Protokol v proteomike: Bezkontaktná sonikácia zlepšuje prípravu peptidových vzoriek pre MS
Proteomika typu „bottom-up“ sa stala základným kameňom moderného objavovania biomarkerov, štrukturálnej biológie a klinickej diagnostiky. Rozložením proteínov na peptidy pred analýzou hmotnostnou spektrometriou (MS) môžu výskumníci dosiahnuť hlbšie pokrytie sekvencie a spoľahlivejšie kvantifikovanie. Príprava biologických vzoriek s vysokou komplexnosťou pre MS však naďalej predstavuje technickú výzvu. Najnovšie metodické pokroky poukazujú na to, ako kontrolované ultrazvukové spracovanie – konkrétne s bezkontaktným ultrazvukovým zariadením VialTweeter Multi-Tube a ultrazvukovým zariadením pre mikrotitračné doštičky UIP400MTP – môže výrazne zefektívniť tento pracovný postup, zlepšiť reprodukovateľnosť a predísť bežným prekážkam pri práci s prístrojmi.
Nájdite si podrobný protokol na prípravu vzoriek, ktorý vám umožní získať peptidy vhodnej veľkosti pre analýzu pomocou MS.
Kto by mal pri príprave peptidových vzoriek využívať bezkontaktnú sonikáciu?
- Proteomika zdola nahor & Discovery Labs: Výskumníci, ktorí pripravujú vzorky s vysokou zložitosťou pre pracovné postupy LC-MS alebo MALDI a ktorí potrebujú konzistentnú výťažnosť peptidov s vysokým výnosom v rôznych biologických matriciach.
- S-Trap™ & Zablokovanie používateľov: Tímy, ktoré využívajú čistenie pomocou mikrostĺpcov a potrebujú kontrolované štiepenie DNA, aby sa zabránilo upchatiu stĺpca a aby sa zabezpečilo plynulé nanášanie vzoriek a ich štiepenie.
- klinický & Skupiny zaoberajúce sa translačným výskumom: Laboratóriá, ktoré spracúvajú tkanivá, bunky, plazmu, sérum alebo mozgovomiechový mok, kde je kľúčová reprodukovateľnosť medzi jednotlivými šaržami a zachovanie integrity vzoriek.
- Kvantitatívny & Cieľové skupiny v MS Teams: Laboratóriá, ktoré vykonávajú prísne porovnávacie štúdie, v ktorých sonikátory s opakovane použiteľnými sondami predstavujú riziko krížovej kontaminácie, ktoré by mohlo ohroziť kvantifikáciu peptidov s nízkou koncentráciou.
- Kľúčové zariadenia & Operácie s vysokou priepustnosťou: Skupiny, ktoré spracúvajú viacero biologických replikátov súčasne a pre ktoré je výhodné použitie zariadenia VialTweeter na sonikáciu viacerých skúmaviek v uzavretom bloku, čím sa eliminuje potreba čistenia sondy, skracuje sa čas potrebný na ručnú prácu a zachovávajú sa aseptické podmienky.
- Rodičovské stretnutie & Výskumníci v oblasti štrukturálnych proteínov: Výskumníci, ktorí potrebujú šetrné spracovanie s reguláciou teploty na zachovanie labilných modifikácií a maximalizáciu pokrytia sekvencie počas lýzy a homogenizácie buniek.
Sonikátor s viacerými vzorkami “VialTweeter” na bezkontaktnú prípravu vzoriek z viacerých uzatvorených injekčných liekoviek pre proteomiku
Prehľad protokolu: Od tkanív a buniek po peptidy pripravené na MS analýzu
Široko používaný proteomický postup typu „zdola nahor“, ktorý opísali Wojtkiewicz a kol., poskytuje spoľahlivú a škálovateľnú metódu na prípravu peptidových vzoriek z rôznych biologických matríc. Protokol, ktorý začína s 50–100 mg rýchlo zmrazeného tkaniva alebo 1–20 miliónov buniek, integruje technológiu zachytávania suspenzie (S-Trap™) na efektívne odstránenie detergentov, solí a kontaminantov pred enzymatickým štiepením.
