Ultrazvuková lýza pre Western Blotting

• Western blot je analytický postup na detekciu špecifických proteínov vo vzorke tkanivového homogenátu alebo bunkového extraktu.
• Na spustenie Western blotu alebo na meranie aktivity enzýmov si mnohé testy vyžadujú prístup k materiálom (napr. proteínom, DNA, subcelulárnym fragmentom) zachyteným v bunke.
• Sonikácia je spoľahlivá a ľahko ovládateľná metóda na riadené narušenie a lýzu buniek.

Ultrazvukové narušenie buniek

Extrakcia proteínov z tkanív a kultivovaných buniek je prvým krokom mnohých biologických, biochemických a analytických techník (PAGE, Western blotting, ELISA, hmotnostná spektrometria atď.) alebo purifikácie proteínov. Na dosiahnutie vysokého výťažku bielkovín je potrebné bunkový materiál a tkanivo účinne narušiť/lyzovať. Či už ide o rastlinné bunky alebo živočíšne tkanivo, sonikácia je metóda na jednoduchú a rýchlu prípravu lyzátu buniek.

Výhody sonikácie

• Rýchly & Účinný
• Jednoduchá obsluha
• vysoký výťažok bielkovín
• reprodukovateľné/opakovateľné
• Presne riadené
• Škálovateľné

Imunoprecipitačný protokol pre západnú imunoblotáciu

A. Činidlá

Na prípravu roztokov použite čistenú vodu, ako je Milli-Q.

• 1x fosfátový pufrovaný fyziologický roztok (PBS)
• 1X pufr na lýzu buniek: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100, 2,5 mM pyrofosforečnan sodný, 1 mM β-glycerofosfát, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptín
  dôležité: Bezprostredne pred použitím pridajte 1 mM PMSF.
• 15 μl proteínu A+15 μl proteínu G postačuje na IP, ale môže to závisieť od vašej primárnej protilátky a objemu vzorky. Môžete tiež použiť vopred namiešaný proteín A/G agaróza (napr. Proteín A pre králikov IgG pull down a Protein G pre myší IgG pull down)
• 3X SDS tlmivý pufer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 pri 25 °C), 6 % w/v SDS, 30 % glycerolu, 150 mM DTT, 0,03 % w/v brómfenolovej modrej

B. Príprava bunkových lyzátov

• Zozbierajte bunky. Ak chcete zbierať bunky za nedenaturačných podmienok, odstráňte médium a raz opláchnite bunky ľadovo studeným PBS.
• Vyberte PBS a pridajte 0,5 ml ľadovo studeného 1X tlmivého roztoku na lýzu buniek na každú platňu (10 cm) a inkubujte platne na ľade 5 minút.
• Zoškrabte bunky z platní a preneste ich do mikrocentrifúgových skúmaviek. Držte sa na ľade.
• Sonikujte dvakrát po dobu 10 sekúnd v ľadovo studenom imunoprecipitačnom pufri (IP pufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1 % NP-40 a zmes inhibítorov proteázy). Na sonikáciu VialTweeter alebo ultrazvukový sondový ultrazvuk, ako je UP100H alebo UP200Ht sú najvhodnejšie.
• Lyzáty sa odstreďujú pri 15 000 g počas 10 minút pri 4 °C.
• Preneste supernatant do novej skúmavky. (V prípade potreby je možné lyzát skladovať pri teplote –80 °C.)
• Pridajte primárnu protilátku k supernatantu. Supernatant s primárnou protilátkou sa inkubuje 1 hodinu pri teplote 4 °C pri ľahkom miešaní. Primárna protilátka sa zvyčajne pridáva v množstve 10-krát koncentrovanejším, ako sa používa na western blotting. (Môžete začať s 1 μg na 100 μl.)
• Supernatant sa potom ďalej inkubuje so zmesou rovnakého množstva proteínu A-agarózy (Invitrogén) a proteínu G agarózy počas ďalších 1 hodín.
• Agarózové pelety trikrát umyte IP pufrom. Potom extrahujte viazané proteíny pomocou načítacieho pufra SDS-PAGE zahrievaním na 95 °C počas 5 minút.

C. Imunoprecipitácia

• Vezmite 200 μl bunkového lyzátu a pridajte primárnu protilátku. Inkubujte s jemným hojdaním cez noc pri 4 °C.
• Pridajte buď proteín A alebo G agarózové guľôčky (20 μl 50% guľôčkovej kaše). Inkubujte s jemným hojdaním 1–3 hodiny pri 4 °C.
• Mikrocentrifúgujte 30 sekúnd pri 4 °C. Pelety päťkrát premyte 500 μl 1X pufra na lýzu buniek. Počas umývania držte na ľade.
• Peletu resuspendujte 20 μl 3X SDS tlmivým roztokom. Vortex, potom mikrocentrifúga 30 sekúnd.
• Vzorka sa zahrieva na 95 – 100 °C počas 2 – 5 minút a mikroodstredivka 1 minútu pri 14 000 x g.
• Vložte vzorku (15 – 30 μl) do gélu SDS-PAGE (12 – 15 %).
• Analyzujte vzorku podľa Western blottingu.

Analýza Western Blot pomocou Sonicator UP50H

V štúdii Kriebisch et al. (2011) bol použitý nasledujúci protokol používajúci sondový sondový sonátor UP50H:
Celkový proteín bol izolovaný z buniek MC3T3-E1 ošetrených 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) alebo vozidlo. Bunky boli lyzované tlmivým roztokom obsahujúcim 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecylsulfát sodný (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) a 0,5% deoxycholát sodný (Merck). Bunkový lyzát bol sonikovaný 2 × 10 s v 1. cykle a amplitúde 80 s Ultrazvukový procesor UP50H (Hielscher, ultrazvuková technológia, Teltow, Nemecko). Potom sa materiál odstredil 10 minút pri 14 000 otáčkach za minútu a supernatant sa použil na Western blotting. Dvadsaťpäť μg proteínu sa uvarilo vo vzorke pufra a redukčnom činidle (Invitrogen) a následne sa oddelilo pomocou SDS-PAGE pomocou 4–12% polyakrylamidových gélov (Invitrogen) a prenieslo do nitrocelulózovej membrány (GE health care). Membrána bola na 1 hodinu zablokovaná TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) obsahujúcim 1 % kazeínu (Sigma-Aldrich) a 1 % Tris (1 M). Po zablokovaní bola membrána inkubovaná s miernym miešaním cez noc pri 4 °C s primárnou protilátkou (králičie protiľudské CBS 1/500, vyvinuté v laboratóriu prof. R. Banerjeeho, Ann Arbor, MI, USA). Inkubácia s chrenovou peroxidázou (HPR) konjugovanou sekundárnou protilátkou (Dako) sa uskutočňovala 1 hodinu pri izbovej teplote. Všetky škvrny boli vyvinuté zvýšenou chemiluminiscenciou (Perkin Elmer).
 

Kliknite sem a prečítajte si viac o osvedčených postupoch pre ultrazvukovú lýzu a extrakciu buniek, prípravu lyzátu a odporúčania na zlepšenie procesov!
 
Nasledujúca tabuľka vám poskytuje približnú kapacitu spracovania našich ultrazvukových prístrojov veľkosti laboratória:

Literatúra / Referencie