Sonikácia v mikrotitračných platničkách v shotgun proteomike – aplikačná poznámka

Shotgun proteomika závisí od účinnej a reprodukovateľnej prípravy vzoriek, ktorá umožňuje premeniť komplexný biologický materiál na peptidy pripravené na LC-MS/MS. Sonikátor mikrotitračných platničiek UIP400MTP podporuje tento proces tým, že umožňuje štandardizovanú paralelnú sonikáciu maloobjemových vzoriek a pomáha laboratóriám zlepšiť narušenie, extrakciu a opätovnú solubilizáciu v pracovných postupoch využívajúcich mikrotitračné platničky. Táto aplikačná poznámka opisuje, ako možno UIP400MTP začleniť do prípravy vzoriek na proteomickú analýzu, pričom ako laboratórne overený príklad používa publikovaný pracovný postup pre extracelulárne vezikuly zo štúdií PLA2G12A/Th17.

Sonikácia v mikrotitračných platničkách pre reprodukovateľnejšiu shotgun proteomiku

Pre výskumníkov v oblasti proteomiky je reprodukovateľná príprava vzoriek rozhodujúca na získanie vysokokvalitných údajov LC-MS/MS. Sonikátor mikrotitračných platničiek UIP400MTP podporuje štandardizovanú paralelnú sonikáciu v pracovných postupoch využívajúcich platničky a v maloobjemových pracovných postupoch s vysokou priepustnosťou vzoriek.

Je obzvlášť užitočný pre laboratóriá pracujúce s:

• Veľkými súbormi vzoriek, ktoré vyžadujú konzistentné spracovanie v mnohých jamkách
• Materiálom dostupným v obmedzenom vstupnom množstve, pri ktorom je potrebné minimalizovať straty vzoriek a variabilitu
• Vzorkami bohatými na lipidy, ako sú extracelulárne vezikuly
• Komplexnými biologickými preparátmi, ktoré vyžadujú účinné narušenie, extrakciu alebo opätovnú solubilizáciu
• Porovnávacou shotgun proteomikou, pri ktorej je zásadná reprodukovateľnosť medzi rôznymi podmienkami a replikátmi

Začlenením sonikácie v mikrotitračných platničkách pred štiepením môžu výskumníci zlepšiť pripravenosť vzoriek na:

• Extrakciu a opätovnú solubilizáciu proteínov
• Štiepenie trypsínom/Lys-C
• Zber údajov pomocou nano-LC/MS/MS
• Následnú kvantitatívnu proteomickú analýzu

Sonikácia v mikrotitračných platničkách môže byť prínosom pre:

• Centrálne pracoviská proteomiky
• Laboratóriá výskumu EV
• Laboratóriá imunológie a bunkovej biológie
• Skupiny translačného výskumu
• Tímy v oblasti vied o živej prírode, ktoré prechádzajú od prípravy jednotlivých vzoriek k pracovným postupom s vyššou priepustnosťou vzoriek

Príprava vzoriek s vysokou priepustnosťou na analýzu proteómu extracelulárnych vezikúl

Čo je shotgun proteomika?

Shotgun proteomika sa stala ústrednou analytickou stratégiou na charakterizáciu komplexných biologických vzoriek, od celobunkových lyzátov a tkanivových extraktov až po purifikované organely, extracelulárne vezikuly a klinické vzorky dostupné v malom vstupnom množstve. Jej hlavná prednosť spočíva v prepojení štiepenia proteínov, kvapalinovej chromatografie spojenej s tandemovou hmotnostnou spektrometriou s vysokým rozlíšením a výpočtového odvodzovania proteínov z peptidov. Kvalita výsledného súboru proteómových údajov sa však určuje dávno predtým, ako vzorka dosiahne hmotnostný spektrometer. Účinné narušenie vzorky, solubilizácia proteínov, odstránenie rušivých látok, reprodukovateľné enzymatické štiepenie a spoľahlivé získavanie peptidov sú rozhodujúce pre hĺbku pokrytia aj kvantitatívnu spoľahlivosť.
Pre výskumníkov v oblasti proteomiky a laboratóriá vied o živej prírode pracujúce so vzorkami dostupnými v obmedzenom množstve alebo so vzácnymi vzorkami je príprava vzoriek často úzkym miestom.

