Proteomické pracovné postupy s vysokovýkonným trávením bielkovín

Proteomika je základnou oblasťou na pochopenie biologických procesov a systémov, pričom trávenie bielkovín tvorí kritický krok v jej pracovných postupoch. Tradične sa trávenie bielkovín uskutočňuje v roztoku pomocou proteolytických enzýmov, ako je trypsín, ktorý špecificky hydrolyzuje peptidové väzby na zvyškoch lyzínu a arginínu. Tento proces vytvára peptidy vhodné na ionizáciu a fragmentáciu v aplikáciách hmotnostnej spektrometrie (MS). Konvenčné metódy trávenia však vyžadujú 12 až 24 hodín na dokončenie, čo vytvára významné prekážky v proteomických pracovných postupoch.
Ultrazvuk ponúka účinnú alternatívu, ktorá dramaticky skracuje čas trávenia z hodín na niekoľko minút. V kombinácii s pokročilými multivzorkovými sonikátormi, ako sú Hielscher CupHorn, VialTweeter a 96-jamkový sonikátor UIP400MTP, ultrazvuk umožňuje zrýchlenú a vysokovýkonnú proteomiku. Tieto technológie zefektívňujú pracovné postupy, skracujú čas prípravy vzoriek a zvyšujú efektivitu bez toho, aby bola ohrozená reprodukovateľnosť alebo kvalita údajov.

Úloha ultrazvukovej energie pri trávení bielkovín

Ultrazvuk využíva sústredené ultrazvukové vlny na vytvorenie kavitácie – lokalizovaných mikrobublín, ktoré sa zrútia a vytvoria intenzívne šmykové sily. Tento jav zvyšuje prenos hmoty, podporuje miešanie enzýmov so substrátmi a rozvíja proteínové štruktúry, čím vystavuje miesta štiepenia proteolytickým enzýmom, ako je trypsín.
Výsledok? Výrazné skrátenie času trávenia bez ohrozenia účinnosti alebo reprodukovateľnosti.

Ultrazvukom vylepšená proteolytická trávenie: metodológia a výsledky

Protokol o zrýchlenom trávení

Ultrazvukom asistované trávenie kombinuje proteolytické enzýmy a ultrazvukovú energiu na urýchlenie pracovných postupov. Napríklad pri použití Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) prebieha pracovný postup rozkladu nasledovne:

1. Redukcia: Vzorky bielkovín (0,5 mg/ml, 20 μl) sa spracujú DTT (2 μl, 110 mM) v hydrogenuhličitanovom tlmive amónnym (12,5 mM). Sonikácia sa aplikuje pri 50% amplitúde po dobu 5 minút.
2. Alkylácia: Po pridaní IAA (2 μL, 400 mM) sa sonikácia opakuje za rovnakých podmienok.
3. Trávenie: Vzorky sa zriedia a inkubujú s imobilizovanými nanočasticami trypsínu. Posledné kolo sonikácie (5 minút) dokončí trávenie. Peptidy sa oddeľujú, sušia a ukladajú na analýzu SM.

Táto ultrazvuková metóda skracuje celkový čas prípravy z 12 hodín na menej ako 30 minút. Napriek zrýchlenému procesu zostáva výťažok a kvalita peptidov v súlade s tradičnými metódami cez noc.

Účinnosť ultrazvukového trávenia bielkovín

V porovnávacích štúdiách s použitím proteómov E. coli:

• Identifikácia proteínov: Ultrazvukom strávené vzorky identifikovali 777 proteínov za 5 minút v porovnaní s 817 za 12 hodín. Spoločná identifikácia proteínov presiahla 70 %.
• Reprodukovateľnosť: Opakované analýzy ukázali hodnoty korelácie nad 98 % v rámci každej metódy, čo preukázalo spoľahlivosť.
• Selektívnosť: Niektoré proteíny boli prednostne trávené každou metódou, pričom ultrazvukové trávenie uprednostňovalo 65 bielkovín a nočné trávenie 54 proteínov. Takéto rozdiely zdôrazňujú jedinečný potenciál ultrazvuku pre špecifické aplikácie.

Výsledky kvantifikácie proteínov bez označenia siedmich proteínov obohatených do E. coli
vzorka. Nasledujúce proteíny boli pridané na dvoch rôznych úrovniach, ako je uvedené v stĺpci
pomenovaný ako "Theo Ratio". Theov pomer je teoretický pomer medzi dvoma úrovňami použitými v tomto
experiment. Hovädzí sérový albumín (ALBU), β-laktoglobulín (LACB), kazeín α-S1 (CASA1),
α-S2 kazeín (CASA2), cytochróm c (CYC), ovalbumín (OVAL) a karboanhydráza 2
(CAH2). Pomery boli vypočítané pomocou intenzity proteínu LFQ získaných z MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Štúdia a grafika: © Martins et al., 2019)

Trypsín imobilizovaný nanočasticami

Integrácia imobilizovaných nanočastíc trypsínu (napr. T-FMNP) s ultrazvukom ďalej zlepšuje proteomické pracovné postupy. Tieto nanočastice poskytujú veľkú povrchovú plochu pre interakcie enzým-substrát, čím sa zvyšuje účinnosť. Pri aplikácii na komplexné proteómy, ako je E. coli, kombinovaná metóda dosahuje:

• Rýchlosť: Kompletné trávenie do 5 minút.
• Presnosť: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Škálovateľnosť: Prispôsobenie sa platformám s viacerými jamkami, ako je UIP400MTP, umožňuje vysokovýkonné spracovanie.

