Príprava vzoriek pomocou ultrazvukového filtra (FASP): vylepšenie proteomických pracovných postupov pomocou pokročilej sonikácie
Príprava vzoriek pomocou ultrazvukového filtra (FASP) sa stáva vysoko účinnou a reprodukovateľnou metódou v modernej proteomike. Integráciou riadenej sonikácie do zavedených pracovných postupov FASP môžu výskumníci výrazne zlepšiť extrakciu proteínov, účinnosť trávenia a celkovú kvalitu údajov. S rastúcim dopytom po vysoko výkonnej a reprodukovateľnej príprave vzoriek získavajú cielené sonikátory, ako je mikrotitračný sonikátor UIP400MTP, vedecký a praktický význam.
Vedecký kontext: Prečo je FASP dôležitý v proteomike
Filtrom podporovaná príprava vzoriek (FASP) sa stala zlatým štandardom v proteomike zdola nahor vďaka svojej schopnosti odstrániť detergenty, soli a iné kontaminanty a zároveň umožniť účinné enzymatické trávenie. Klasické protokoly FASP však často čelia obmedzeniam súvisiacim s neúplnou lýzou, nekonzistentným rozkladom a variabilitou vzoriek. – najmä pri práci so zložitými alebo pružnými biologickými bunkami alebo tkanivami.
Práve tu poskytuje rozhodujúcu výhodu cielená ultrazvuková energia (sonikácia). Zavedením mechanických strihových síl a kavitácie sonikácia zlepšuje viaceré kritické kroky v pracovnom postupe FASP bez toho, aby sa narušila integrita proteínov.
Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP uľahčuje prípravu vzoriek pomocou filtra (FASP)
Pozitívne účinky sonikácie pri ultrazvukovej FASP
Sonikácia zavádza riadenú akustickú kavitáciu – tvorba a kolaps mikroskopických bublín – čo spôsobuje lokálne strihové sily a mikroprúdenie.
Sonikácia zlepšuje alkylačné aj rozkladné kroky pri ultrazvukovej FASP tým, že zlepšuje prenos hmoty a urýchľuje reakčnú kinetiku. Aplikácia ultrazvukovej energie vytvára kavitáciu, čo vedie k lokalizovanému mikropretoku a prechodným strihovým silám, ktoré podporujú rýchle miešanie a účinné prenikanie činidiel do proteínovej matrice alebo prostredia filtra. Počas alkylácie to vedie k rovnomernejšej a rýchlejšej modifikácii cysteínových zvyškov jodoacetamidom. V štiepiacom kroku sonikácia zvyšuje dostupnosť proteolytických štiepnych miest a zlepšuje interakcie medzi enzýmom a substrátom, čím urýchľuje aktivitu trypsínu a zvyšuje účinnosť štiepenia. Celkovo ultrazvuková úprava skracuje čas spracovania pri zachovaní alebo zlepšení úplnosti a reprodukovateľnosti reakcie.
Pri príprave proteomických vzoriek sa ultrazvuková FASP premieta do:
- Účinnejšie rozrušovanie buniek a extrakcia bielkovín, dokonca aj v náročných tkanivách alebo mikrobiálnych vzorkách
- Zvýšená solubilizácia proteínov
- Lepšia dostupnosť enzýmov počas trávenia
- Skrátenie času spracovania a zvýšenie reprodukovateľnosti
Na rozdiel od konvenčných mechanických alebo chemických metód lýzy je ultrazvukové spracovanie vysoko kontrolovateľné a škálovateľné, vďaka čomu je obzvlášť vhodné pre štandardizované proteomické pracovné postupy.
UIP400MTP nie je ultrazvukový kúpeľ. Je to vysoko intenzívny pohárový roh pre sústredenú sonikaciu. Tento výkonný bezkontaktný sonikátor poskytuje rovnomernú sonikáciu vo všetkých jamkách vašej štandardnej jamky. Máte presnú kontrolu nad amplitúdou, výkonom a pulzovaním. Vstavaný časovač a teplotná sonda zaisťujú konzistentné výsledky. UIP400MTP doskový sonikátor chladí vzorky vodným kúpeľom (voliteľný externý chladič).
Výhody ultrazvukovej FASP oproti konvenčným prístupom
Integrácia sonikácie do protokolov FASP poskytuje merateľné výhody, ktoré priamo ovplyvňujú výsledky následnej hmotnostnej spektrometrie.
Ultrazvuková FASP umožňuje úplnejšie obnovenie proteínov, najmä z náročných vzoriek, ako sú vláknité tkanivá alebo biofilmy. Rovnomerné rozloženie energie zabezpečuje konzistentné ošetrenie všetkých replikátov, čím sa znižuje variabilita – základná požiadavka pre kvantitatívnu proteomiku.
