Syntéza peptidov na pevnej fáze – účinnejšia vďaka sonikácii

Syntéza peptidov na pevnej fáze (SPPS) je bežnou metódou syntézy peptidov. Pôsobenie ultrazvuku je spoľahlivým nástrojom na intenzifikáciu syntézy peptidov na pevnej fáze, čo vedie k vyšším výťažkom, zlepšenej čistote, absencii racemizácie a výraznému zrýchleniu reakcie. Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové riešenia na syntézu peptidov, ich odštiepenie a rozpúšťanie.

Ultrazvuková syntéza peptidov na pevnej fáze

Pôsobenie ultrazvuku sa už široko využíva ako metóda intenzifikácie v organickej syntéze a je dobre známe svojimi výhodami, ako sú výrazne skrátené reakčné časy, vyššie výťažky, menšie množstvo vedľajších produktov, iniciácia reakčných dráh, ktoré by nebolo možné dosiahnuť inými spôsobmi, a/alebo lepšia selektivita. Veľké prínosy možno dosiahnuť aj pri zavedení sonikácie do reakcií syntézy peptidov. Výsledky výskumu preukázali, že syntéza peptidov podporovaná ultrazvukom dosahuje optimalizovaný výťažok peptidov s vysokou čistotou, bez racemizácie a v krátkom reakčnom čase.

Výhody ultrazvukovej syntézy peptidov

Vysoké výťažky peptidov
Výrazne rýchlejšia syntéza
Vyššia čistota peptidov
Bez racemizácie
Paralelná syntéza rôznych peptidov
Škálovateľnosť na ľubovoľný objem

Ultrazvukový cuphorn na rovnomernú sonikáciu viacerých reakčných nádob, napr. na zlepšenie syntézy peptidov.

Ultrazvukový miskový sonotród na rovnomernú sonikáciu viacerých reakčných nádob na zlepšenie syntézy peptidov.

Schematické znázornenie Merrifieldovej syntézy peptidov na pevnej fáze, ktorú možno zintenzívniť sonikáciou.

Grafické znázornenie Merrifieldovej syntézy peptidov na pevnej fáze. Pôsobenie ultrazvuku sa využíva na podporu a zlepšenie syntetickej reakcie, ako aj na odštiepenie syntetizovaných peptidov zo živice.
Grafika: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)

Štúdia	Skúmané peptidy	Reakčný čas (klasická metóda vs. US-SPPS)	Čistota surového produktu (klasická metóda vs. US-SPPS)	Racemizácia a vedľajšie reakcie	Kľúčové zistenia
Wołczański et al. (2019)	Met-enkefalín, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfín	600–1920 min → 48–284 min	24,2–71,3% → 60,6–89,9%	Pri Cys/His sa nepozorovali, a to ani pri 70°C	~7–12x rýchlejšia syntéza; výrazné zlepšenie čistoty, najmä pri sekvenciách náchylných na agregáciu, ako je TAT.
Silva et al. (2021)	Pep1 (12-mér), Pep2 (9-mér), Pep3 (25-mér)	>3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (iba US)	73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2)	Netestované; pri Pep2 bol zaznamenaný mierny pokles čistoty	14x skrátenie času pri Pep1; výťažky surového produktu sa výrazne zvýšili.
Merlino et al. (2019)	Modelové pentapeptidy, peptidy až po 44-méry, „náročné sekvencie“ (Aβ 1-42, ACP 65-74)	60 min → 30 min (model)	84% → 93% (model); výrazne vyššia než pri tepelnom ohreve (~45°C)	Žiadny významný nárast enantiomérov Cys/His	Vysoko účinná pri náročných sekvenciách a sekvenciách náchylných na agregáciu; umožňuje znížiť nadbytok činidiel pri zachovaní vysokej čistoty.