Kliknutím sem zobrazíte podrobný protokol s podrobnými pokynmi!
(porovnaj Martins a kol., 2019)

Proteolytická digescia vysokou rýchlosťou a vysokým výkonom pomocou Hielscherových sonikátorov

Najlepšie modely sonikátorov pre proteomiku

Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne modely sonikátorov na simultánnu prípravu viacerých vzoriek, čo uľahčuje vysokovýkonné pracovné postupy. Či už pracujete s injekčnými liekovkami, skúmavkami, viacjamkovými platničkami (napr. 6-, 24-, 96-jamkovými platňami) alebo Petriho miskami – Ponúkame vám ideálne sonikátory pre vaše experimenty.

UIP400MTP viacjamkový doštičkový sonikátor

Pre maximálnu priepustnosť poskytuje UIP400MTP schopnosť ultrazvukovo spracovať 96-jamkové platne. Kompatibilný s akoukoľvek štandardnou mikroplatničkou, UIP400MTP nevyžaduje drahé patentované jednorazové výrobky a dáva vám slobodu vybrať si najlepšiu viacjamkovú platňu pre váš výskum. Dodávaním rovnomernej energie po celej platni umožňuje rýchlu redukciu, alkyláciu a trávenie až 200 komplexných proteómov len za 1 hodinu. Táto úroveň automatizácie a efektívnosti je rozhodujúca pre vysokovýkonnú proteomiku a klinické aplikácie. Zistite viac o viacjamkovom doštičkovom sonikátore!

VialTweeter

VialTweeter je prispôsobený pre laboratóriá, ktoré vyžadujú súčasnú sonikáciu až 10 injekčných liekoviek alebo skúmaviek. Jeho neinvazívny prístup eliminuje riziká krížovej kontaminácie a zároveň zabezpečuje reprodukovateľné trávenie bielkovín. Toto zariadenie je ideálne pre výskumníkov pracujúcich s obmedzenými objemami vzoriek alebo rôznymi typmi vzoriek.
Zistite viac o viacrúrkovom sonikátore VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikátor CupHorn je výkonné zariadenie určené na súčasné spracovanie viacerých vzoriek v uzavretých nádobách. Zaisťuje rovnomerné rozloženie ultrazvukovej energie a presnú reguláciu teploty. Schopnosť spracovať až päť vzoriek súčasne spolu s kompatibilitou so zníženými, alkylovanými a strávenými pracovnými postupmi robí z CupHorn spoľahlivý nástroj pre proteomiku založenú na MS.
Zistite viac o CupHorn SonoReactor!

Protokol krok za krokom pre proteolytickú digesciu s ultrazvukom pomocou trypsínu imobilizovaného nanočasticami

Tento protokol od Martins et al. (2019) je optimalizovaný pre rýchle trávenie proteínov pomocou ultrazvukovej energie a trypsínu imobilizovaného nanočasticami (T-FMNP). Uvedené kroky zabezpečujú účinnú redukciu, alkyláciu a proteolýzu vhodnú pre aplikácie hmotnostnej spektrometrie (MS).
Kroky protokolu

1. Redukcia disulfidových väzieb
   • Pridajte 2 μl roztoku DTT (110 mM) do vzorky 20 μl proteínu (0,5 mg/ml) v tlmivom roztoku AmBic.
   • Umiestnite skúmavku na vzorky do sonoreaktora UP200St-CupHorn.
   • Vzorku sonikujte 2,5 minúty pri 50% amplitúde (200 W, 26 kHz).
   • Na krátky interval sa zastavte, aby sa ochladilo, a potom za rovnakých podmienok sonikujte ďalšie 2,5 minúty.
2. Alkylácia redukovaných cysteínových zvyškov
   • Pridajte 2 μl roztoku IAA (400 mM) do redukovanej vzorky bielkovín.
   • Sonikujte 2,5 minúty pri 50% amplitúde, aby sa uľahčila alkylácia.
   • Pozastavte sa na ochladenie a potom sonikujte ďalších 2,5 minúty.

   Poznámka: Minimalizujte vystavenie alkylovaného sample svetlu, aby ste zabránili degradácii IAA.

3. Riedenie vzorky
   • Vzorka alkylovaného proteínu sa zriedi na konečný objem 100 μl pomocou 25 mM tlmivého roztoku AmBic obsahujúceho 4 % acetonitrilu (v/v).
   • Dôkladne premiešajte jemným pipetovaním.
4. Proteolytické rozkladanie s trypsínom imobilizovaným nanočasticami
   • Do zriedenej vzorky bielkovín sa pridá 20 μl roztoku T-FMNP (3 mg/ml).
   • Sonikujte zmes v sonoreaktore po dobu 2,5 minúty pri 50% amplitúde.
   • Pozastavte sa na ochladenie a potom za rovnakých podmienok sonikujte ďalšie 2,5 minúty.
5. Separácia nanočastíc trypsínu
   • Pomocou magnetu oddeľte T-FMNP od supernatantu obsahujúceho strávené peptidy.
   • Preneste supernatant do novej mikroodstredivkovej skúmavky.
6. Peptidový prípravok na analýzu SM
   • Supernatant obsahujúci peptidy sa vysuší vo vákuovej odstredivke.
   • Vysušené peptidy skladujte pri teplote -20 °C až do ďalšej analýzy hmotnostnou spektrometriou.