Po lýze, kvantifikácii proteínov, redukcii a alkylácii sa vzorka okyslí a nanesie na spinovú kolónu S-Trap™, kde prebieha štiepenie trypsínom a lysC. Výsledné peptidy sa eluujú, vysušia a podrobia analýze LC-MS. Pri použití na 50 mg ľudského srdcového tkaniva tento pracovný postup konzistentne poskytuje dostatočné množstvo peptidov na 30–40 injekcií, pričom v jednom cykle identifikuje viac ako 4 000 jedinečných proteínov. Hoci chemické postupy a čistenie pomocou kolóny sú jasne definované, úspech celého postupu vo veľkej miere závisí od počiatočného fyzického rozrušenia tkaniva a krokov spojených so spracovaním DNA.
Protokol odporúča použitie ultrazvukového prístroja VialTweeter Multi-Tube Sonicator na lýzu buniek a štiepenie DNA pomocou ultrazvuku – Oba kroky sú kľúčové pre analýzu peptidov.
Prístroj VialTweeter slúži na ultrazvukovú úpravu uzavretých skúmaviek Eppendorf s objemom 1,0, 1,5 a 2,0 ml, ako aj rôznych skúmaviek NUNC
Ultrazvuková lýza buniek a tkanív na účely extrakcie bielkovín
V proteomickom pracovnom postupe typu „bottom-up“ je sonikácia kľúčovým krokom pri lýze bunkových vzoriek s cieľom extrahovať proteíny pre následnú analýzu hmotnostnou spektrometriou. Po pridaní SDS pufru na lýzu buniek k bunkovému zrazeninu sa vzorky podrobia ultrazvukovému spracovaniu pomocou sonikátora VialTweeter Multi-Tube. Protokol používa mikrocentrifúgové skúmavky s objemom 1,5 ml a stanovuje prevádzku sonikátora pri 30 % výkone v režime 10 sekúnd zapnutia a 10 sekúnd vypnutia, čo sa opakuje v 3 cykloch. Po 1 minúte čakania sa cyklus zopakuje ešte dvakrát. Vzorky sa priebežne chladia ľadom.
Tento proces nielenže prispieva k rozrušeniu buniek, ale je nevyhnutný najmä na rozštiepenie genomovej DNA uvoľnenej počas lýzy. Efektívne rozštiepenie DNA je kľúčové pre zníženie viskozity vzorky a zabránenie upchatiu kolón S-Trap™, čím sa zabezpečí optimálny výťažok proteínov a spoľahlivé následné štiepenie peptidov.
Kľúčová úloha ultrazvukového štiepenia DNA
Jednou z najčastejších porúch v pracovných postupoch založených na S-Trap™ je upchávanie kolóny, ktoré je takmer výlučne spôsobené genomovou DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou uvoľňovanou počas homogenizácie buniek alebo tkanív. Nezmenená DNA výrazne zvyšuje viskozitu vzorky, zachytáva peptidy a upcháva mikroporézne sorbentové lôžko S-Trap™.
Ultrazvukové spracovanie tento problém rieši mechanickým rozštiepením DNA na malé, rozpustné fragmenty. Vďaka pôsobeniu riadenej akustickej energie zariadenie VialTweeter efektívne štiepi nukleové kyseliny bez vytvárania nadmerného tepla alebo vnášania cudzorodých kontaminantov. Toto zníženie viskozity zaručuje plynulé vkladanie vzoriek, konzistentné prietokové rýchlosti a neprerušovanú kinetiku štiepenia.
Optimalizované parametre sonikácie zariadenia VialTweeter
Protokol stanovuje vysoko reprodukovateľný postup sonikácie, optimalizovaný s ohľadom na zachovanie integrity biologických vzoriek a kompatibilitu s následnou hmotnostnou spektrometriou (MS). V prípade vzoriek v 1,5 ml mikrocentrifúgových skúmavkách pri použití bezkontaktného blokového sonikátora Hielscher VialTweeter zabezpečujú nasledujúce parametre lýzu a optimálne štiepenie DNA pri zachovaní štruktúry bielkovín:
- Amplitúda: 30 % výkonu
- Cyklus: 10 sekúnd zapnuté / 10 sekúnd vypnuté
- Trvanie: 3 cykly (10 sekúnd zapnuté/10 sekúnd vypnuté) → 1 minúta odpočinku na ľade → zopakujte ešte 2-krát
- Regulácia teploty: Vzorky sa počas spracovania umiestňujú na ľad, aby sa zabránilo tepelnej denaturácii a predčasnej enzýmovej aktivite
Tento prístup založený na pulznej sonikácii zabraňuje lokálnemu prehriatiu, minimalizuje oxidáciu peptidov a zabezpečuje rovnomerné akustické pôsobenie na všetky injekčné liekovky. Konštrukcia s uzavretou trubicou zároveň eliminuje potrebu čistenia sondy medzi jednotlivými vzorkami, čím sa výrazne skracuje čas potrebný na ručnú obsluhu a znižuje variabilita spôsobená obsluhou.