Syntéza peptidov na pevnej fáze zlepšená ultrazvukom

Syntéza peptidov na pevnej fáze (SPPS) je chemická reakcia, ktorá umožňuje zostavenie peptidového reťazca postupnými reakciami derivátov aminokyselín na nerozpustnom poréznom nosiči. Tradičná syntéza peptidov na pevnej fáze je však pomerne neefektívny a pomalý proces. Preto je ultrazvuková intenzifikácia syntézy peptidov vysoko ceneným nástrojom na účinnejšiu a rýchlejšiu syntézu peptidov.
Silva et al. (2021) porovnali „klasickú“ syntézu peptidov na pevnej fáze (SPPS) s použitím fluorenylmetoxykarbonylovej skupiny (Fmoc) so SPPS podporovanou ultrazvukom (US) na základe prípravy troch peptidov, konkrétne peptidu Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), špecifického pre receptor fibroblastového rastového faktora 3 (FGFR3), a nových peptidov Pep2 (RQMATADEA-NH2) a Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS podporovaná ultrazvukom viedla k 14-násobnému (Pep1) a 4-násobnému (Pep2) skráteniu času zostavovania peptidov v porovnaní s „klasickou“ metódou. Zaujímavé je, že SPPS podporovaná ultrazvukom poskytla Pep1 s vyššou čistotou (82%) než „klasická“ SPPS (73%). Výrazné skrátenie času v kombinácii s dosiahnutou vysokou čistotou surových peptidov podnietilo výskumný tím, aby SPPS podporovanú ultrazvukom použil na veľký peptid Pep3, ktorý obsahuje veľký počet hydrofóbnych aminokyselín a homooligomérnych sekvencií. Pozoruhodné je, že syntéza tohto 25-mérneho peptidu sa uskutočnila za menej než 6 hodín (347 min) so strednou čistotou (približne 49%).

Ultrazvuková syntéza peptidov na pevnej fáze (US-SPPS) je účinná technika syntézy peptidov, ktorá zabraňuje racemizácii.

Rýchlejšia syntéza peptidov prostredníctvom syntézy na pevnej fáze s použitím ultrazvukového miešania.
(Štúdia a analýza: Wołczański et al., 2019)

Merlino et al. (2019) takisto uskutočnili komplexnú štúdiu účinkov ultrazvuku na syntézu peptidov na pevnej fáze založenú na Fmoc, ktorá umožnila syntézu rôznych biologicky aktívnych peptidov (až po 44-méry) s pozoruhodnou úsporou materiálu a reakčného času. Preukázali, že pôsobenie ultrazvuku nezintenzívnilo hlavné vedľajšie reakcie a zlepšilo syntézu peptidov s „náročnými sekvenciami“, čím zaradili ultrazvukom podporovanú syntézu peptidov na pevnej fáze (US-SPPS) medzi súčasné vysoko účinné stratégie syntézy peptidov.

Dostupnosť vysokovýkonných systémov na ultrazvukovú (sonickú) syntézu peptidov umožňuje výrazné zvýšenie rýchlosti syntézy a zvýšenie čistoty surových produktov. (porov. Wołczański et al., 2019)

Ultrazvuková syntéza peptidov poskytuje vysoké výťažky peptidov s vysokou čistotou, pričom sa zabraňuje racemizácii.

Skúmanie racemizácie. Porovnanie významných 1H NMR spektier modelových peptidov syntetizovaných manuálne klasickým postupom pri izbovej teplote a ultrazvukovou metódou pri zvýšenej teplote. Chemické posuny α-protónov His a Cys a metylénovej skupiny Acm (ľavé panely) a ɣ-metylových protónov Val (pravé panely) ukazujú, že sonikácia pri 70°C nespôsobuje racemizáciu.
(Štúdia a analýza: Wołczański et al., 2019)

Ultrazvukové odštiepenie peptidov

Po syntéze peptidov na pevnej fáze (SPPS) sa syntetizované peptidy musia odštiepiť od polymérnych živíc. Tento krok je známy aj ako odstránenie ochranných skupín. Pri porovnaní bežného pretrepávania a pôsobenia ultrazvuku na odštiepenie peptidov od živice si metóda pretrepávania vyžaduje približne 1 hodinu, zatiaľ čo ultrazvukové odštiepenie sa dá uskutočniť za 15 až 20 min. Ultrazvukové odštiepenie peptidov možno použiť na odštiepenie chránených aminokyselín a peptidov naviazaných na polystyrénové živice prostredníctvom benzylových esterových väzieb.

