Ultrazvuková lýza pre Western blotovanie

• Západný blot je analytický postup na detekciu špecifických proteínov vo vzorke homogenátu tkaniva alebo extraktu buniek.
• Ak chcete spustiť Western blot alebo merať enzýmovú aktivitu, mnoho testov vyžadujú prístup k materiálom (napr. bielkoviny, DNA, subbunkové fragmenty) sa v bunke.
• Ultrazvukom je spoľahlivý a bezstarostný-až k-rukoväť metóda pre kontrolované bunkové narušenie a rozpadu.

Ultrazvukový bunkovej narušenie

Extrakcia bielkovín z tkanív a kultivovaných buniek je prvým krokom pre mnohé biologické, biochemické a analytické techniky (PAGE, Western blotting, ELISA, hmotnostná spektrometria atď.) alebo na čistenie bielkovín. Ak chcete získať vysoký výnos bielkovín, bunkové materiály a tkanivá musia byť účinne narušené/lysed. Či rastlinné bunky alebo živočíšne tkanivo, ultrazvukom je metóda na prípravu vašej bunky lysate ľahko a rýchlo.

Výhody ultrazvukom

• Rýchle & Efektívne
• jednoduchá obsluha
• vysoký výnos bielkovín
• reprodukovateľná/Opakovateľná
• presne kontrolované
• Škálovateľné

Protokol o imunozrážkach pre západné imunoblotting

A. reagencie

Na prípravu roztokov použite čistenú vodu, ako je milli-Q.

• 1X fosfátové pufrované soľný roztok (PBS)
• 1X medzipamäť na rozpadu buniek: 20 mM tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Pyrofosforečnan sodný, 1 mM β-Glycerofosfát, 1 mM Na3VO4 μg/ml Leupeptínu
  Dôležité: pridajte 1 mM PMSF bezprostredne pred použitím.
• 15 μl proteínu A + 15 μl proteínu G postačuje na IP, ale môže závisieť od primárnej protilátky a objemu vzorky. Môžete tiež použiť predzmiešanú bielkovinu a/G agarózový (napr. proteín a pre králik IgG vytiahnuť a proteín G pre myš IgG strhnúť)
• 3x vzorkovacia medzipamäť KBÚ: 187,5 mm tris-HCl (pH 6,8 pri 25 ° c), 6% w/v KBÚ, 30% glycerol, 150 mm DTT, 0,03% w/v Brómofenolová modrá

B. Príprava buniek Lysates

• Zber buniek. Ak chcete zbierať bunky za nedenaturačného stavu, odstráňte médium a opláchnite bunky raz s ľadovo studeným PBS.
• Odstráňte PBS a do každej platne (10 cm) pridajte 0,5 ml ľad-studený 1X tlmivý roztok buniek a inkubujte platne na ľad po dobu 5 minút.
• Odrezať bunky z dosiek a preniesť do mikroodstredivých rúrok. Majte na ľade.
• Sonicate dvakrát po dobu 10 sekúnd v ľadovej-studenej imunozrážkovej medzipamäte (IP buffer: 50 mM tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 a inhibítor proteázy mix). Pre ultrazvukom, VialTweeter alebo sondou ultrasonicator, ako je UP100H alebo UP200Ht sú najvhodnejšie.
• Odstreďte lyzáty pri 15 000 g počas 10 minút pri teplote 4 ° c.
• Supernatant preneste do novej skúmavky. (Ak je to potrebné, lysát sa môže skladovať pri teplote – 80 ° c.)
• Pridajte primárnu protilátku do supernatantu. Supernatant s primárnou protilátkou sa inkubuje po dobu 1 h pri teplote 4 ° c pri svetle agitácie. Primárna protilátka je typicky pridaný v množstve 10x koncentrovanejšie, ako sa používa pre západné blotting. (Môžete začať s 1μg na 100 μL.)
• Supernatant sa potom ďalej inkubuje zmesou rovnakých množstiev proteínu a-agarózový (Invitrogen) a proteínu G agarózový pre ďalšie 1 h.
• Umyte agarózový pelety trikrát s IP buffer. Potom extrahujte viazané bielkoviny pomocou nárazníkovej medzipamäte SDS-PAGE zahrievaním pri teplote 95 ° c počas 5 minút.

C. imunoprecipitácia

• Vezmite 200 μl bunkového lysátu a pridajte primárnu protilátku. Inkubujte jemným hojdanie cez noc pri teplote 4 ° c.
• Pridajte buď bielkoviny a alebo G agarózový korálky (20 μl 50% perličiek). Inkubujte jemným hojdanie 1 – 3 hodiny pri teplote 4 ° c.
• Mikroodstreďte po dobu 30 sekúnd pri teplote 4 ° c. Pelety umyte päťkrát s 500 μl 1X tlmivého roztoku. Majte na ľade počas umýva.
• Pelety resuspendite s 20 μl 3-násobnej vzorkovníkovej medzipamäte. Potom sa mikrocentrifúgy po dobu 30 sekúnd.
• Vzorku zohrejte na 95 – 100 ° c počas 2 – 5 minút a mikrocentrifúgy 1 minútu pri 14 000 X g.
• Vzorka sa načíta (15 – 30 μl) na gélovej strane SDS (12 – 15%).
• Analyzujte vzorku západným blotting.

Západné blot analýza s ultrasonicator UP50H

Nasledujúci protokol bol použitý v štúdii Kriebisch et al. (2011):
Celkový proteín bol izolovaný z MC3T3-E1 buniek liečených 1, 25 (OH)₂D₃ (10^{− 8} M) alebo vozidlo. Bunky boli zrolované s tlmičom obsahujúcim 50 mM tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodekylsulfát sodný (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) a 0,5% deoxycholátu sodného (Merck). Bunka lysate bol sonicated pre 2 × 10 s v cykle 1 a amplitúdy 80 s UP50H Ultrazvukový procesor (Hielscher, ultrazvukové technológie, Teltow, Nemecko). Potom sa materiál odstrehol 10 min pri 14 000 rpm a supernatant bol použitý pre západné blotting. Dvadsať päť μg bielkovín bolo varené vo vzorke tlmivého roztoku a redukčné činidlo (Invitrogen) a následne oddelené SDS-PAGE pomocou 4 – 12% polyakrylamidové gély (Invitrogen) a prevedené na nitrocelulózovej membrány (GE zdravotnej starostlivosti). Membrána bola blokovaná pre 1 h s TBS (10 mM tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) obsahujúce 1% kazeínu (Sigma-Aldrich) a 1% tris (1 M). Po zablokovaní bola membrána inkubovaná miernym agitovaním cez noc pri teplote 4 ° c s primárnou protilátkou (králik anti-ľudský CBS 1/500, vyvinutý v laboratóriu prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubácia s chren peroxidázou (HPR)-konjugovaná sekundárna protilátka (DAKO) bola vykonaná pre 1 h pri izbovej teplote. Všetky škvrny boli vyvinuté zvýšenou chemiluminescenciou (Perkin Elmer).

Literatúra/referencie