Okrem toho sonikácia urýchľuje kinetiku trávenia tým, že zlepšuje interakciu enzýmu so substrátom. To často vedie ku kratšiemu času trávenia a vyššiemu výťažku peptidov pri zachovaní pokrytia sekvencie.
Z hľadiska pracovného postupu ultrazvukové systémy znižujú počet manuálnych zásahov a eliminujú potrebu agresívnych chemických úprav, čím zachovávajú integritu vzorky a zjednodušujú štandardizáciu protokolu.
Vennov diagram znázorňujúci zvýšený počet identifikovaných proteínov pomocou ultrazvukovej FASP v porovnaní s nočnou FASP
Obrázok a štúdia: ©Carvalho et al., 2020
Sonikátor UIP400MTP na prípravu vzoriek pomocou filtra (FASP)
Protokol: Vysoko výkonná ultrazvuková FASP s UIP400MTP
Mikrotitračný sonikátor UIP400MTP pre laboratóriá, ktoré spracovávajú veľké súbory vzoriek, umožňuje súčasnú sonikáciu štandardných viacjamkových platní (napr. 96jamkových platní), čím sa výrazne zvyšuje výkonnosť a reprodukovateľnosť.
V tomto formáte sa vzorky (zvyčajne 50-200 µl na jamku) pripravujú priamo v mikrotitračných platničkách kompatibilných s ultrafiltráciou alebo následným spracovaním. Lyzačné pufre sú podobné tým, ktoré sa používajú v štandardných protokoloch FASP.
UIP400MTP aplikuje rovnomernú ultrazvukovú energiu vo všetkých jamkách. Sonikácia sa zvyčajne vykonáva pri amplitúde 60 - 80 % počas 2 - 4 minút v závislosti od typu vzorky. Monitorujte teplotu pomocou pripojiteľného snímača teploty. Používanie pulznej sonikácie a voliteľne laboratórneho chladiča.
Príklad protokolu:
- Pri kroku alkylácie sa vzorky sonikujú pomocou mikrotitračného sonikátora (UIP400MTP) pri 40 % amplitúde počas 7 cyklov (30 s ON, 15 s OFF; celkový čas sonikácie: 5 min 45 s).
- Po sonikácii sa roztok jodoacetamidu (IAA) odstráni odstredením. Pred trávením trypsínom sa vzorky musia premyť, aby sa odstránili zvyšky močoviny, silného chaotropného činidla, ktoré inhibuje enzymatickú aktivitu. Preto sa vzorky dvakrát premyjú 200 μl 25 mM hydrogenuhličitanu amónneho (AmBic).
- Následne sa pridá 100 μl roztoku trypsínu (pomer enzýmu k proteínu 1:30) pripraveného v 12,5 mM hydrogenuhličitane amónnom. Potom sa vykoná trávenie proteínov pomocou UIP400MTP za rovnakých podmienok sonikácie (40 % amplitúda, 7 cyklov, 30 s ON / 15 s OFF; celkový čas: 5 min 45 s).
- Po sonikácii sa vzorky prenesú na filtračné platne alebo sa spracujú pomocou systémov FASP založených na platniach. Redukčné a alkylačné kroky sa vykonávajú priamo na platni, čím sa zachováva zjednodušený pracovný postup.
- Trávenie trypsínom sa vykonáva za kontrolovaných podmienok (napr. 37 °C, 4-16 hodín) s možnosťou krátkej stimulácie ultrazvukom na urýchlenie enzymatickej aktivity a zlepšenie výťažku peptidov.
- Peptidy sa získajú centrifugáciou a sú pripravené na LC-MS/MS analýzu.
Kľúčová výhoda tohto systému spočíva v jeho schopnosti zabezpečiť identické podmienky spracovania vo všetkých jamkách, čím sa minimalizujú dávkové efekty a umožňujú sa spoľahlivé kvantitatívne porovnania v rozsiahlych proteomických štúdiách.
Sonikátor VialTweeter s viacerými trubicami urýchľuje a zlepšuje prípravu vzoriek pomocou filtra (FASP) v proteomike
Vedecký význam
Integrácia sonikácie do pracovných postupov FASP nie je len technickým zdokonalením – predstavuje metodický pokrok v príprave proteomických vzoriek. Keďže táto oblasť smeruje k vyššej výkonnosti, automatizácii a reprodukovateľnosti, ultrazvukové technológie riešia základné prekážky pri spracovaní vzoriek.
Nedávne štúdie čoraz viac zdôrazňujú význam dôslednej prípravy vzoriek pre spoľahlivé objavovanie biomarkerov a kvantitatívnu proteomiku. Ultrazvuková FASP priamo prispieva k tomuto cieľu zlepšením účinnosti extrakcie, konzistencie trávenia a celkovej robustnosti pracovného postupu.
