Ultrazvuková úprava mikrotitračných doštičiek v proteomike typu „shotgun“ – Pokyny k používaniu

Proteomika typu „shotgun“ závisí od efektívnej a reprodukovateľnej prípravy vzoriek, ktorej cieľom je premeniť komplexný biologický materiál na peptidy pripravené pre analýzu LC-MS/MS. Ultrazvukový rozbíjač mikrotitračných doštičiek UIP400MTP podporuje tento proces tým, že umožňuje štandardizovanú a paralelnú sonikáciu vzoriek s malým objemom, čím pomáha laboratóriám zlepšiť rozrušenie, extrakciu a opätovnú rozpustnosť v pracovných postupoch založených na mikrotitračných doštičkách. Táto aplikačná poznámka popisuje, ako je možné integrovať zariadenie UIP400MTP do prípravy proteomických vzoriek, pričom ako laboratórne overený príklad slúži uverejnený pracovný postup s extracelulárnymi vezikulami zo štúdií PLA2G12A/Th17.

Ultrazvuková úprava mikrotitračných doštičiek pre reprodukovateľnejšiu proteomiku typu „shotgun“

Pre výskumníkov v oblasti proteomiky je reprodukovateľná príprava vzoriek kľúčová pre získanie vysokokvalitných údajov z LC-MS/MS. Ultrazvukový prístroj UIP400MTP pre mikrotitračné doštičky umožňuje štandardizovanú, paralelnú sonikáciu v pracovných postupoch založených na doštičkách aj v malých objemoch s vysokou priepustnosťou.

Je to obzvlášť užitočné pre laboratóriá, ktoré sa zaoberajú:

• Veľké súbory vzoriek, ktoré si vyžadujú jednotné spracovanie vo viacerých jamkách
• Materiál s obmedzeným množstvom vstupných vzoriek, pri ktorom je potrebné minimalizovať straty vzoriek a ich variabilitu
• Vzorky s vysokým obsahom lipidov, ako napríklad extracelulárne vezikuly
• Zložité biologické prípravky, ktoré si vyžadujú účinné rozrušenie, extrakciu alebo opätovnú rozpustiteľnosť
• Komparatívna proteomika typu „shotgun“, pri ktorej je kľúčová reprodukovateľnosť v rôznych podmienkach a pri jednotlivých opakovaných meraniach

Vďaka začleneniu sonikácie mikrotitračných doštičiek pred štiepením môžu výskumníci zlepšiť pripravenosť vzoriek na:

• Extrakcia a opätovná rozpustiteľnosť bielkovín
• Štiepenie trypsínom/Lys-C
• Získavanie údajov pomocou Nano-LC/MS/MS
• Kvantitatívna proteomická analýza v nadväzujúcej fáze

 

Bez obáv rozširujte prípravu proteomických vzoriek!
Zistite, ako ultrazvuková úprava mikrotitračných doštičiek pomáha znížiť variabilitu vyplývajúcu z ručnej práce, zlepšiť rozrušenie vzoriek a pripraviť komplexné biologické vzorky na spoľahlivú analýzu metódou LC-MS/MS.

Žiadosť o informácie


E-mailová adresa (povinné)


Produkt alebo oblasť záujmu



Súhlasím so Zásadami ochrany osobných údajov









Vyžiadajte si informácie

Ultrazvuková úprava mikrotitračných doštičiek môže priniesť nasledujúce výhody:

• Základné zariadenia pre proteomiku
• Výskumné laboratóriá v oblasti elektrických vozidiel
• Laboratóriá imunológie a bunkovej biológie
• Skupiny zaoberajúce sa translačným výskumom
• Tímy v oblasti prírodných vied, ktoré prechádzajú od prípravy jednotlivých vzoriek k pracovným postupom s vyššou priepustnosťou

Príprava vzoriek s vysokou priepustnosťou na analýzu proteómu extracelulárnych vezikúl

Čo je to proteomika typu „shotgun“?

Proteomika typu „shotgun“ sa stala kľúčovou analytickou stratégiou na charakterizáciu komplexných biologických vzoriek, od lyzátov celých buniek a tkanivových extraktov až po purifikované organely, extracelulárne vezikuly a klinické vzorky s nízkym obsahom materiálu. Jej hlavná sila spočíva v prepojení štiepenia proteínov, vysokorozlišovacej kvapalinovej chromatografie s tandemovou hmotnostnou spektrometriou a počítačovej inferencie peptidov na proteíny. Kvalita konečného súboru proteómových údajov sa však určuje už dávno predtým, ako vzorka dorazí do hmotnostného spektrometra. Efektívne rozrušenie vzorky, solubilizácia proteínov, odstránenie rušivých látok, reprodukovateľné enzymatické štiepenie a spoľahlivá izolácia peptidov sú rozhodujúce pre hĺbku pokrytia a kvantitatívnu spoľahlivosť.
Pre výskumníkov v oblasti proteomiky a laboratóriá v oblasti prírodných vied, ktoré pracujú s obmedzeným množstvom alebo vzácnymi vzorkami, je príprava vzoriek často úzkym miestom.

