Proteomický protokol: Bezkontaktná sonikácia zlepšuje prípravu peptidových vzoriek na MS
Proteomika zdola nahor sa stala základným pilierom moderného objavovania biomarkerov, štruktúrnej biológie a klinickej diagnostiky. Štiepením proteínov na peptidy pred analýzou hmotnostnou spektrometriou (MS) môžu výskumníci dosiahnuť hlbšie pokrytie sekvencie a spoľahlivejšiu kvantifikáciu. Príprava biologických vzoriek s vysokou komplexnosťou na MS však zostáva technicky náročná. Nedávne metodické pokroky poukazujú na to, ako môže riadené ultrazvukové spracovanie – konkrétne pomocou bezkontaktného sonikátora VialTweeter na viacero skúmaviek a sonikátora UIP400MTP na mikrotitračné platničky – výrazne zefektívniť tento pracovný postup, zlepšiť reprodukovateľnosť a predchádzať bežným obmedzeniam priepustnosti prístrojov.
Nájdete tu podrobný protokol prípravy vzoriek na získanie peptidov vhodnej veľkosti na analýzu pomocou MS.
Kto by mal používať bezkontaktnú sonikáciu na prípravu peptidových vzoriek?
- Laboratóriá proteomiky zdola nahor a objavového výskumu: Výskumníci pripravujúci vzorky s vysokou komplexnosťou pre pracovné postupy LC-MS alebo MALDI, ktorí potrebujú konzistentné získavanie peptidov s vysokou výťažnosťou z rôznych biologických matríc.
- Používatelia S-Trap™ a technológie zachytávania v suspenzii: Tímy využívajúce čistenie na mikrokolónach, ktoré potrebujú riadené strihové štiepenie DNA na zabránenie upchávaniu kolón a zabezpečenie plynulého nanášania a štiepenia vzoriek.
- Skupiny klinického a translačného výskumu: Laboratóriá spracúvajúce tkanivo, bunky, plazmu, sérum alebo mozgovomiechový mok, pri ktorých sú reprodukovateľnosť medzi šaržami a integrita vzoriek kľúčové.
- Tímy kvantitatívnej a cielenej MS: Laboratóriá vykonávajúce rigorózne porovnávacie štúdie, pri ktorých sondové sonikátory prinášajú riziká krížovej kontaminácie, ktoré by mohli ohroziť kvantifikáciu peptidov s nízkym zastúpením.
- Centrálne laboratóriá a pracoviská s vysokou priepustnosťou vzoriek: Skupiny súčasne spracúvajúce viacero biologických replikátov, ktoré využívajú výhody blokovej sonikácie viacerých uzavretých skúmaviek pomocou prístroja VialTweeter, ktorá eliminuje čistenie sondy, skracuje čas manuálnej práce a zachováva aseptické podmienky.
- Výskumníci posttranslačných modifikácií (PTM) a štruktúry proteínov: Výskumníci vyžadujúci šetrné spracovanie s regulovanou teplotou na zachovanie labilných modifikácií a maximalizáciu pokrytia sekvencie počas lýzy buniek a homogenizácie.
Sonikátor na viacero vzoriek „VialTweeter“ na bezkontaktnú prípravu vzoriek vo viacerých uzavretých liekovkách na proteomické analýzy
Prehľad protokolu: Od tkaniva a buniek k peptidom pripraveným na MS
Široko používaný pracovný postup proteomiky zdola nahor, ktorý opísali Wojtkiewicz a kol., poskytuje robustnú, škálovateľnú metódu prípravy peptidových vzoriek z rôznych biologických matríc. Protokol vychádza z 50–100 mg bleskovo zmrazeného tkaniva alebo 1–20 miliónov buniek a zahŕňa technológiu zachytávania v suspenzii (S-Trap™) na účinné odstránenie detergentov, solí a kontaminantov pred enzymatickým štiepením.
Po lýze, kvantifikácii proteínov, redukcii a alkylácii sa vzorka okyslí a nanesie na centrifugačnú kolónu S-Trap™, kde prebieha štiepenie trypsínom/lysC. Výsledné peptidy sa eluujú, vysušia a podrobia analýze LC-MS. Pri použití 50 mg ľudského srdcového tkaniva tento pracovný postup konzistentne poskytuje dostatočné množstvo peptidov na 30–40 nástrekov, pričom sa pri každom analytickom behu identifikuje viac ako 4 000 jedinečných proteínov. Hoci sú chemické postupy a čistenie na kolónach dobre definované, úspech celého postupu do veľkej miery závisí od úvodných krokov fyzikálneho rozrušenia a spracovania DNA.