Ultrazvukové odštiepenie je rýchla a spoľahlivá technika na oddelenie syntetizovaných peptidov od polystyrénovej živice.

Ultrazvukové odštiepenie peptidov od polystyrénovej živice poskytuje vysoké výťažky peptidov s vysokou čistotou, bez racemizácie a s použitím rýchleho postupu.
(štúdia a grafické znázornenie: ©Anuradha a Ravindranath, 1995)

Reaktor s ultrazvukovým miešaním na zlepšenie syntézy peptidov.

Reaktor s ultrazvukovým miešaním na zlepšenú a zrýchlenú syntézu peptidov. Obrázok zobrazuje ultrazvukový prístroj UP200St v miešanom sklenenom reaktore.

Vysokovýkonné ultrazvukové prístroje na syntézu peptidov

Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové riešenia na priamu a nepriamu sonikáciu. Výkonné a presne regulovateľné ultrazvukové procesory dodávajú do reakčnej nádoby presne potrebné množstvo ultrazvukovej energie. Či už ako nádoby na syntézu používate injekčné striekačky, skúmavky, viacjamkové platničky alebo sklenené reaktory, Hielscher Ultrasonics ponúka najvhodnejší sonikátor pre vašu peptidovú aplikáciu.

Ultrazvukové systémy Hielscher sú ideálne na syntézu

peptidov na mieru
peptidov vo veľkom meradle
peptidových knižníc

Mnohé syntézy peptidov sa vykonávajú v injekčných striekačkách (napr. v striekačkových reaktoroch s fritou). Ultrazvukové miešadlo pre injekčné striekačky od spoločnosti Hielscher sonikuje peptidový roztok prenosom ultrazvukových vĺn cez stenu striekačky do kvapaliny. Ultrazvukové miešadlo pre injekčné striekačky je jedným z najobľúbenejších ultrazvukových riešení na ultrazvukom asistovanú syntézu peptidov.
Ultrazvukový systém cuphorn je vhodným nástrojom na sonikáciu až 5 reaktorových nádob, zatiaľ čo VialTweeter pojme až desať reakčných skúmaviek a navyše päť väčších nádob pomocou upínacieho príslušenstva.
Pre iné typy reaktorov, ako sú Merrifieldov alebo Kamyszov reaktor na syntézu na pevnej fáze, a ďalšie polypropylénové alebo borosilikátové nádoby a reaktory ponúka Hielscher sonikátory na nepriamu a priamu sonikáciu s upínacím uchytením alebo prírubou na mieru.

Samozrejme, väčšie miešané sklenené reaktory, napr. na syntézu v roztoku, možno jednoducho vybaviť ultrazvukovými sondami (známymi aj ako sonotródy alebo ultrazvukové rohy) ľubovoľnej veľkosti.

Výhody sonikátorov Hielscher pri syntéze peptidov

rôzne typy sonikátorov
priama a nepriama sonikácia
presná regulácia intenzity
presná regulácia teploty
kontinuálny alebo pulzný ultrazvuk
inteligentné funkcie, programovateľné zariadenia
dostupné pre akýkoľvek objem
lineárna škálovateľnosť

UIP400MTP je ideálnym zariadením na syntézu peptidov na pevnej fáze vo viacjamkových/mikrotitračných platničkách. Ultrazvuková kavitácia sa nepriamo a rovnomerne prenáša do početných jamiek so vzorkami, čím zabezpečuje vynikajúci prenos hmoty a priebeh syntetickej reakcie. Pozrite si video nižšie a uvidíte sonikátor mikrotitračných platničiek UIP400MTP v akcii!

