Ultrazvuková lýza pre Western blotovanie

  • Západný blot je analytický postup na detekciu špecifických proteínov vo vzorke homogenátu tkaniva alebo extraktu buniek.
  • Ak chcete spustiť Western blot alebo merať enzýmovú aktivitu, mnoho testov vyžadujú prístup k materiálom (napr. bielkoviny, DNA, subbunkové fragmenty) sa v bunke.
  • Ultrazvukom je spoľahlivý a bezstarostný-až k-rukoväť metóda pre kontrolované bunkové narušenie a rozpadu.

Ultrazvukový bunkovej narušenie

Extrakcia bielkovín z tkanív a kultivovaných buniek je prvým krokom pre mnohé biologické, biochemické a analytické techniky (PAGE, Western blotting, ELISA, hmotnostná spektrometria atď.) alebo na čistenie bielkovín. Ak chcete získať vysoký výnos bielkovín, bunkové materiály a tkanivá musia byť účinne narušené/lysed. Či rastlinné bunky alebo živočíšne tkanivo, ultrazvukom je metóda na prípravu vašej bunky lysate ľahko a rýchlo.

Výhody ultrazvukom

  • Rýchle & Efektívne
  • jednoduchá obsluha
  • vysoký výnos bielkovín
  • reprodukovateľná/Opakovateľná
  • presne kontrolované
  • Škálovateľné

Žiadosť o informácie





Hielscher's VialTweeter is ideal for the lysis of multiple samples

VialTweeter sonikator pre ultrazvukovú prípravu vzoriek, ako je narušenie buniek a izolácia proteínov

Protokol o imunozrážkach pre západné imunoblotting

A. reagencie

Na prípravu roztokov použite čistenú vodu, ako je milli-Q.

  • 1X fosfátové pufrované soľný roztok (PBS)
  • 1X medzipamäť na rozpadu buniek: 20 mM tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Pyrofosforečnan sodný, 1 mM β-Glycerofosfát, 1 mM Na3VO4 μg/ml Leupeptínu
    Dôležité: pridajte 1 mM PMSF bezprostredne pred použitím.
  • 15 μl proteínu A + 15 μl proteínu G postačuje na IP, ale môže závisieť od primárnej protilátky a objemu vzorky. Môžete tiež použiť predzmiešanú bielkovinu a/G agarózový (napr. proteín a pre králik IgG vytiahnuť a proteín G pre myš IgG strhnúť)
  • 3x vzorkovacia medzipamäť KBÚ: 187,5 mm tris-HCl (pH 6,8 pri 25 ° c), 6% w/v KBÚ, 30% glycerol, 150 mm DTT, 0,03% w/v Brómofenolová modrá

B. Príprava buniek Lysates

  • Zber buniek. Ak chcete zbierať bunky za nedenaturačného stavu, odstráňte médium a opláchnite bunky raz s ľadovo studeným PBS.
  • Odstráňte PBS a do každej platne (10 cm) pridajte 0,5 ml ľad-studený 1X tlmivý roztok buniek a inkubujte platne na ľad po dobu 5 minút.
  • Odrezať bunky z dosiek a preniesť do mikroodstredivých rúrok. Majte na ľade.
  • Sonicate dvakrát po dobu 10 sekúnd v ľadovej-studenej imunozrážkovej medzipamäte (IP buffer: 50 mM tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 a inhibítor proteázy mix). Pre ultrazvukom, VialTweeter alebo sondou ultrasonicator, ako je UP100H alebo UP200Ht sú najvhodnejšie.
  • Odstreďte lyzáty pri 15 000 g počas 10 minút pri teplote 4 ° c.
  • Supernatant preneste do novej skúmavky. (Ak je to potrebné, lysát sa môže skladovať pri teplote – 80 ° c.)
  • Pridajte primárnu protilátku do supernatantu. Supernatant s primárnou protilátkou sa inkubuje po dobu 1 h pri teplote 4 ° c pri svetle agitácie. Primárna protilátka je typicky pridaný v množstve 10x koncentrovanejšie, ako sa používa pre západné blotting. (Môžete začať s 1μg na 100 μL.)
  • Supernatant sa potom ďalej inkubuje zmesou rovnakých množstiev proteínu a-agarózový (Invitrogen) a proteínu G agarózový pre ďalšie 1 h.
  • Umyte agarózový pelety trikrát s IP buffer. Potom extrahujte viazané bielkoviny pomocou nárazníkovej medzipamäte SDS-PAGE zahrievaním pri teplote 95 ° c počas 5 minút.

