Strihanie chromatínu pomocou sonikácie
Strihanie chromatínu je kritickým krokom v mnohých pracovných postupoch epigenetiky a molekulárnej biológie, najmä pri imunoprecipitácii chromatínu (ChIP), ChIP-seq a súvisiacich testoch. Cieľom je fragmentovať chromatín na reprodukovateľné DNA-proteínové komplexy pri zachovaní integrity epitopov a minimalizácii straty vzorky. Spomedzi dostupných metód sa ultrazvuková fragmentácia chromatínu stala široko používaným prístupom, pretože poskytuje spoľahlivú fragmentáciu bez použitia činidiel s vynikajúcou reprodukovateľnosťou.
Čo by som mal zvážiť pri strihaní chromatínu?
Účinné strihanie chromatínu si vyžaduje starostlivú kontrolu experimentálnych parametrov. Nesprávna fragmentácia môže ohroziť nadväzujúce experimenty ChIP tým, že sa vytvoria príliš veľké, príliš degradované alebo nekonzistentné fragmenty medzi vzorkami.
Jedným z najdôležitejších faktorov je požadované rozdelenie veľkosti fragmentov. Pre väčšinu aplikácií ChIP a ChIP-seq sú optimálne chromatínové fragmenty medzi 100 a 600 pármi báz. Tento rozsah veľkostí umožňuje účinnú imunoprecipitáciu a zároveň poskytuje dostatočné rozlíšenie na genomické mapovanie.
Ďalším kľúčovým faktorom je účinnosť sieťovania pred sonikáciou. Väčšina pracovných postupov ChIP zahŕňa fixáciu formaldehydom na stabilizáciu interakcií proteín-DNA. Nadmerné zosieťovanie však môže zvýšiť odolnosť chromatínu voči fragmentácii, čo si vyžaduje dlhší čas sonikácie a potenciálne zvyšuje tepelnú expozíciu.
Kľúčová je aj regulácia teploty. Sonikácia vytvára lokalizovanú energiu, ktorá môže zvýšiť teplotu vzorky. Zvýšená teplota môže poškodiť DNA alebo denaturovať proteíny a ovplyvniť rozpoznávanie protilátok počas ChIP. Mnohí výskumníci preto vykonávajú pulzné cykly sonikácie v kombinácii s intervalmi chladenia, aby sa zachovala stabilita vzorky.
Účinnosť fragmentácie ovplyvňuje aj koncentrácia a objem vzorky. Vysoko koncentrované suspenzie chromatínu môžu vyžadovať dlhší čas sonikácie, zatiaľ čo malé objemy vzoriek si vyžadujú presné dodanie energie, aby sa zabránilo nadmernému spracovaniu.
Napokon, výber sonikačného zariadenia výrazne ovplyvňuje reprodukovateľnosť experimentu. Zariadenia určené na strihanie chromatínu zvyčajne poskytujú kontrolovanú ultrazvukovú energiu a štandardizovanú manipuláciu so vzorkami, čo umožňuje konzistentnú fragmentáciu viacerých vzoriek.
Ultrazvukové strihanie DNA počas ChIP – Imunoprecipitácia chromatínu
Ktorý sonikátor by som si mal vybrať na strihanie chromatínu?
Rôzne laboratórne pracovné postupy si vyžadujú rôzne konfigurácie sonikácie. Optimálny systém do veľkej miery závisí od priepustnosti vzorky, objemu a experimentálneho formátu.
Sonický sonátor
Sonikátor typu sondy dodáva ultrazvukovú energiu priamo do vzorky prostredníctvom titánovej sondy. Táto konfigurácia poskytuje veľmi vysokú hustotu energie, a preto je vhodná na robustné narušenie chromatínu v jednotlivých vzorkách.
Sondy sú užitočné najmä na:
- Malé až stredné počty vzoriek
- Ťažko fragmentovateľný chromatín
- Flexibilné experimentálne protokoly
Sonikátor s viacerými trubicami - VialTweeter
Pre laboratóriá, ktoré spracovávajú viacero vzoriek súčasne, poskytuje sonikátor VialTweeter s viacerými skúmavkami vysoko reprodukovateľné riešenie. Systém prenáša ultrazvukovú energiu nepriamo cez držiak liekovky, čo umožňuje fragmentáciu niekoľkých uzavretých skúmaviek za rovnakých podmienok.