Ultrazvukový homogenizátor UIP400MTP dokáže sonikovať viacjamkové a mikrotitračné platničky na lýzu buniek, fragmentáciu DNA, dispergovanie alebo homogenizáciu.

Kontaktujte nás! / Opýtajte sa nás!

Ultrazvukové homogenizátory s vysokým šmykovým namáhaním sa používajú pri spracovaní v laboratórnom, stolovom, poloprevádzkovom a priemyselnom meradle.

Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory na miešanie, dispergovanie, emulgáciu a extrakciu v laboratórnom, poloprevádzkovom a priemyselnom meradle.

Súvisiace témy

Užitočné fakty o ultrazvukovej syntéze peptidov

Čo sú peptidy?

Peptidy sú zlúčeniny, v ktorých sú viaceré aminokyseliny spojené amidovými väzbami, takzvanými peptidovými väzbami. Keď sú viazané do komplexných štruktúr – zvyčajne pozostávajúcich z 50 alebo viacerých aminokyselín –, tieto veľké peptidové štruktúry sa označujú ako proteíny. Peptidy sú základnou stavebnou zložkou života a v organizme plnia početné funkcie.

Ako prebieha syntéza peptidov?

V organickej chémii, molekulárnej biológii a biologických vedách je syntéza peptidov procesom tvorby peptidov. Peptidy sa chemicky syntetizujú kondenzačnou reakciou karboxylovej skupiny jednej aminokyseliny s aminoskupinou inej aminokyseliny. Na zabránenie nežiaducim vedľajším reakciám s rôznymi bočnými reťazcami aminokyselín sa zvyčajne používajú stratégie využívajúce chrániace skupiny (tiež nazývané ochranné skupiny).
Chemická syntéza peptidov (in vitro) sa najčastejšie začína pripojením karboxylovej skupiny vstupujúcej aminokyseliny (C-koniec) k N-koncu rastúceho peptidového reťazca. Na rozdiel od tejto syntézy v smere od C-konca k N-koncu prebieha prirodzená biosyntéza proteínov tvorených dlhými peptidmi v živých organizmoch opačným smerom. To znamená, že pri biosyntéze sa N-koniec vstupujúcej aminokyseliny pripája k C-koncu proteínového reťazca (v smere od N-konca k C-koncu).
Väčšina výskumných a vývojových protokolov na syntézu peptidov je založená na metódach na pevnej fáze, zatiaľ čo metódy syntézy v roztoku sa využívajú pri priemyselnej výrobe peptidov vo veľkom meradle.

Aký je súčasný stav techniky v syntéze peptidov?
SUS-SPPS (udržateľná ultrazvukom asistovaná SPPS) preukázateľne redukuje proces na iba dva kroky v každom cykle (kombinované pripájanie/blokovanie/deprotekcia + jedno premytie), čím výrazne znižuje spotrebu rozpúšťadiel a časovú náročnosť. (porov. Mottola et al., 2025)
Ultrazvukom asistovaná TAPS je rozvíjajúca sa kombinácia s preukázanými úspechmi v totálnych syntézach (napr. lipobaktínu), ktorú organizácie zmluvného vývoja a výroby (CDMO) skúmajú na výrobu účinných farmaceutických látok (API).
Objavte výhody ultrazvukom asistovanej syntézy peptidov pomocou metódy TAGGING!
Kontinuálne spracovanie sa skúma ako ďalšie zlepšenie – boli opísané platformy kontinuálnej syntézy v jednej nádobe s využitím silylovaných značiek.
Táto oblasť smeruje k princípom zelenej chémie, pričom ultrazvuk aj TAPS prispievajú k zníženiu spotreby rozpúšťadiel, menším dávkam činidiel a lepšej udržateľnosti.

Literatúra / Referencie

Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.

Vysokovýkonná ultrazvuková technika! Sortiment spoločnosti Hielscher pokrýva celé spektrum od kompaktného laboratórneho ultrazvukového prístroja cez stolové jednotky až po plne priemyselné ultrazvukové systémy.

Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory vo veľkostiach od laboratórnych až po priemyselné.