Protokol odporúča používať sonikátor VialTweeter na viacero skúmaviek na ultrazvukovú lýzu buniek a strihové štiepenie DNA – oba kroky sú kľúčové pre analýzu peptidov.
VialTweeter sonikuje uzavreté skúmavky Eppendorf s objemom 1,0, 1,5 a 2,0mL, ako aj rôzne liekovky NUNC
Ultrazvuková lýza buniek a tkanív na extrakciu proteínov
V pracovnom postupe proteomiky zdola nahor je sonikácia kľúčovým krokom pri lýze bunkových vzoriek na extrakciu proteínov na následnú analýzu hmotnostnou spektrometriou. Po pridaní pufra na lýzu buniek s obsahom SDS k bunkovému sedimentu sa vzorky spracujú ultrazvukom pomocou sonikátora VialTweeter na viacero skúmaviek. Protokol používa 1,5 mL mikrocentrifugačné skúmavky a stanovuje prevádzku sonikátora pri 30% výkone s 10 sekundami zapnutia a 10 sekundami vypnutia počas 3 cyklov. Po 1 minúte čakania sa cyklus zopakuje ešte dvakrát. Vzorky sa nepretržite chladia ľadom.
Tento proces nielen napomáha rozrušeniu buniek, ale je osobitne potrebný na fragmentáciu genómovej DNA uvoľnenej počas lýzy pôsobením šmykových síl. Účinná fragmentácia DNA pôsobením šmykových síl je zásadná na zníženie viskozity vzorky a zabránenie upchávaniu kolón S-Trap™, čím sa zabezpečuje optimálna výťažnosť proteínov a spoľahlivé následné štiepenie na peptidy.
Kľúčová úloha ultrazvukovej fragmentácie DNA pôsobením šmykových síl
Jedným z najčastejších zlyhaní pracovných postupov založených na S-Trap™ je upchávanie kolón, ktoré takmer výlučne spôsobuje genómová DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou uvoľnená počas homogenizácie buniek alebo tkanív. Neporušená DNA dramaticky zvyšuje viskozitu vzorky, zachytáva peptidy a blokuje mikroporézne sorpčné lôžko S-Trap™.
Ultrazvukové spracovanie rieši tento problém mechanickou fragmentáciou DNA na malé, rozpustné fragmenty. Pôsobením riadenej akustickej energie VialTweeter účinne fragmentuje nukleové kyseliny šmykovými silami bez vytvárania nadmerného tepla alebo zavádzania cudzorodých kontaminantov. Toto zníženie viskozity zabezpečuje plynulé nanášanie vzorky, stabilné prietoky cez kolónu a neprerušenú kinetiku štiepenia.
Optimalizované parametre sonikácie pomocou VialTweeter
Protokol stanovuje vysoko reprodukovateľný režim sonikácie optimalizovaný na zachovanie integrity biologických vzoriek a kompatibilitu s následnou MS analýzou. Pri spracovaní vzoriek v 1.5mL mikrocentrifugačných skúmavkách pomocou bezkontaktného blokového sonikátora Hielscher VialTweeter zabezpečujú nasledujúce parametre lýzu a optimálnu fragmentáciu DNA pôsobením šmykových síl pri zachovaní štruktúry proteínov:
- Amplitúda: 30% výkonu
- Priebeh cyklu: 10 sekúnd ZAPNUTÉ / 10 sekúnd VYPNUTÉ
- Trvanie: 3 cykly (10sec ZAPNUTÉ/10sec VYPNUTÉ) → 1-minútová prestávka na ľade → zopakovať ešte 2-krát
- Regulácia teploty: Vzorky sa počas spracovania umiestňujú na ľad, aby sa zabránilo tepelnej denaturácii a predčasnej enzymatickej aktivite
Tento prístup využívajúci pulznú sonikáciu zabraňuje lokálnemu prehrievaniu, minimalizuje oxidáciu peptidov a zabezpečuje rovnomerné vystavenie všetkých liekoviek akustickému pôsobeniu. Usporiadanie s uzavretými skúmavkami tiež odstraňuje potrebu čistenia sondy medzi vzorkami, čím výrazne skracuje čas manuálnej práce a znižuje variabilitu spôsobenú obsluhou.