C. imunoprecipitácia

  • Vezmite 200 μl bunkového lysátu a pridajte primárnu protilátku. Inkubujte jemným hojdanie cez noc pri teplote 4 ° c.
  • Pridajte buď bielkoviny a alebo G agarózový korálky (20 μl 50% perličiek). Inkubujte jemným hojdanie 1 – 3 hodiny pri teplote 4 ° c.
  • Mikroodstreďte po dobu 30 sekúnd pri teplote 4 ° c. Pelety umyte päťkrát s 500 μl 1X tlmivého roztoku. Majte na ľade počas umýva.
  • Pelety resuspendite s 20 μl 3-násobnej vzorkovníkovej medzipamäte. Potom sa mikrocentrifúgy po dobu 30 sekúnd.
  • Vzorku zohrejte na 95 – 100 ° c počas 2 – 5 minút a mikrocentrifúgy 1 minútu pri 14 000 X g.
  • Vzorka sa načíta (15 – 30 μl) na gélovej strane SDS (12 – 15%).
  • Analyzujte vzorku západným blotting.

Analýza Western Blot so Sonicator UP50H

Nasledujúci protokol používajúci sondový sonikátor UP50H bol použitý v štúdii Kriebisch et al. (2011):
Ultrazvukový sondový homogenizátor UP50H sa bežne používa na narušenie buniek a izoláciu proteínov ako krok prípravy vzorky pred Western BlottingomCelkový proteín bol izolovaný z MC3T3-E1 buniek liečených 1, 25 (OH)2D3 (10− 8 M) alebo vozidlo. Bunky boli zrolované s tlmičom obsahujúcim 50 mM tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodekylsulfát sodný (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) a 0,5% deoxycholátu sodného (Merck). Bunka lysate bol sonicated pre 2 × 10 s v cykle 1 a amplitúdy 80 s UP50H Ultrazvukový procesor (Hielscher, ultrazvukové technológie, Teltow, Nemecko). Potom sa materiál odstrehol 10 min pri 14 000 rpm a supernatant bol použitý pre západné blotting. Dvadsať päť μg bielkovín bolo varené vo vzorke tlmivého roztoku a redukčné činidlo (Invitrogen) a následne oddelené SDS-PAGE pomocou 4 – 12% polyakrylamidové gély (Invitrogen) a prevedené na nitrocelulózovej membrány (GE zdravotnej starostlivosti). Membrána bola blokovaná pre 1 h s TBS (10 mM tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) obsahujúce 1% kazeínu (Sigma-Aldrich) a 1% tris (1 M). Po zablokovaní bola membrána inkubovaná miernym agitovaním cez noc pri teplote 4 ° c s primárnou protilátkou (králik anti-ľudský CBS 1/500, vyvinutý v laboratóriu prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubácia s chren peroxidázou (HPR)-konjugovaná sekundárna protilátka (DAKO) bola vykonaná pre 1 h pri izbovej teplote. Všetky škvrny boli vyvinuté zvýšenou chemiluminescenciou (Perkin Elmer).
 

Tento návod vysvetľuje, aký typ ultrazvukom je najlepší pre vaše úlohy prípravy vzoriek, ako je lýza, narušenie buniek, izolácia proteínov, fragmentácia DNA a RNA v laboratóriách, analýza a výskum. Vyberte si ideálny typ ultrazvukom pre vašu aplikáciu, objem vzorky, počet vzoriek a priepustnosť. Hielscher Ultrasonics má ideálny ultrazvukový homogenizátor pre vás!

Ako nájsť perfektný sonikátor pre narušenie buniek a extrakciu bielkovín vo vede a analýze

Miniatúra videa

 

Kliknite sem a prečítajte si viac o osvedčených postupoch pre lýzu a extrakciu ultrazvukových buniek, prípravu lyzátu a odporúčania na zlepšenie procesu!
 