Výzvy spojené s extracelulárnymi vezikulami v proteomike

Napríklad extracelulárne vezikuly (EV) predstavujú obzvlášť náročnú triedu vzoriek. Sú to častice nanometrových rozmerov ohraničené membránou, bohaté na lipidy, s relatívne nízkym výťažkom proteínov a vysokým potenciálom prenosu lipidov, solí, detergentov, sérových proteínov a ďalších zložiek matrice do nasledujúcich krokov. Tieto vlastnosti môžu nepriaznivo ovplyvniť účinnosť štiepenia, chromatografickú výkonnosť, stabilitu elektrospreja a identifikáciu peptidov. Pracovný postup prípravy vzoriek na proteomiku EV preto musí byť dostatočne účinný na narušenie štruktúr vezikúl a solubilizáciu ich proteínového obsahu, pričom musí zostať kompatibilný s následným enzymatickým štiepením a analýzou LC-MS/MS.
V tomto kontexte ponúka ultrazvukové spracovanie kompatibilné s mikrotitračnými platničkami praktický prístup k reprodukovateľnému paralelnému spracovaniu vzoriek. Modely sonikátorov Hielscher pre mikrotitračné platničky UIP400MTP (400 W) a UIP550MTP (550 W) sú navrhnuté na sonikáciu vzoriek vo viacjamkových platničkách a maloobjemových nádobách a umožňujú pracovné postupy s vyššou kapacitou spracovania vzoriek než bežné sonikátory s jednou sondou. Pre proteomické laboratóriá je tento formát atraktívny, pretože môže znížiť variabilitu spôsobenú manuálnou manipuláciou, zlepšiť paralelné spracovanie viacerých vzoriek a prirodzenejšie sa začleniť do postupov prípravy vzoriek v platničkách.

Príklad pracovného postupu

Nedávny pracovný postup proteomickej analýzy extracelulárnych vezikúl pri skúmaní biológie buniek Th17 ovplyvňovanej PLA2G12A poskytuje užitočný, laboratórne overený príklad začlenenia sonikátora pre mikrotitračné platničky UIP400MTP do prípravy vzoriek na shotgun proteomiku. V tejto sérii štúdií sa vzorky EV spracovali na analýzu proteómu pomocou ošetrenia metanolom, sonikácie prístrojom UIP400MTP, centrifugácie, sušenia, štiepenia trypsínom/Lys-C a kvapalinovej chromatografie s nanoprietokom spojenej s tandemovou hmotnostnou spektrometriou s vysokým rozlíšením. Biologický výskum publikovali v roku 2026 Mochizuki-Ono a kolegovia, pričom proteomická analýza pomohla charakterizovať, ako PLA2G12A mení proteíny obsiahnuté v EV v kontexte patogénnych odpovedí T-buniek.

Sonikátor viacjamkových platničiek UIP400MTP

Prečo sonikácia v mikrotitračných platničkách?
UIP400MTP umožňuje štandardizovanú paralelnú sonikáciu vzoriek s malým objemom. Je to užitočné vtedy, keď sú dôležité reprodukovateľnosť, malé vstupné množstvo vzorky a vysoká kapacita spracovania viacerých vzoriek.


Kontrolný zoznam kontroly kvality

• Overte, že vstupné množstvo EV zodpovedá rovnakému množstvu proteínov vo všetkých vzorkách.
• Používajte randomizované alebo vyvážené rozmiestnenie vzoriek pri spracovaní.
• Udržiavajte rovnaký objem metanolu, čas sonikácie, čas sušenia a objem pri enzymatickom štiepení.
• Sledujte výťažok peptidov a celkový počet identifikovaných proteínov.
• Kontrolujte mieru vynechaných štiepení a distribúciu dĺžky peptidov.
• Skontrolujte tvar chromatografických píkov a reprodukovateľnosť retenčného času.
• Zaraďte slepé vzorky na sledovanie prenosu zvyškov medzi vzorkami.
• Pri väčších štúdiách používajte združené vzorky na kontrolu kvality (QC).
• Vyhodnoťte variačný koeficient replikátov.
• Použite PCA alebo príbuzné metódy na identifikáciu vplyvov jednotlivých sérií spracovania alebo odľahlých vzoriek.

Odporúčania na zaznamenávanie údajov

Pri publikovaní alebo dokumentovaní tohto pracovného postupu uveďte vstupné množstvo EV, formát platničky, objem metanolu, amplitúdu a čas sonikácie pomocou UIP400MTP, podmienky centrifugácie, metódu sušenia, pufor na enzymatické štiepenie, koncentráciu enzýmov, čas enzymatického štiepenia, podmienky okyslenia, platformu LC-MS/MS, režim akvizície, verziu softvéru, databázu, prahovú hodnotu FDR, metódu normalizácie a štatistický pracovný postup.
Všetky sonikátory pre mikrotitračné doštičky Hielscher automaticky zaznamenávajú dôležité procesné parametre, ako sú amplitúda, trvanie sonikácie a teplota, s dátumovou a časovou pečiatkou vo forme súboru CVS na integrovanú kartu SD. Zaznamenávanie údajov na zabezpečenie reprodukovateľnosti a kontroly kvality ešte nikdy nebolo jednoduchšie!

