Ultrazvuková príprava vzoriek pomocou filtra (FASP): zlepšenie proteomických pracovných postupov pokročilou sonikáciou

Ultrazvuková príprava vzoriek pomocou filtra (FASP) sa v modernej proteomike presadzuje ako vysoko účinná a reprodukovateľná metóda. Začlenením riadenej sonikácie do zavedených pracovných postupov FASP môžu výskumníci výrazne zlepšiť extrakciu proteínov, účinnosť štiepenia a celkovú kvalitu údajov. S rastúcim dopytom po vysokokapacitnej a reprodukovateľnej príprave vzoriek získavajú sonikátory so sústredenou ultrazvukovou energiou, ako je sonikátor pre mikrotitračné platničky UIP400MTP, čoraz väčší vedecký a praktický význam.

Vedecký kontext: prečo je FASP v proteomike dôležitá

Príprava vzoriek pomocou filtra (FASP) sa stala zlatým štandardom v proteomike typu bottom-up vďaka svojej schopnosti odstraňovať detergenty, soli a ďalšie kontaminanty a zároveň umožňovať účinné enzymatické štiepenie. Klasické protokoly FASP však často narážajú na obmedzenia súvisiace s neúplnou lýzou, nekonzistentným štiepením a variabilitou vzoriek – najmä pri práci s komplexnými alebo odolnými biologickými bunkami či tkanivami.
Práve tu prináša sústredená ultrazvuková energia (sonikácia) rozhodujúcu výhodu. Vyvolaním mechanických šmykových síl a kavitácie sonikácia zlepšuje viaceré kľúčové kroky pracovného postupu FASP bez narušenia integrity proteínov.

Pozitívne účinky sonikácie pri ultrazvukovej FASP

Sonikácia vyvoláva riadenú akustickú kavitáciu – vznik a kolaps mikroskopických bublín – ktorá vytvára lokálne šmykové sily a mikroprúdenie.
Sonikácia zlepšuje kroky alkylácie aj štiepenia pri ultrazvukovej FASP tým, že zlepšuje prenos hmoty a urýchľuje reakčnú kinetiku. Pôsobenie ultrazvukovej energie vyvoláva kavitáciu, ktorá vedie k lokálnemu mikroprúdeniu a prechodným šmykovým silám podporujúcim rýchle miešanie a účinné prenikanie reagencií do proteínovej matrice alebo prostredia filtra. Počas alkylácie to vedie k rovnomernejšej a rýchlejšej modifikácii cysteínových zvyškov jódacetamidom. V kroku štiepenia sonikácia zvyšuje prístupnosť miest proteolytického štiepenia a zlepšuje interakcie medzi enzýmom a substrátom, čím urýchľuje pôsobenie trypsínu a zvyšuje účinnosť štiepenia. Celkovo ultrazvukové spracovanie skracuje čas spracovania a zároveň zachováva alebo zlepšuje úplnosť a reprodukovateľnosť reakcií.

Pri príprave vzoriek na proteomickú analýzu ultrazvuková FASP prináša:

• Účinnejšie rozrušenie buniek a extrakciu proteínov, a to aj v odolných tkanivách alebo mikrobiálnych vzorkách
• Lepšiu solubilizáciu proteínov
• Lepší prístup enzýmov počas štiepenia
• Kratší čas spracovania a vyššiu reprodukovateľnosť

Na rozdiel od konvenčných mechanických alebo chemických metód lýzy je ultrazvukové spracovanie veľmi dobre regulovateľné a škálovateľné, vďaka čomu je obzvlášť vhodné pre štandardizované proteomické pracovné postupy.

Výhody ultrazvukovej FASP oproti konvenčným prístupom

Začlenenie sonikácie do protokolov FASP prináša merateľné výhody, ktoré priamo ovplyvňujú výsledky následnej hmotnostnej spektrometrie.
Ultrazvuková FASP umožňuje úplnejšie získanie proteínov, najmä z náročných vzoriek, ako sú vláknité tkanivá alebo biofilmy. Rovnomerné rozloženie energie zabezpečuje konzistentné spracovanie replikátov, čím znižuje variabilitu – čo je základnou požiadavkou kvantitatívnej proteomiky.
Sonikácia navyše urýchľuje kinetiku štiepenia zlepšením interakcie medzi enzýmom a substrátom. To často vedie ku kratšiemu času štiepenia a vyššiemu výťažku peptidov pri zachovaní pokrytia sekvencie.
Z hľadiska pracovného postupu ultrazvukové systémy znižujú potrebu manuálnych zásahov a odstraňujú potrebu agresívneho chemického spracovania, čím zachovávajú integritu vzoriek a zjednodušujú štandardizáciu protokolov.