Táto konfigurácia ponúka dôležité výhody:
- Paralelné strihanie chromatínu viacerých vzoriek
- Eliminácia kontaminácie sondy
- Vysoká reprodukovateľnosť medzi skúmavkami
- Zjednodušený pracovný postup prípravy vzoriek ChIP
Takéto systémy s viacerými skúmavkami sú vhodné na bežné experimenty ChIP a stredne výkonné štúdie.
Sonikátor na mikrotitračné platne - UIP400MTP
Vysokokapacitné epigenetické štúdie sa čoraz viac spoliehajú na spracovanie vzoriek na mikrotitračných platniach. Mikrotitračný sonikátor UIP400MTP je navrhnutý na fragmentáciu chromatínu priamo v štandardných mikrotitračných doštičkách bez prenosu vzoriek.
Tento prístup umožňuje:
- Súčasné spracovanie desiatok alebo stoviek vzoriek
- Pracovné postupy vhodné pre automatizáciu
- Rovnomerné rozloženie ultrazvukovej energie vo vrtoch
- Výrazné zníženie počtu krokov pri manipulácii so vzorkami
Pri veľkých projektoch skríningu ChIP-seq alebo vysoko výkonných epigenetických štúdiách poskytuje sonikácia mikrotitračných platní výnimočnú škálovateľnosť a účinnosť. Sonikátor UIP400MTP s viacerými jamkami je vhodný na integrácia do systémov na manipuláciu s kvapalinami a automatizovaných laboratórnych pracovných postupov.
Prečo si vybrať sonikáciu namiesto iných techník strihania chromatínu?
V porovnaní s enzymatickými prístupmi poskytuje sonikácia pri ChIP nestrannú fragmentáciu, pretože proces nezávisí od aktivity enzýmu špecifického pre danú sekvenciu. To je obzvlášť dôležité pre epigenetické štúdie celého genómu, kde je nevyhnutné rovnomerné pokrytie.
Ďalšou veľkou výhodou je škálovateľnosť. Ultrazvukové systémy dokážu spracovať jednotlivé vzorky, viacero skúmaviek alebo celé mikroplatničky, čo laboratóriám umožňuje vybrať si najvhodnejšiu konfiguráciu pre ich experimentálnu kapacitu.
Napokon, sonikácia poskytuje vynikajúcu kontrolu nad parametrami fragmentácie. Úpravou cyklov, trvania a úrovne výkonu môžu výskumníci spoľahlivo dosiahnuť požadované rozdelenie veľkosti fragmentov.
Fragmentácia chromatínu optimalizovanou sonikáciou vzoriek ChIP.
(a) bez strihu (dlhé fragmenty v géle);
(b) optimálny fragmentačný profil (obohatenie fragmentov s 200-600 bp);
(c) nadmerná fragmentácia DNA (nadmerné zastúpenie fragmentov kratších ako 200 bp)
© Jarillo a kol., 2018
Porovnanie techník strihania chromatínu
| Metóda strihania chromatínu | Princíp | Výhody | Obmedzenia |
| Ultrazvukom | Vysokofrekvenčná akustická energia mechanicky fragmentuje chromatín. | Fragmentácia bez použitia činidiel, vysoko reprodukovateľné výsledky, nastaviteľná distribúcia veľkosti fragmentov, kompatibilita so zosieťovaným chromatínom, možnosť škálovania z jednotlivých skúmaviek na formáty s viacerými vzorkami a mikrotitračné platne. | Vyžaduje sonikačné zariadenie a optimalizáciu parametrov sonikácie. |
| Enzymatická digescia (MNáza) | Mikrokoková nukleáza štiepi DNA medzi nukleozómami. | Šetrná fragmentácia a užitočná na analýzu natívneho chromatínu. | Enzýmové skreslenie, preferencia sekvencie, ťažko kontrolovateľné trávenie, potenciálna variabilita medzi experimentmi. |
| Mechanické strihanie (ihla/striekačka) | Chromatín sa narúša opakovaným fyzikálnym pôsobením. | Jednoduchá metóda, ktorá si vyžaduje minimálne vybavenie. | Slabá reprodukovateľnosť, obmedzená kontrola veľkosti fragmentov, prácnosť pri viacerých vzorkách. |
| Nebulizácia | Stlačený vzduch vytláča DNA cez malé otvory a spôsobuje jej fragmentáciu. | Proces rýchlej fragmentácie. | Možná strata vzorky, obmedzená škálovateľnosť, vyžaduje špecializované vybavenie. |
Ako kvantifikovať a kvalifikovať výťažok chromatínu po ultrazvukovej fragmentácii?