Okrem toho je škálovateľnosť ultrazvukových systémov – od jednotlivých fľaštičiek s VialTweeterom až po celé mikroplatničky s UIP400MTP – je v súlade s rastúcim dopytom po prieskumných aj rozsiahlych kohortových proteomických štúdiách.
Získajte sonický prístroj na uľahčenie pracovného postupu FASP!
Príprava vzoriek pomocou ultrazvukového filtra kombinuje osvedčené prednosti FASP s fyzikálnymi výhodami sonikácie. Ultrazvukové systémy, ktoré zlepšujú lýzu, trávenie a štandardizujú pracovné postupy, ponúkajú výkonné riešenie pre modernú proteomiku.
Sonikátor Multi-Tube Sonicator VialTweeter a sonikátor na mikrotitračné platne UIP400MTP sú príkladom toho, ako môže cielená ultrazvuková energia zmeniť rutinnú prípravu vzoriek na efektívnejší, reprodukovateľnejší a vedecky spoľahlivejší proces. – čo v konečnom dôsledku vedie k vyššej kvalite proteomických údajov a hlbším biologickým poznatkom.
Výber najvhodnejšieho sonikátora pre prípravu vzoriek pomocou filtra
| Model Sonicator | Výhody pre FASP | Najlepšie využitie |
| UIP400MTP sonikátor mikrodoštičiek | Rovnomerná sonikácia na celej mikrotitračnej platni; vysoko reprodukovateľný príkon energie; urýchľuje alkyláciu a enzymatické štiepenie vo vysoko výkonných pracovných postupoch; kompatibilný s automatizovanou prípravou vzoriek. | Vysoko výkonné pracovné postupy FASP v 96-jamkových alebo podobných formátoch platní vrátane aplikácií na skríning proteomiky. |
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator | Súčasná, rovnomerná sonikácia viacerých uzavretých skúmaviek; minimalizuje krížovú kontamináciu a stratu vzorky; zlepšuje prenikanie činidla a miešanie, čím zvyšuje účinnosť alkylácie a rozkladu. | Paralelné spracovanie viacerých vzoriek FASP so strednou priepustnosťou a vysokou reprodukovateľnosťou. |
| Cuphorn (nepriama sonikácia “vysoko intenzívny kúpeľ” pre uzavreté rúrky) | Vysoko intenzívna nepriama sonikácia pre uzavreté nádoby; vynikajúca kontrola teploty a spracovanie bez kontaminácie; podporuje účinný prenos hmoty bez priameho kontaktu so sondou. | Spracovanie vzoriek v rôznych nádobách na vzorky / citlivých alebo nebezpečných vzoriek, ktoré si vyžadujú uzavreté nádoby a konzistentnú distribúciu energie. |
| Sondy typu sondy (priama sonikácia) | Maximálna intenzita ultrazvuku a prenos energie; rýchle narušenie a urýchlenie reakcie; účinné pri ťažko stráviteľných alebo veľmi zložitých vzorkách bielkovín. | Spracovanie jednej vzorky, väčších vzoriek alebo náročných matríc, kde sa vyžaduje maximálny výkon a rýchlosť. |
Dizajn, výroba a poradenstvo – Kvalita vyrobená v Nemecku
Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojou najvyššou kvalitou a dizajnovými štandardmi. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných zariadení. Drsné podmienky a náročné prostredie ľahko zvládnu ultrazvukové prístroje Hielscher.
Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a užívateľskou prívetivosťou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.
často kladené otázky
Na čo sa používa príprava vzoriek pomocou filtra?
Príprava vzoriek pomocou filtra (FASP) sa používa na prípravu proteínových vzoriek na proteomickú analýzu založenú na hmotnostnej spektrometrii. Umožňuje účinné odstránenie detergentov, solí a iných nízkomolekulových kontaminantov, pričom proteíny zostávajú na filtri s hraničnou molekulovou hmotnosťou, kde sa môžu denaturovať, redukovať, alkylovať a enzymaticky štiepiť na peptidy vhodné na LC-MS/MS analýzu.
Aké sú výhody FASP v proteomike?
Hlavnou výhodou FASP v proteomike je schopnosť spracovať komplexné vzorky bohaté na detergenty a zároveň produkovať vysoko čisté zmesi peptidov kompatibilné s hmotnostnou spektrometriou. Zlepšuje účinnosť a reprodukovateľnosť trávenia tým, že reakcie prebiehajú v obmedzenom prostredí filtra, znižuje straty vzoriek v porovnaní s metódami založenými na precipitácii a umožňuje účinnú výmenu pufrov. FASP celkovo zvyšuje výťažnosť peptidov, kvalitu údajov a pokrytie proteómu, čím sa stáva robustným a široko používaným pracovným postupom v proteomike zdola nahor.
Literatúra / Referencie
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Bezkontaktný sonikátor UIP400MTP uľahčuje FASP v 96-jamkových platniach
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratórium do priemyselná veľkosť.