Štúdia podrobne: Shotgun proteomika EV v štúdii PLA2G12A

Štúdia PLA2G12A poskytuje konkrétny príklad použitia UIP400MTP v pracovnom postupe shotgun proteomiky. Biologickou otázkou bolo, ako secernovaná fosfolipáza PLA2G12A modifikuje extracelulárne vezikuly pochádzajúce z buniek Th17 a tým ovplyvňuje diferenciáciu patogénnych T-buniek. Autori preukázali, že PLA2G12A pôsobí na membrány EV za vzniku lyzofosfolipidov vrátane 1-oleoyl-lyzofosfatidyletanolamínu a že následná signalizácia kyseliny lyzofosfatidovej prostredníctvom LPA2 prispieva k diferenciácii Th17. Okrem lipidovej signalizácie štúdie skúmali aj náklad EV vrátane obsahu RNA a proteínov, vďaka čomu bola shotgun proteomika dôležitou súčasťou stratégie charakterizácie.
V pracovnom postupe prípravy EV sa bunky Th17 kultivovali v médiu obsahujúcom fetálne bovinné sérum zbavené exozómov. Supernatanty z kultúr sa najprv centrifugovali na odstránenie buniek, prefiltrovali cez filter s veľkosťou pórov 0,22 µm, skoncentrovali ultrafiltráciou/ultracentrifugáciou, premyli, resuspendovali v PBS a kvantifikovali stanovením proteínov metódou BCA. Táto príprava EV pred proteomickou analýzou zabezpečila, že do proteomického pracovného postupu mohlo vstúpiť definované množstvo materiálu EV vyjadrené proteínovým ekvivalentom.
Na shotgun proteomickú analýzu autori použili vzorky EV zodpovedajúce proteínovému ekvivalentu 5 µg. Tieto vzorky sa vysušili v PCR skúmavkách a pridalo sa 25 µL metanolu. Vzorky sa potom sonikovali 3 minúty pomocou sonikátora pre mikrotitračné platničky UIP400MTP. Po sonikácii sa vzorky centrifugovali pri 4°C počas 20 minút pri 19 000 × g. Po odstránení 20 µL supernatantu sa vzorky centrifugovali do sucha. Proteíny sa potom rozpustili sonikáciou v 4 µL roztoku trypsínu/Lys-C s koncentráciou 100 ng/µL v 50 mM hydrogénuhličitane amónnom. Štiepenie prebiehalo 2 hodiny pri 37°C za pretrepávania pri 300 rpm. Produkt štiepenia sa okyslil 1 µL 1,25% kyseliny trifluóroctovej a podrobil sa kvapalinovej chromatografii s nanoprietokom spojenej s tandemovou hmotnostnou spektrometriou s vysokým rozlíšením.
Tento pracovný postup zdôrazňuje niekoľko užitočných princípov proteomiky EV s malým vstupným množstvom vzorky. Po prvé, vstupné množstvo sa normalizovalo podľa proteínového ekvivalentu, čo je dôležité pri porovnávaní EV z rôznych genotypov alebo po rôznych ošetreniach. Po druhé, pred sonikáciou sa použil metanol, ktorý podporoval narušenie a extrakciu a zároveň umožnil vyhnúť sa detergentovým systémom, ktoré môžu komplikovať LC-MS/MS. Po tretie, sonikačný krok bol krátky a štandardizovaný, čo je kompatibilné s paralelným spracovaním vzoriek. Po štvrté, štiepenie trypsínom/Lys-C sa vykonávalo vo veľmi malom objeme, čím sa znížilo zriedenie a podporila výťažnosť peptidov pri malom vstupnom množstve vzorky. Napokon priamy prechod od štiepenia k okysleniu a LC-MS/MS minimalizoval zbytočné manipulačné kroky.
Následná metóda LC-MS/MS využívala separáciu na reverznej fáze s nanoprietokom spojenú s hmotnostným spektrometrom Q-Exactive HF Orbitrap. Vzorky sa zachytili na predkolóne C18 a následne sa separovali na analytickej kolóne s vnútorným priemerom 50 µm pri prietoku 200 nL/min a teplote 40°C. Gradient prechádzal od nízkeho podielu organického rozpúšťadla po 35% rozpúšťadla B počas 60 minút, po čom nasledovalo premývanie s vysokým podielom organického rozpúšťadla a opätovné ustálenie rovnováhy. Zber MS dát sa vykonával v režime kladných iónov pomocou zberu dát nezávislého od dát s kolíznou disociáciou pri vyššej energii. Súbory nespracovaných dát DIA sa analyzovali pomocou DIA-NN 1.8 so spektrálnou knižnicou predikovanou in silico.