Po sonikácii pri ChIP musia výskumníci vyhodnotiť množstvo aj kvalitu fragmentovaného chromatínu. Tento overovací krok zabezpečuje, že fragmentácia chromatínu spĺňa požiadavky následných aplikácií, ako je ChIP-qPCR alebo ChIP-seq.
Kvantifikácia sa zvyčajne začína meraním koncentrácie DNA. Spektrofotometrické metódy, ako je analýza Nanodrop, alebo fluorometrické testy, ako je kvantifikácia DNA Qubit, poskytujú spoľahlivé odhady výťažku chromatínu po dekroslinkovaní a purifikácii.
Samotná koncentrácia DNA však neodhaľuje, či bola fragmentácia úspešná. Výskumníci preto hodnotia distribúciu veľkosti fragmentov pomocou elektroforetických techník. Elektroforéza v agarózovom géle zostáva bežne používaným prístupom na vizualizáciu fragmentov DNA a overenie, či väčšina z nich spadá do cieľového rozsahu veľkosti.
Pokročilejšie laboratóriá často používajú systémy kapilárnej elektroforézy, ako je napríklad Bioanalyzer alebo TapeStation od spoločnosti Agilent. Tieto platformy poskytujú presné profily rozdelenia veľkosti a umožňujú výskumníkom zistiť nadmernú fragmentáciu alebo neúplné strihanie.
Pri hodnotení kvality chromatínu po ultrazvukovej fragmentácii výskumníci zvyčajne potvrdzujú:
- Väčšina fragmentov DNA sa nachádza v rozmedzí 100-600 bp
- Rozdelenie fragmentov je konzistentné vo všetkých opakovaných vzorkách
- Degradácia DNA je minimálna
- Celkový výťažok chromatínu je dostatočný pre plánovaný test ChIP
Správna kontrola kvality zabezpečuje, že krok ultrazvukového strihania chromatínu poskytuje reprodukovateľné a biologicky významné výsledky.
Záver: Ultrazvukové strihanie chromatínu pre spoľahlivý výskum
Spoľahlivé strihanie chromatínu je základom úspešného výskumu ChIP a epigenetiky. Ultrazvuková fragmentácia ponúka výkonné riešenie, pretože umožňuje presné, reprodukovateľné a bez použitia činidiel narušenie chromatínu v širokom spektre experimentálnych formátov.
Starostlivou optimalizáciou parametrov sonikácie, overením distribúcie veľkosti fragmentov a výberom vhodného sonikačného systému – či už ide o sonikátor typu sonda, viacrúrkový sonikátor VialTweeter alebo vysoko výkonný mikrotitračný sonikátor UIP400MTP – výskumníci môžu dosiahnuť konzistentnú fragmentáciu chromatínu, ktorá podporuje vysokokvalitné výsledky ChIP a ChIP-seq.
Keďže výskum epigenetiky sa naďalej rozširuje smerom k vyššej výkonnosti a väčšej reprodukovateľnosti experimentov, ultrazvukové strihanie chromatínu zostáva jednou z najvšestrannejších a najspoľahlivejších metód, ktoré sú k dispozícii v moderných laboratóriách molekulárnej biológie.
Dizajn, výroba a poradenstvo – Kvalita vyrobená v Nemecku
Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojou najvyššou kvalitou a dizajnovými štandardmi. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných zariadení. Drsné podmienky a náročné prostredie ľahko zvládnu ultrazvukové prístroje Hielscher.
Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a užívateľskou prívetivosťou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.
Tube rack sonified in the UIP400MTP for chromatin shearing
Literatúra / Referencie
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
často kladené otázky
Čo je to chromatín?