Kľúčové výhody pre moderné proteomické pracovné postupy
Začlenenie zariadenia VialTweeter do vášho proteomického pracovného postupu typu „bottom-up“ prináša viacero prevádzkových a vedeckých výhod:
- Konzistentná fragmentácia DNA: Rovnomerné dodávanie akustickej energie do všetkých injekčných liekoviek zaručuje reprodukovateľné zníženie viskozity a zabraňuje kolísaniu pri plnení S-Trap™ medzi jednotlivými šaržami.
- Zachovanie labilných modifikácií: Spracovanie pri nízkej teplote v ľadovom kúpeli chráni posttranslačné modifikácie (PTM) a zabraňuje agregácii proteínov vyvolanej teplotou počas lýzy buniek.
- Zefektívnené následné spracovanie: Lyzáty spracované pomocou VialTweeteru je možné priamo vyčistiť centrifugáciou a kvantifikovať bez ďalších krokov čistenia, čím sa urýchli proces štiepenia pomocou S-Trap™.
- Škálovateľnosť & Flexibilita: Tieto nastavenia sonikácie platia rovnako pre tkanivové vzorky s vysokou komplexnosťou aj pre bunkové suspenzie, čím podporujú pracovné postupy v oblasti proteomiky zameranej na objavovanie, cielenú kvantifikáciu a glykoproteomiku. Sonikátory pre mikrotitrové doštičky spoločnosti Hielscher umožňujú jednoduché rozšírenie na veľký počet vzoriek v mikrotitrových doštičkách s viacerými jamkami.
Bezkontaktný ultrazvukový prístroj Multi-Tube Sonicator VialTweeter je možné prevádzkovať v chladiacich skriniach
Ultrazvukové zariadenia na prípravu proteomických vzoriek
Príprava kvalitných vzoriek peptidov pre hmotnostnú spektrometriu si vyžaduje viac než len efektívnu lýzu – vyžaduje si to presnú kontrolu nad štiepaním DNA, teplotou a prevenciou kontaminácie. Začlenením zariadenia Hielscher VialTweeter do vášho pracovného postupu proteomiky typu „bottom-up“ môžete eliminovať upchávanie S-Trap™, zabezpečiť reprodukovateľnú výťažnosť proteínov a zachovať čistotu potrebnú pre citlivé MS analýzy. Nech už spracovávate ľudské tkanivá, kultivované bunky alebo komplexné lýzáty, ultrazvukové spracovanie v blokoch poskytuje spoľahlivosť, škálovateľnosť a kontrolu procesu, ktoré vyžadujú moderné proteomické laboratóriá.
Ak chcete spracovávať väčší počet vzoriek, využite modely zameraných bezkontaktných ultrazvukových prístrojov na mikrotitračné doštičky od spoločnosti Hielscher – UIP400MTP a UIP550MTP! Spracujte akúkoľvek štandardnú mikrotitračnú doštičku s viacerými jamkami pre proteomiku s vysokou priepustnosťou!
Spracovanie v uzavretej trubici vs. tradičné ultrazvukové zariadenia so sondou
V minulosti sa výskumníci pri štiepení DNA spoliehali na ultrazvukové zariadenia s priamym kontaktom. Hoci sú tieto systémy účinné, prinášajú do proteomických pracovných postupov niekoľko zásadných obmedzení:
- Riziko krížovej kontaminácie: Opakované použitie sondy na viacerých vzorkách vedie k prenosu aerosólu a spôsobuje krížovú kontamináciu, čo skresľuje kvantitatívne výsledky MS.
- Strata vzorky: Priame vstrekovanie môže viesť k rozstreku, odparovaniu a ulpievaniu cenných peptidov na povrchu sondy.
- Čistenie: Dôkladná dekontaminácia sondy medzi jednotlivými sériami je časovo náročná a často neúplná, čo negatívne ovplyvňuje štúdie proteínov s nízkou koncentráciou.
