Proteomické pracovné postupy s vysokokapacitným štiepením proteínov

Proteomika je nevyhnutnou oblasťou na pochopenie biologických procesov a systémov, pričom štiepenie proteínov predstavuje kľúčový krok v jej pracovných postupoch. Tradične sa štiepenie proteínov vykonáva v roztoku pomocou proteolytických enzýmov, ako je trypsín, ktorý špecificky hydrolyzuje peptidové väzby pri lyzínových a arginínových zvyškoch. Týmto procesom vznikajú peptidy vhodné na ionizáciu a fragmentáciu pri aplikáciách hmotnostnej spektrometrie (MS). Konvenčné metódy štiepenia však vyžadujú 12–24 hodín na úplné dokončenie, čo výrazne spomaľuje proteomické pracovné postupy.
Sonikácia ponúka účinnú alternatívu, ktorá výrazne skracuje čas štiepenia z hodín len na niekoľko minút. V kombinácii s pokročilými sonikátormi na spracovanie viacerých vzoriek, ako sú Hielscher CupHorn, VialTweeter a sonikátor na 96-jamkové platničky UIP400MTP, umožňuje sonikácia zrýchlené, vysokokapacitné proteomické analýzy. Tieto technológie zefektívňujú pracovné postupy, skracujú čas prípravy vzoriek a zvyšujú efektivitu bez zhoršenia reprodukovateľnosti alebo kvality údajov.

Úloha ultrazvukovej energie pri štiepení proteínov

Sonikácia využíva fokusované ultrazvukové vlny na vytvorenie kavitácie – lokálnych mikrobublín, ktoré pri kolapse vytvárajú intenzívne šmykové sily. Tento jav zlepšuje prenos hmoty, podporuje miešanie enzýmov so substrátmi a rozvíja proteínové štruktúry, čím sprístupňuje miesta štiepenia proteolytickým enzýmom, ako je trypsín.
Výsledok? Výrazné skrátenie času štiepenia bez zhoršenia účinnosti alebo reprodukovateľnosti.

Proteolytické štiepenie podporené ultrazvukom: metodika a výsledky

Protokol zrýchleného štiepenia

Štiepenie podporené ultrazvukom kombinuje proteolytické enzýmy a ultrazvukovú energiu na urýchlenie pracovných postupov. Napríklad pri použití Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) prebieha štiepenie takto:

1. Redukcia: Vzorky proteínov (0,5 mg/mL, 20 µL) sa ošetria DTT (2 µL, 110 mM) v hydrogénuhličitanovom amónnom tlmivom roztoku (12,5 mM). Sonikácia sa vykonáva pri 50% amplitúde počas 5 minút.
2. Alkylácia: Po pridaní IAA (2 µL, 400 mM) sa sonikácia zopakuje za rovnakých podmienok.
3. Štiepenie: Vzorky sa zriedia a inkubujú s nanočasticami s imobilizovaným trypsínom. Záverečný cyklus sonikácie (5 minút) dokončí štiepenie. Peptidy sa oddelia, vysušia a uskladnia na analýzu MS.

Táto ultrazvuková metóda skracuje celkový čas prípravy z 12 hodín na menej ako 30 minút. Napriek zrýchlenému procesu zostávajú výťažok a kvalita peptidov porovnateľné s tradičnými metódami prebiehajúcimi cez noc.

Účinnosť ultrazvukového štiepenia proteínov

V porovnávacích štúdiách s použitím proteómov E. coli:

• Identifikácia proteínov: Vo vzorkách štiepených ultrazvukom sa identifikovalo 777 proteínov za 5 minút v porovnaní s 817 proteínmi za 12 hodín. Podiel proteínov identifikovaných oboma metódami presiahol 70%.
• Reprodukovateľnosť: Opakované analýzy vykazovali v rámci každej metódy hodnoty korelácie nad 98%, čo preukazuje spoľahlivosť.
• Selektivita: Každá metóda prednostne štiepila určité proteíny, pričom ultrazvukové štiepenie uprednostňovalo 65 proteínov a štiepenie cez noc 54 proteínov. Takéto jemné rozdiely zdôrazňujú jedinečný potenciál sonikácie pre špecifické aplikácie.

Výsledky kvantifikácie proteínov bez značenia pre sedem proteínov pridaných do
vzorky E. coli. Nasledujúce proteíny sa pridali v dvoch rôznych množstvách, ako je uvedené v stĺpci
s názvom „Theo Ratio“. Theo Ratio je teoretický pomer medzi dvoma množstvami použitými v tomto
experimente. Hovädzí sérový albumín (ALBU), β-laktoglobulín (LACB), α-S1 kazeín (CASA1),
α-S2 kazeín (CASA2), cytochróm c (CYC), ovalbumín (OVAL) a karboanhydráza 2
(CAH2). Pomery sa vypočítali pomocou intenzít proteínov LFQ získaných pri analýze
v programe MaxQuant. Na porovnanie hodnôt získaných jednotlivými metódami sa použil Studentov t-test (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Štúdia a grafika: © Martins et al., 2019)

Trypsín imobilizovaný na nanočasticiach

Kombinácia nanočastíc s imobilizovaným trypsínom (napr. T-FMNPs) s ultrazvukovým ošetrením ďalej zlepšuje proteomické pracovné postupy. Tieto nanočastice poskytujú veľký povrch na interakcie medzi enzýmom a substrátom, čím zvyšujú účinnosť. Pri použití na komplexné proteómy, napríklad proteóm E. coli, kombinovaná metóda dosahuje:

• Rýchlosť: Úplné štiepenie do 5 minút.
• Presnosť: Kvantifikácia proteínov porovnateľná s tradičnými metódami (p > 0,01, n=3).
• Škálovateľnosť: Prispôsobenie platformám pre viacjamkové platničky, ako je UIP400MTP, umožňuje vysokokapacitné spracovanie.