Výzva, ktorú predstavujú extracelulárne vezikuly v proteomike

Extracelulárne vezikuly (EV) napríklad predstavujú obzvlášť náročnú triedu vzoriek. Ide o membránou ohraničené, na lipidy bohaté častice v nanoměřítku s relatívne nízkym výťažkom bielkovín a vysokým rizikom prenosu lipidov, solí, detergentov, sérových bielkovín a ďalších zložiek matrice. Tieto vlastnosti môžu negatívne ovplyvňovať účinnosť trávenia, chromatografický výkon, stabilitu pri elektrospreji a identifikáciu peptidov. Pracovný postup prípravy pre proteomiku EV musí byť preto dostatočne účinný na to, aby narušil štruktúry vezikúl a rozpustil proteínový obsah, pričom musí zostať kompatibilný s následným enzymatickým trávením a analýzou LC-MS/MS.
V tejto súvislosti ponúka ultrazvuková úprava kompatibilná s mikrotitračnými platničkami praktický prístup k reprodukovateľnému a paralelizovanému spracovaniu vzoriek. Modely ultrazvukových sonikátorov Hielscher pre mikrotitračné doštičky UIP400MTP (400 W) a UIP550MTP (550 W) sú navrhnuté na sonikáciu vzoriek v mikrotitračných doštičkách a nádobách s malým objemom, čím podporujú pracovné postupy s vyššou priepustnosťou než konvenčné sonikátory s jednou sondou. Pre proteomické laboratóriá je tento formát atraktívny, pretože môže znížiť variabilitu spôsobenú ľudským zásahom, zlepšiť paralelné spracovanie viacerých vzoriek a prirodzenejšie sa integrovať do procesov prípravy vzoriek založených na platniach.

Príkladný pracovný postup

Nedávny pracovný postup v oblasti proteomiky extracelulárnych vezikúl v rámci biológie Th17-buniek riadených PLA2G12A poskytuje užitočný, laboratórne overený príklad toho, ako je možné začleniť ultrazvukový prístroj pre mikrotitrové doštičky UIP400MTP do prípravy vzoriek pre proteomiku typu „shotgun“. V tejto sérii štúdií boli vzorky EV spracované na proteómovú analýzu pomocou ošetrenia metanolom, sonikácie zariadením UIP400MTP, centrifugácie, sušenia, trávenia trypsínom/Lys-C a nano-prúdovej LC s tandemovou MS s vysokým rozlíšením. Táto biologická práca bola najskôr uverejnená ako predtlač na portáli bioRxiv a následne publikovaná v časopise Cell Reports, kde proteomická analýza pomohla charakterizovať, ako PLA2G12A mení proteíny obsiahnuté v EV v kontexte patogénnych reakcií T-buniek.

Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP

Prečo sonikácia mikrotitračných doštičiek?
Prístroj UIP400MTP umožňuje štandardizovanú, paralelnú sonikáciu vzoriek s malým objemom. To je užitočné v prípadoch, keď je dôležitá reprodukovateľnosť, nízky objem vzorky a priepustnosť viacerých vzoriek.

Kontrolný zoznam pre kontrolu kvality

• Overte, či je množstvo proteínového ekvivalentu EV vo všetkých vzorkách rovnaké.
• Používajte náhodné alebo vyvážené schémy spracovania vzoriek.
• Objem metanolu, dobu sonikácie, dobu sušenia a objem rozkladu udržujte na rovnakej úrovni.
• Sledujte výťažok peptidov a identifikáciu celkových bielkovín.
• Skontrolujte mieru nezrezených fragmentov a rozdelenie dĺžok peptidov.
• Skontrolujte tvar chromatografického piku a reprodukovateľnosť retenčného času.
• Vložte prázdne riadky na sledovanie prenesených údajov.
• V rozsiahlejších štúdiách používajte zoskupené vzorky na kontrolu kvality.
• Vypočítajte koeficient variácie replikátov.
• Na identifikáciu vplyvov šarže alebo odľahlých vzoriek použite PCA alebo podobné metódy.

Odporúčania týkajúce sa vedenia zápisníc

Pri zverejnení alebo zdokumentovaní tohto pracovného postupu uveďte množstvo vstupného EV, formát platničky, objem metanolu, amplitúdu a dobu sonikácie zariadenia UIP400MTP, podmienky centrifugácie, spôsob sušenia, digestný pufr, koncentráciu enzýmu, dobu digestie, podmienky okyslenia, platformu LC-MS/MS, režim zberu údajov, verziu softvéru, databázu, prahovú hodnotu FDR, metódu normalizácie a štatistický pracovný postup.
Všetky ultrazvukové prístroje na mikrotitračné doštičky spoločnosti Hielscher automaticky zaznamenávajú dôležité parametre procesu, ako sú amplitúda, dĺžka trvania sonikácie a teplota, spolu s dátumom a časom, a to vo forme súboru CSV na integrovanej SD-karte. Zaznamenávanie údajov na účely reprodukovateľnosti a kontroly kvality nebolo nikdy jednoduchšie!