Kľúčové výhody pre moderné proteomické pracovné postupy
Začlenenie VialTweeter do vášho pracovného postupu proteomiky zdola nahor prináša niekoľko prevádzkových a vedeckých výhod:
- Konzistentná fragmentácia DNA: Rovnomerný prenos akustickej energie do všetkých liekoviek zabezpečuje reprodukovateľné zníženie viskozity a zabraňuje variabilite medzi šaržami pri nanášaní vzoriek na S-Trap™.
- Zachovanie labilných modifikácií: Spracovanie pri nízkej teplote v ľadovom kúpeli chráni posttranslačné modifikácie (PTM) a zabraňuje teplom vyvolanej agregácii proteínov počas lýzy buniek.
- Zefektívnené následné spracovanie: Lyzáty spracované pomocou VialTweeter možno priamo vyčíriť centrifugáciou a kvantifikovať bez ďalších krokov čistenia, čím sa urýchľuje postup k štiepeniu v S-Trap™.
- Škálovateľnosť a flexibilita: Rovnaké nastavenia sonikácie sa uplatňujú pri tkanivových vzorkách s vysokou komplexnosťou aj pri bunkových suspenziách, čím podporujú pracovné postupy objavovej proteomiky, cielenej kvantifikácie a glykoproteomiky. Sonikátory Hielscher na mikrotitračné platničky umožňujú jednoduché rozšírenie spracovania na veľký počet vzoriek vo viacjamkových platničkách.
Bezkontaktný sonikátor VialTweeter na viacero skúmaviek možno prevádzkovať v chladiacich skriniach
Sonikátory na prípravu proteomických vzoriek
Príprava vysokokvalitných peptidových vzoriek na hmotnostnú spektrometriu si vyžaduje viac než účinnú lýzu – vyžaduje si presnú kontrolu fragmentácie DNA šmykovými silami, teploty a prevencie kontaminácie. Začlenením prístroja Hielscher VialTweeter do svojho pracovného postupu proteomiky zdola nahor môžete eliminovať upchávanie kolón S-Trap™, zabezpečiť reprodukovateľnú výťažnosť proteínov a zachovať čistotu potrebnú na citlivé analýzy MS. Či už spracúvate ľudské tkanivo, kultivované bunky alebo komplexné lyzáty, ultrazvukové spracovanie v bloku poskytuje spoľahlivosť, škálovateľnosť a riadenie procesu, ktoré moderné proteomické laboratóriá vyžadujú.
Na zvýšenie počtu spracúvaných vzoriek využite modely fokusovaných bezkontaktných sonikátorov na mikrotitračné platničky Hielscher UIP400MTP a UIP550MTP! Spracujte akúkoľvek štandardnú viacjamkovú platničku na vysokokapacitnú proteomiku!
Spracovanie v uzavretých skúmavkách v porovnaní s tradičnými sondovými sonikátormi
Výskumníci sa v minulosti pri fragmentácii DNA šmykovými silami spoliehali na sondové sonikátory s priamym kontaktom. Hoci sú sondové systémy účinné, prinášajú do proteomických pracovných postupov niekoľko zásadných obmedzení:
- Riziko krížovej kontaminácie: Opakované používanie sondy vo viacerých vzorkách spôsobuje prenos aerosólov a zanášanie kontaminantov z jednej vzorky do druhej, čo skresľuje výsledky kvantitatívnej MS.
- Strata vzorky: Priame ponorenie môže viesť k rozstrekovaniu, odparovaniu a priľnutiu cenných peptidov na povrch sondy.
- Čistenie: Dôkladná dekontaminácia sondy medzi jednotlivými cyklami spracovania je časovo náročná a často neúplná, čo ohrozuje štúdie proteínov s nízkym zastúpením.
Blokový sonikátor VialTweeter spracúva vzorky výlučne v uzavretých mikrocentrifugačných skúmavkách. Táto konštrukcia uzavretého systému eliminuje kontakt sondy so vzorkou, zabraňuje tvorbe aerosólov a zachováva prísne aseptické podmienky počas celej homogenizácie a lýzy. Pre laboratóriá spracúvajúce vysoko komplexné tkanivové lyzáty alebo viaceré bunkové línie to znamená čistejšie údaje MS, vyššiu výťažnosť peptidov a spoľahlivejšie biologické replikáty.
