tento odbor sa uberá smerom k princípom zelenej chémie, pričom ultrazvuk aj technológia TAPS prispievajú k zníženiu spotreby rozpúšťadiel, menšiemu množstvu použitých činidiel a väčšej udržateľnosti.
Literatúra / Referencie
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratórium do priemyselná veľkosť.