Chromatín je štrukturálny komplex DNA a súvisiacich proteínov, ktorý organizuje genetický materiál v jadre eukaryotických buniek. Hlavnými proteínmi chromatínu sú históny, okolo ktorých sa DNA obaľuje a vytvára nukleozómy. Táto organizácia zhutňuje DNA a zároveň reguluje prístup ku genetickej informácii pre procesy, ako je transkripcia, replikácia a oprava DNA.
Aké sú typy chromatínu?
Chromatín sa vo všeobecnosti delí na dve hlavné formy: euchromatín a heterochromatín. Euchromatín je voľne usporiadaný a transkripčne aktívny, čo umožňuje ľahký prístup ku génom transkripčným mechanizmom. Heterochromatín je hustejšie usporiadaný a transkripčne neaktívny, zvyčajne obsahuje opakujúce sa sekvencie DNA alebo gény, ktoré sú umlčané. Heterochromatín možno ďalej rozdeliť na konštitutívny heterochromatín, ktorý zostáva trvalo kondenzovaný, a fakultatívny heterochromatín, ktorý môže prechádzať medzi aktívnym a neaktívnym stavom v závislosti od bunkových podmienok.
Čo je zosieťovanie?
Sieťovanie je biochemický proces, ktorý sa používa na stabilizáciu interakcií medzi biomolekulami vytvorením kovalentných väzieb medzi nimi. Vo výskume chromatínu sa sieťovanie bežne používa na zachovanie interakcií proteín-DNA v chromatíne pred analýzou. Chemické činidlá, ako je formaldehyd, sa zvyčajne používajú na vytvorenie reverzibilných kovalentných väzieb medzi DNA a súvisiacimi proteínmi, čím sa účinne “mrazenie” molekulárne interakcie v určitom časovom okamihu. Táto stabilizácia umožňuje fragmentáciu a spracovanie chromatínových komplexov bez toho, aby sa stratili prirodzené väzby medzi DNA a regulačnými proteínmi, čo je nevyhnutné pre techniky, ako je imunoprecipitácia chromatínu (ChIP).
Čo je ChIP?
Chromatínová imunoprecipitácia (ChIP) je technika molekulárnej biológie používaná na skúmanie interakcií medzi proteínmi a DNA v chromatíne. Pri tejto metóde sa komplexy DNA-proteín najprv stabilizujú, zvyčajne zosieťovaním, a potom sa chromatín fragmentuje. Na imunoprecipitáciu komplexov proteín-DNA sa používajú protilátky špecifické pre cieľový proteín, čo umožňuje izolovať a analyzovať súvisiace sekvencie DNA.
Na čo sa používa ChIP?
ChIP sa používa na identifikáciu genómových oblastí viazaných na špecifické proteíny asociované s DNA, ako sú transkripčné faktory, modifikácie histónov alebo regulačné proteíny asociované s chromatínom. Táto technika sa široko používa na štúdium regulácie génov, epigenetických modifikácií, väzobných miest transkripčných faktorov a štruktúry chromatínu. V kombinácii s nadväzujúcimi analytickými metódami, ako je kvantitatívna PCR (ChIP-qPCR) alebo vysoko výkonné sekvenovanie (ChIP-seq), umožňuje mapovanie interakcií proteín-DNA v celom genóme.
Aké sú typy ChIP?
Existuje niekoľko variantov imunoprecipitácie chromatínu v závislosti od experimentálneho plánu a následnej analýzy. Medzi najbežnejšie prístupy patrí ChIP-qPCR, ktorá kvantifikuje obohatenie špecifických genomických oblastí; ChIP-seq, ktorá využíva sekvenovanie novej generácie na mapovanie interakcií proteín-DNA v genóme; a ChIP-chip, ktorá kombinuje ChIP s analýzou mikročipov DNA. V závislosti od skúmanej biologickej otázky sa vo veľkej miere používajú aj ďalšie varianty, ako napríklad natívny ChIP (N-ChIP), ktorý analyzuje nezosieťovaný chromatín, a zosieťovaný ChIP (X-ChIP), ktorý využíva chemické zosieťovanie na stabilizáciu interakcií proteín-DNA.
Vysoko výkonné strihanie chromatínu pomocou sonikátora UIP400MTP
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratórium do priemyselná veľkosť.