Nasledujúca tabuľka vám poskytuje informácie o približnej kapacite spracovania našich ultrazvukových prístrojov laboratórnej veľkosti:

Odporúčané Devices Objem šarže prietok
UIP400MTP 96-jamkový doskový sonikátor viacvrstvové / mikrotiterové platne neuv
Ultrazvukový CupHorn CupHorn na injekčné liekovky alebo kadičky neuv
GDmini2 Ultrazvukový mikro-prietokový reaktor neuv
VialTweeter 0.5 až 1,5 mL neuv
UP100H 1 až 500mL 10 až 200mL/min
UP200Ht, UP200St 10 až 1000 ml 20 až 200 ml/min
UP400St 10 až 2000mL 20 až 400mL/min
ultrazvuková sitová trepačka neuv neuv

Kontaktuj nás! / Opýtajte sa nás!

Požiadajte o ďalšie informácie

Použite nižšie uvedený formulár a požiadajte o ďalšie informácie o našich sonicators na prípravu vzoriek pred Western Blots, podrobné aplikačné protokoly a cenu. Radi s vami prediskutujeme váš proces prípravy vzoriek a ponúkneme vám ultrazvukový systém spĺňajúci vaše požiadavky!









Vezmite prosím na vedomie naše Zásady ochrany osobných údajov,


Mikroplatne, viacjamkové platne, dosky PCR a dosky s 96 jamkami môžu byť pohodlne a rovnomerne sonikované pomocou sonikátora UIP400MTP dosiek

UIP400MTP Doska Sonicator pre vysoko výkonnú ultrazvukom z 96-jamkových dosiek



O západnej blotting

Blots sú analytické postupy, kde DNA, RNA a bielkoviny sú prevedené na dopravcu tak, aby mohli oddeliť.
Južný blot sa používa na detekciu DNA, Severná blot pre RNA a západné blot pre bielkoviny.
Západné blotu je tiež nazývaný proteín imunoblotting, pretože protilátky sa používa na konkrétne odhaliť jeho antigén. Západné blotting je jedným z najdôležitejších analytických metód na detekciu špecifických bielkovín vo vzorke. V západnom blot sú proteíny imobilizované na membránach, aby ich odhalili pomocou monoklonálnych alebo polyklonálnych protilátok.
Podľa KBÚ-polyakrylamidu gél elektroforéza (SDS-PAGE) natívne bielkoviny sú oddelené 3-D štruktúrou alebo denaturovaných bielkovín podľa dĺžky polypeptidu. Bielkoviny sú potom prevedené na membránu (typicky nitrocelulózy alebo PVDF), kde sú zafarbené protilátky špecifické pre cieľové bielkoviny. Gél elektroforéza krok je zahrnutá v západnej blot analýzy na vyriešenie problému cross-reaktivita protilátok.
Potom sa separované bielkoviny nafúknuté na maticu (väčšinou na nitrocelulóze alebo PVDF membránu), kde sú zafarbené s protilátkami. Protilátky fungujú ako sonda a sú vybrané špeciálne pre cieľové bielkoviny. Analýza umiestnenia a intenzity špecifickej reakcie odhaľuje údaje o výraze cieľových proteínov v danej vzorke. Západné blotu mohol detekovať cieľové bielkoviny, ktorá je tak nízka, ako 1ng kvôli vysokému rozlíšeniu gélovej elektroforéza a silnú špecifickosť a vysokú citlivosť imunoanalýzy. Metóda Western blot sa používa v molekulárnej biológii, biochemickom, imunogenetike a iných oblastiach molekulárneho výskumu.
Ďalšie súvisiace techniky zahŕňajú dot blot analýzy, imunohistochémie a imunocytochémie, kde sa protilátky používajú na detekciu bielkovín v tkanivách a bunkách pomocou imunostaining, a enzým-spojený imunosorbent test (ELISA).


Literatúra/referencie

Kompletné nastavenie VialTweeter: VialTweeter sonotrode na Ultrazvukový procesor UP200St

VialTweeter sonikator na súčasnú prípravu vzoriek viacerých injekčných liekoviek

Kontaktuj nás! / Opýtajte sa nás!





Vezmite prosím na vedomie naše Zásady ochrany osobných údajov,


Ultrazvukom je dôležitým krokom pri príprave vzoriek

UP200St s mikro-hrotom pre sonikáciu vzorky

Radi prediskutujeme váš proces.

Poďme sa skontaktovať.