Ultrazvuková lýza na Western blotting

• Western blot je analytický postup na detekciu špecifických proteínov vo vzorke tkanivového homogenátu alebo bunkového extraktu.
• Na vykonanie Western blotu alebo meranie enzýmovej aktivity si mnohé stanovenia vyžadujú prístup k materiálom (napr. proteínom, DNA, subcelulárnym fragmentom) uzavretým v bunke.
• Sonikácia je spoľahlivá a ľahko použiteľná metóda na riadené rozrušovanie a lýzu buniek.

Ultrazvukové rozrušovanie buniek

Extrakcia proteínov z tkanív a kultivovaných buniek je prvým krokom pri mnohých biologických, biochemických a analytických technikách (PAGE, Western blotting, ELISA, hmotnostná spektrometria atď.) alebo pri purifikácii proteínov. Na dosiahnutie vysokej výťažnosti proteínov sa bunkový materiál a tkanivo musia účinne rozrušiť/lyzovať. Či už ide o rastlinnú bunku alebo živočíšne tkanivo, sonikácia je metódou na jednoduchú a rýchlu prípravu bunkového lyzátu.

Výhody sonikácie

• rýchla a účinná
• jednoduchá obsluha
• vysoká výťažnosť proteínov
• reprodukovateľná/ opakovateľná
• presne riadená
• škálovateľná

Imunoprecipitačný protokol pre Western imunoblotting

A. Reagencie

Na prípravu roztokov používajte čistenú vodu, napríklad Milli-Q.

• 1X fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS)
• 1X pufor na lýzu buniek: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pyrofosforečnan sodný, 1 mM β-glycerofosfát, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptín
  Dôležité: Bezprostredne pred použitím pridajte 1 mM PMSF.
• Na IP postačuje 15 μl proteínu A+15 μl proteínu G, môže to však závisieť od vašej primárnej protilátky a objemu vzorky. Môžete použiť aj vopred pripravenú zmes agarózy s proteínom A/ G (napr. proteín A na vychytávanie králičieho IgG a proteín G na vychytávanie myšieho IgG)
• 3X vzorkový pufor SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 pri 25°C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v brómfenolová modrá

B. Príprava bunkových lyzátov

• Zozbierajte bunky. Ak chcete bunky zozbierať za nedenaturačných podmienok, odstráňte médium a bunky raz opláchnite ľadovo studeným PBS.
• Odstráňte PBS, do každej misky (10 cm) pridajte 0,5 ml ľadovo studeného 1X pufra na lýzu buniek a misky inkubujte na ľade 5 minút.
• Zoškrabte bunky z misiek a preneste ich do mikrocentrifugačných skúmaviek. Uchovávajte na ľade.
• Sonikujte dvakrát po 10 sekúnd v ľadovo studenom imunoprecipitačnom pufri (IP pufor: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 a zmes inhibítorov proteáz). Na sonikáciu je najvhodnejší VialTweeter alebo sondový ultrazvukový prístroj, ako je UP100H alebo UP200Ht .
• Lyzáty centrifugujte pri 15 000 g počas 10 minút pri 4°C.
• Preneste supernatant do novej skúmavky. (V prípade potreby možno lyzát skladovať pri –80°C.)
• Pridajte do supernatantu primárnu protilátku. Supernatant s primárnou protilátkou sa inkubuje 1 h pri 4°C za mierneho miešania. Primárna protilátka sa zvyčajne pridáva v množstve s 10x vyššou koncentráciou, než sa používa pri Western blottingu. (Môžete začať s 1μg na 100μL.)
• Supernatant sa potom ďalej inkubuje so zmesou rovnakých množstiev agarózy s proteínom A (Invitrogen) a agarózy s proteínom G počas ďalšej 1 h.
• Agarózové pelety trikrát premyte IP pufrom. Potom extrahujte naviazané proteíny nanášacím pufrom SDS-PAGE zahrievaním pri 95°C počas 5 minút.

C. Imunoprecipitácia

• Odoberte 200 μl bunkového lyzátu a pridajte primárnu protilátku. Inkubujte za jemného kolísania cez noc pri 4°C.
• Pridajte agarózové guľôčky s proteínom A alebo G (20 μl 50% suspenzie guľôčok). Inkubujte za jemného kolísania 1–3 hodiny pri 4°C.
• Centrifugujte v mikrocentrifúge 30 sekúnd pri 4°C. Peletu päťkrát premyte 500 µl 1X pufra na lýzu buniek. Počas premývania uchovávajte na ľade.
• Resuspendujte peletu v 20 μl 3X vzorkového pufra SDS. Premiešajte na vortexe a potom centrifugujte v mikrocentrifúge 30 sekúnd.
• Zahrejte vzorku na 95–100°C na 2–5 minút a centrifugujte v mikrocentrifúge 1 minútu pri 14 000 X g.
• Naneste vzorku (15–30 μl) na gél SDS-PAGE (12–15%).
• Analyzujte vzorku pomocou Western blottingu.

Analýza Western blot pomocou sonikátora UP50H

Nasledujúci protokol využívajúci sondový sonikátor UP50H bol použitý v štúdii Kriebisch a kol. (2011):
Celkové proteíny boli izolované z buniek MC3T3-E1 ošetrených 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) alebo vehikulom. Bunky boli lyzované pufrom obsahujúcim 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecylsulfát sodný (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) a 0,5% deoxycholát sodný (Merck). Bunkový lyzát bol sonikovaný počas 2 × 10 s pri cykle 1 a amplitúde 80 pomocou ultrazvukového procesora UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Nemecko). Následne bol materiál centrifugovaný 10 min pri 14 000 rpm a supernatant bol použitý na Western blotting. Dvadsaťpäť μg proteínov bolo povarených vo vzorkovom pufri a redukčnom činidle (Invitrogen) a následne separovaných pomocou SDS-PAGE na 4–12% polyakrylamidových géloch (Invitrogen) a prenesených na nitrocelulózovú membránu (GE health care). Membrána bola blokovaná 1 h pomocou TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) obsahujúceho 1% kazeín (Sigma-Aldrich) a 1% Tris (1 M). Po blokovaní bola membrána inkubovaná za mierneho miešania cez noc pri 4°C s primárnou protilátkou (králičia protilátka proti ľudskej CBS 1/500, vyvinutá v laboratóriu prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubácia so sekundárnou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou (HPR) (Dako) prebiehala 1 h pri izbovej teplote. Všetky bloty boli vizualizované pomocou zosilnenej chemiluminiscencie (Perkin Elmer).
 

Kliknite sem a prečítajte si viac o osvedčených postupoch pri ultrazvukovej lýze a extrakcii buniek, príprave lyzátov a odporúčaniach na zlepšenie procesu!
 
Nasledujúca tabuľka poskytuje predstavu o približnej spracovateľskej kapacite našich laboratórnych ultrazvukových prístrojov:

Literatúra / Referencie

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.