Zvýšenie kapacity na vysokokapacitnú prípravu vzoriek vo viacjamkových platničkách
Ak použijete modely sonikátorov na mikrotitračné platničky UIP400MTP a UIP550MTP, spracovanie v skúmavkách možno ľahko rozšíriť na vysokokapacitné spracovanie vzoriek v akejkoľvek štandardnej viacjamkovej platničke.
Sonikátor na viacjamkové platničky UIP400MTP na vysokokapacitnú extrakciu proteínov zo vzoriek
Často kladené otázky o sonikácii pri príprave peptidových vzoriek
Prečo je pred spracovaním peptidov pomocou S-Trap™ potrebná sonikácia?
Sonikácia je potrebná na fragmentáciu vysokomolekulovej genómovej DNA uvoľnenej počas lýzy buniek alebo tkanív šmykovými silami. Neporušená DNA drasticky zvyšuje viskozitu vzorky, čo môže upchať mikrokolónu S-Trap™ a zachytiť peptidy, čím sa výrazne znižuje výťažnosť a kompatibilita s MS.
Ako blokový sonikátor VialTweeter zlepšuje prípravu vzoriek v porovnaní s tradičnými sondovými sonikátormi?
Na rozdiel od sondových sonikátorov s priamym kontaktom, ktoré si medzi jednotlivými cyklami spracovania vyžadujú dôkladné čistenie a prinášajú riziko prenosu aerosólov, VialTweeter spracúva vzorky výlučne v uzavretých liekovkách a mikrocentrifugačných skúmavkách. Táto konštrukcia s uzavretými skúmavkami eliminuje krížovú kontamináciu, zabraňuje strate vzorky a zachováva prísne aseptické podmienky počas celej homogenizácie a lýzy buniek.
Aké sú optimálne parametre sonikácie pri príprave vzoriek na proteomiku?
Pri biologických vzorkách, ako sú bunky a tkanivá, odporúčaný protokol využíva sonikátor VialTweeter pri 30% výkone s cyklom 10 sekúnd zapnutia / 10 sekúnd vypnutia, ktorý sa opakuje 3-krát. Vzorky by sa počas spracovania mali uchovávať na ľade a pri spracovaní ≥5 miliónov buniek by sa cyklus mal zopakovať ešte dvakrát. (porov. Wojtkiewicz et al., 2021)
Čo mám robiť, ak sa moja kolóna S-Trap™ upchá počas nanášania vzorky?
Upchávanie kolóny je zvyčajne spôsobené vysokou viskozitou DNA alebo nedostatočným vyčírením. Na vyriešenie tohto problému lyzát pred pipetovaním dôkladne odstreďte a zabezpečte dostatočnú fragmentáciu DNA šmykovými silami pomocou sonikácie.
Aké výhody prináša bezkontaktná sonikácia pracovným postupom kvantitatívnej proteomiky?
V kvantitatívnych štúdiách môže aj stopová krížová kontaminácia medzi vzorkami skresliť merania peptidov s nízkym zastúpením. Spracovanie viacerých vzoriek v uzavretých skúmavkách pomocou zariadenia VialTweeter eliminuje zavádzanie sondy, zabezpečuje reprodukovateľnosť medzi šaržami a zachováva integritu vzoriek pre presné porovnávacie analýzy.
Aký výťažok proteínov a akú hĺbku analýzy MS môžem očakávať pri použití tohto protokolu?
Pri východiskovom množstve 50 mg ľudského srdcového tkaniva alebo 5 miliónov buniek poskytuje pracovný postup S-Trap™ zvyčajne dostatok peptidov na 30–50 nástrekov LC-MS, pričom sa pri každom meraní konzistentne identifikuje viac ako 4 000 jedinečných proteínov. (porov. Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatúra / Referencie
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics dodáva výkonné bezkontaktné sonikátory na prípravu vzoriek a klinickú analýzu. Sonikátor pre viacjamkové platne UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn a prietokový sonikátor GDmini2 spracúvajú vzorky bez toho, aby sa ich dotýkali.