Podrobný popis štúdie: Proteomika EV Shotgun v rámci štúdie PLA2G12A

Štúdia o PLA2G12A poskytuje konkrétny príklad využitia UIP400MTP v proteomickom pracovnom postupe typu „shotgun“. Biologickou otázkou bolo, ako sekrétna fosfolipáza PLA2G12A modifikuje extracelulárne vezikuly pochádzajúce z buniek Th17 a tým ovplyvňuje diferenciáciu patogénnych T-buniek. Autori preukázali, že PLA2G12A pôsobí na membrány extracelulárnych vezikúl (EV) a produkuje lyzofosfolipidy, vrátane 1-oleoyl-lyzofosfatidyletanolamínu, a že následná signalizácia kyseliny lyzofosfatidovej prostredníctvom LPA2 prispieva k diferenciácii Th17. Okrem lipidovej signalizácie sa štúdie zamerali aj na obsah EV, vrátane obsahu RNA a proteínov, čím sa proteomika typu „shotgun“ stala dôležitou súčasťou stratégie charakterizácie.
V rámci postupu prípravy EV boli bunky Th17 kultivované v médiu obsahujúcom fetálne hovädzie sérum zbavené exozómov. Kultivačné supernatanty sa najskôr odstreďovali na odstránenie buniek, prefiltrovali cez 0,22 µm filter, koncentrovali ultrafiltráciou/ultracentrifugáciou, premyli, resuspendovali v PBS a kvantifikovali pomocou BCA testu na stanovenie bielkovín. Táto predchádzajúca príprava EV zabezpečila, že do proteomického pracovného postupu bolo možné preniesť definované množstvo materiálu EV, ktoré zodpovedá určitému množstvu proteínu.
Na proteomickú analýzu typu „shotgun“ autori použili vzorky EV zodpovedajúce 5 µg ekvivalentov bielkovín. Tieto vzorky boli vysušené v PCR skúmavkách a bol k nim pridaný 25 µL metanolu. Následne boli vzorky sonikované po dobu 3 minút pomocou sonikátora na mikrotitrové doštičky UIP400MTP. Po sonikácii boli vzorky centrifugované pri 4 °C počas 20 minút pri 19 000 × g. Po odstránení 20 µL supernatantu boli vzorky centrifugované do sucha. Proteíny sa následne rozpustili sonikáciou v 4 µL roztoku trypsínu/Lys-C v koncentrácii 100 ng/µL v 50 mM roztoku hydrogenuhličitanu amónneho. Štiepenie prebiehalo 2 hodiny pri 37 °C za premiešavania pri 300 ot/min. Štiepený produkt bol okyslený 1 µL 1,25 % kyseliny trifluóroctovej a podrobený nano-prúdovej LC-tandemovej hmotnostnej spektrometrii s vysokým rozlíšením.
Tento pracovný postup poukazuje na niekoľko užitočných princípov pre proteomiku EV s nízkym množstvom vstupného materiálu. Po prvé, vstupný materiál bol normalizovaný na proteínový ekvivalent, čo je dôležité pri porovnávaní EV z rôznych genotypov alebo liečebných režimov. Po druhé, pred sonikáciou bol použitý metanol, ktorý podporuje rozrušenie a extrakciu a zároveň umožňuje vyhnúť sa detergentným systémom, ktoré by mohli skomplikovať analýzu LC-MS/MS. Po tretie, krok sonikácie bol krátky a štandardizovaný, čo je kompatibilné s paralelným spracovaním vzoriek. Po štvrté, trávenie trypsínom/Lys-C sa vykonalo vo veľmi malom objeme, čím sa znížilo riedenie a podporila sa výťažnosť peptidov pri nízkych vstupných množstvách. Nakoniec, priamy prechod od trávenia k okysleniu a LC-MS/MS minimalizoval zbytočné manipulačné kroky.
Metóda LC-MS/MS v následnom kroku využívala separáciu s reverznou fázou pri nanoprúde v spojení s hmotnostným spektrometrom Q-Exactive HF Orbitrap. Vzorky boli zachytené na predkolóne C18 a následne separované na analytickej kolóne s vnútorným priemerom 50 µm pri prietoku 200 nL/min a teplote 40 °C. Gradient prebiehal od nízkeho obsahu organického rozpúšťadla po 35 % rozpúšťadla B v priebehu 60 minút, po čom nasledovalo prepláchnutie vysokým obsahom organického rozpúšťadla a reekvilibrácia. Získavanie MS údajov sa vykonávalo v režime kladných iónov s využitím získavania nezávislého na údajoch s kolíznou disociáciou s vyššou energiou. Surové súbory DIA boli analyzované pomocou softvéru DIA-NN 1.8 s in silico predpovedanou spektrálnou knižnicou.