Vennov diagram znázorňujúci zvýšený počet proteínov identifikovaných ultrazvukovou FASP v porovnaní s FASP vykonávanou cez noc
Obrázok a štúdia: ©Carvalho et al., 2020

Protokol: Ultrazvuková FASP s vysokou priepustnosťou vzoriek pomocou UIP400MTP

Laboratóriám, ktoré spracúvajú veľké súbory vzoriek, umožňuje sonikátor pre mikrotitračné platničky UIP400MTP súčasnú sonikáciu štandardných viacjamkových platničiek (napr. 96-jamkových platničiek), čím výrazne zvyšuje priepustnosť vzoriek a reprodukovateľnosť.
V tomto formáte sa vzorky (zvyčajne 50–200 µL na jamku) pripravujú priamo v mikrotitračných platničkách kompatibilných s ultrafiltráciou alebo následným spracovaním. Lyzačné pufre sú podobné tým, ktoré sa používajú v štandardných protokoloch FASP.

UIP400MTP privádza ultrazvukovú energiu rovnomerne do všetkých jamiek. Sonikácia sa zvyčajne vykonáva pri 60–80% amplitúde počas 2–4 minút v závislosti od typu vzorky. Teplotu sledujte pomocou pripojiteľného snímača teploty. Používajte pulznú sonikáciu a voliteľne aj laboratórny chladič.

Príklad protokolu:

1. V kroku alkylácie sa vzorky sonikujú pomocou sonikátora pre mikrotitračné platničky (UIP400MTP) pri 40% amplitúde počas 7 cyklov (30 s zapnuté, 15 s vypnuté; celkový čas sonikácie: 5 min 45 s).
2. Po sonikácii sa roztok jódacetamidu (IAA) odstráni centrifugáciou. Pred štiepením trypsínom sa vzorky musia premyť, aby sa odstránila zvyšková močovina, silné chaotropné činidlo, ktoré inhibuje enzymatickú aktivitu. Vzorky sa preto dvakrát premyjú 200 μL 25 mM hydrogénuhličitanu amónneho (AmBic).
3. Následne sa pridá 100 μL roztoku trypsínu (pomer enzýmu k proteínu 1:30) pripraveného v 12.5 mM hydrogénuhličitane amónnom. Štiepenie proteínov sa potom vykonáva pomocou UIP400MTP za rovnakých podmienok sonikácie (40% amplitúda, 7 cyklov, 30 s zapnuté / 15 s vypnuté; celkový čas: 5 min 45 s).
4. Po sonikácii sa vzorky prenesú do filtračných platničiek alebo sa spracujú pomocou systémov FASP využívajúcich platničky. Kroky redukcie a alkylácie sa vykonávajú priamo v platničke, čím sa zachováva efektívny pracovný postup.
5. Štiepenie trypsínom sa vykonáva za kontrolovaných podmienok (napr. 37°C, 4–16 hodín) s možnosťou krátkej ultrazvukovej stimulácie na urýchlenie enzymatickej aktivity a zvýšenie výťažku peptidov.
6. Peptidy sa získajú centrifugáciou a sú pripravené na analýzu LC-MS/MS.

Kľúčová výhoda tohto systému spočíva v jeho schopnosti zabezpečiť identické podmienky spracovania vo všetkých jamkách, čím sa minimalizujú rozdiely medzi šaržami a umožňujú sa robustné kvantitatívne porovnania v rozsiahlych proteomických štúdiách.

Návrh, výroba a poradenstvo – kvalita vyrobená v Nemecku

Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe najvyššími štandardmi kvality a konštrukcie. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných prevádzok. Ultrazvukové prístroje Hielscher ľahko zvládajú drsné podmienky a náročné prostredia.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a jednoduchým používaním. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s požiadavkami CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.

Literatúra / Referencie

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).