Kliknite sem a pozrite si podrobný protokol s pokynmi krok za krokom!
(porov. Martins et al., 2019)

Proteolytické štiepenie s vysokou rýchlosťou a vysokou kapacitou spracovania vzoriek pomocou sonikátorov Hielscher

Najlepšie modely sonikátorov pre proteomiku

Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne modely sonikátorov na súčasnú prípravu viacerých vzoriek, ktoré uľahčujú vysokokapacitné pracovné postupy. Či už pracujete s vialkami, skúmavkami, viacjamkovými platničkami (napr. 6-, 24-, 96-jamkovými platničkami) alebo Petriho miskami – ponúkame vám ideálne sonikátory pre vaše experimenty.

Sonikátor UIP400MTP pre viacjamkové platničky

Na dosiahnutie najvyššej kapacity spracovania vzoriek umožňuje UIP400MTP ultrazvukové spracovanie 96-jamkových platničiek. UIP400MTP je kompatibilný s akoukoľvek štandardnou mikroplatničkou, nevyžaduje drahý jednorazový spotrebný materiál viazaný na konkrétneho výrobcu a poskytuje vám slobodu vybrať si najlepšiu viacjamkovú platničku pre váš výskum. Rovnomerným dodávaním energie naprieč celou platničkou umožňuje rýchlu redukciu, alkyláciu a štiepenie až 200 komplexných proteómov len za 1 hodinu. Táto úroveň automatizácie a účinnosti je kľúčová pre vysokokapacitnú proteomiku a klinické aplikácie. Zistite viac o sonikátore pre viacjamkové platničky!

VialTweeter

VialTweeter je prispôsobený laboratóriám, ktoré vyžadujú súčasnú sonikáciu až 10 vialiek alebo skúmaviek. Jeho neinvazívny spôsob spracovania eliminuje riziká krížovej kontaminácie a zároveň zabezpečuje reprodukovateľné štiepenie proteínov. Toto zariadenie je ideálne pre výskumníkov pracujúcich s obmedzenými objemami vzoriek alebo s rôznymi typmi vzoriek.
Zistite viac o sonikátore VialTweeter na spracovanie viacerých skúmaviek!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikátor CupHorn je výkonné zariadenie určené na súčasné spracovanie viacerých vzoriek v uzavretých nádobách. Zabezpečuje rovnomerné rozloženie ultrazvukovej energie a presnú reguláciu teploty. Možnosť súčasného spracovania až piatich vzoriek spolu s kompatibilitou s pracovnými postupmi zahŕňajúcimi redukciu, alkyláciu a štiepenie robí z CupHorn spoľahlivý nástroj pre proteomiku založenú na MS.
Zistite viac o CupHorn SonoReactor!

Protokol krok za krokom pre ultrazvukom podporované proteolytické štiepenie pomocou trypsínu imobilizovaného na nanočasticiach

Tento protokol podľa Martins et al. (2019) je optimalizovaný na rýchle štiepenie proteínov pomocou ultrazvukovej energie a trypsínu imobilizovaného na nanočasticiach (T-FMNPs). Opísané kroky zabezpečujú účinnú redukciu, alkyláciu a proteolýzu vhodnú pre aplikácie hmotnostnej spektrometrie (MS).
Kroky protokolu

1. Redukcia disulfidových väzieb
   • Pridajte 2 µL roztoku DTT (110 mM) k 20 µL vzorky proteínu (0,5 mg/mL) v pufri AmBic.
   • Umiestnite skúmavku so vzorkou do sonoreaktora UP200St-CupHorn.
   • Sonikujte vzorku 2,5 minúty pri 50% amplitúde (200 W, 26 kHz).
   • Na krátky čas prerušte sonikáciu, aby sa vzorka mohla ochladiť, a potom sonikujte ďalších 2,5 minúty za rovnakých podmienok.
2. Alkylácia redukovaných cysteínových zvyškov
   • Pridajte 2 µL roztoku IAA (400 mM) k redukovanej vzorke proteínu.
   • Sonikujte 2,5 minúty pri 50% amplitúde na uľahčenie alkylácie.
   • Prerušte sonikáciu na ochladenie a potom sonikujte ďalších 2,5 minúty.

   Poznámka: Minimalizujte vystavenie alkylovanej vzorky svetlu, aby ste zabránili degradácii IAA.

3. Riedenie vzorky
   • Zrieďte alkylovanú vzorku proteínu na konečný objem 100 µL pomocou 25 mM pufra AmBic obsahujúceho 4% acetonitrilu (v/v).
   • Dôkladne premiešajte jemným pipetovaním.
4. Proteolytické štiepenie pomocou trypsínu imobilizovaného na nanočasticiach
   • Pridajte 20 µL roztoku T-FMNP (3 mg/mL) k zriedenej vzorke proteínu.
   • Sonikujte zmes v sonoreaktore počas 2,5 minúty pri 50% amplitúde.
   • Prerušte sonikáciu, aby sa vzorka ochladila, a potom sonikujte ďalších 2,5 minúty za rovnakých podmienok.
5. Separácia nanočastíc s trypsínom
   • Pomocou magnetu oddeľte T-FMNPs od supernatantu obsahujúceho peptidy vzniknuté štiepením.
   • Preneste supernatant do novej mikrocentrifugačnej skúmavky.
6. Príprava peptidov na analýzu MS
   • Vysušte supernatant obsahujúci peptidy vo vákuovej centrifúge.
   • Vysušené peptidy skladujte pri -20°C až do ďalšej analýzy hmotnostnou spektrometriou.