Ultrazvukový procesor VialTweeter spracováva vzorky výlučne v uzavretých mikrocentrifúgových skúmavkách. Táto konštrukcia uzavretého systému eliminuje kontakt sondy so vzorkou, zabraňuje tvorbe aerosólu a počas celej homogenizácie a lýzy zabezpečuje prísne aseptické podmienky. Pre laboratóriá, ktoré spracúvajú vysoko komplexné tkanivové lýzaty alebo viaceré bunkové línie, to znamená čistejšie údaje z hmotnostnej spektrometrie, vyššiu výťažnosť peptidov a spoľahlivejšie biologické replikáty.
Prechod na prípravu vzoriek s vysokou priepustnosťou v multiwellových platniach
S mikrotitračnými ultrazvukovými zariadeniami modelov UIP400MTP a UIP550MTP, spracovanie skúmaviek je možné ľahko prispôsobiť na spracovanie vzoriek s vysokou priepustnosťou v akejkoľvek štandardnej multiwellovej doštičke.
Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP na vysokoúčinnú extrakciu proteínov zo vzoriek
Najčastejšie otázky týkajúce sa sonikácie pri príprave peptidových vzoriek
Prečo je pred spracovaním peptidov pomocou S-Trap™ potrebná sonikácia?
Ultrazvuková úprava je nevyhnutná na rozštiepenie genomovej DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou, ktorá sa uvoľňuje počas lýzy buniek alebo tkanív. Nezmenená DNA výrazne zvyšuje viskozitu vzorky, čo môže spôsobiť upchanie mikrokolóny S-Trap™ a zachytenie peptidov, čím sa výrazne zníži výťažnosť a kompatibilita s MS.
Ako blokový sonikátor VialTweeter zlepšuje prípravu vzoriek v porovnaní s tradičnými sondovými sonikátormi?
Na rozdiel od ultrazvukových zariadení s priamym kontaktom, ktoré si vyžadujú dôkladné čistenie medzi jednotlivými cyklami a pri ktorých hrozí prenos aerosólu, zariadenie VialTweeter spracováva vzorky výlučne v uzavretých fľaštičkách a mikrocentrifúgových skúmavkách. Táto konštrukcia s uzavretými skúmavkami eliminuje krížovú kontamináciu, zabraňuje strate vzoriek a počas homogenizácie a lýzy buniek zachováva prísne aseptické podmienky.
Aké sú optimálne parametre ultrazvukovej úpravy pri príprave vzoriek pre proteomiku?
V prípade biologických vzoriek, ako sú bunky a tkanivá, odporúčaný postup zahŕňa použitie ultrazvukového prístroja VialTweeter pri 30 % výkone s cyklom 10 sekúnd zapnutia a 10 sekúnd vypnutia, ktorý sa opakuje trikrát. Vzorky by sa počas spracovania mali uchovávať na ľade a v prípade spracovania ≥5 miliónov buniek by sa cyklus mal zopakovať ešte dvakrát. (porov. Wojtkiewicz et al., 2021)
Čo mám robiť, ak sa mi počas vkladania vzorky upchá kolóna S-Trap™?
Ucpávanie kolóny je zvyčajne spôsobené vysokou viskozitou DNA alebo nedostatočným vyjasnením. Na vyriešenie tohto problému pred pipetovaním dôkladne odstreďte lyzát a uistite sa, že DNA bola pomocou ultrazvuku dostatočne rozštiepená.
Aké výhody prináša bezkontaktná ultrazvuková úprava pre pracovné postupy v kvantitatívnej proteomike?
V kvantitatívnych štúdiách môže aj minimálna krížová kontaminácia medzi vzorkami skresliť merania peptidov s nízkou koncentráciou. Systém VialTweeter, ktorý využíva spracovanie viacerých skúmaviek v uzavretom systéme, eliminuje potrebu zavádzania sondy, zaručuje reprodukovateľnosť medzi jednotlivými šaržami a zachováva integritu vzoriek pre presné porovnávacie analýzy.
Aký výťažok bielkovín a hĺbku MS môžem očakávať pri tomto protokole?
Pri použití 50 mg ľudského srdcového tkaniva alebo 5 miliónov buniek poskytuje pracovný postup S-Trap™ zvyčajne dostatočné množstvo peptidov na 30–50 injekcií do LC-MS, pričom v každom cykle sa konzistentne identifikuje viac ako 4 000 jedinečných proteínov. (porov. Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatúra / Referencie
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics dodáva výkonné bezkontaktné ultrazvukové zariadenia na prípravu vzoriek a klinické analýzy. Ultrazvukové zariadenie pre viacjamkové platničky UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn a prietokové ultrazvukové zariadenie GDmini2 spracúvajú vzorky bez toho, aby sa ich dotýkali.