Strihanie chromatínu sonikáciou

Strihanie chromatínu je kľúčovým krokom v mnohých pracovných postupoch v epigenetike a molekulárnej biológii, najmä pri imunoprecipitácii chromatínu (ChIP), ChIP-seq a súvisiacich analýzach. Cieľom je fragmentovať chromatín na reprodukovateľné komplexy DNA a proteínov pri zachovaní integrity epitopov a minimalizácii strát vzorky. Spomedzi dostupných metód sa ultrazvuková fragmentácia chromatínu stala široko používaným prístupom, pretože poskytuje spoľahlivú fragmentáciu bez použitia reagencií s vynikajúcou reprodukovateľnosťou.

Čo treba zohľadniť pri strihaní chromatínu?

Účinné strihanie chromatínu si vyžaduje dôslednú kontrolu experimentálnych parametrov. Nesprávna fragmentácia môže ohroziť následné experimenty ChIP tým, že vzniknú fragmenty, ktoré sú príliš veľké, nadmerne degradované alebo sa medzi vzorkami líšia.
Jedným z najdôležitejších faktorov je požadované rozdelenie veľkostí fragmentov. Pre väčšinu aplikácií ChIP a ChIP-seq sú optimálne fragmenty chromatínu s dĺžkou od 100 do 600 párov báz. Tento rozsah veľkostí umožňuje účinnú imunoprecipitáciu a zároveň poskytuje dostatočné rozlíšenie na mapovanie genómu.

Ďalším kľúčovým faktorom je účinnosť zosieťovania pred sonikáciou. Väčšina pracovných postupov ChIP zahŕňa fixáciu formaldehydom na stabilizáciu interakcií medzi proteínmi a DNA. Nadmerné zosieťovanie však môže zvýšiť odolnosť chromatínu voči fragmentácii, čo si vyžaduje dlhšie časy sonikácie a potenciálne zvyšuje vystavenie teplu.
Zásadná je aj regulácia teploty. Sonikácia vytvára lokálne koncentrovanú energiu, ktorá môže zvýšiť teplotu vzorky. Zvýšené teploty môžu poškodiť DNA alebo denaturovať proteíny, čo ovplyvňuje ich rozpoznávanie protilátkami počas ChIP. Mnohí výskumníci preto používajú cykly pulznej sonikácie v kombinácii s intervalmi chladenia, aby zachovali stabilitu vzorky.
Účinnosť fragmentácie ovplyvňujú aj koncentrácia a objem vzorky. Vysoko koncentrované suspenzie chromatínu môžu vyžadovať dlhšie časy sonikácie, zatiaľ čo malé objemy vzoriek vyžadujú presné dodávanie energie, aby sa zabránilo nadmernému spracovaniu.
Napokon, výber sonikačného zariadenia výrazne ovplyvňuje reprodukovateľnosť experimentov. Zariadenia určené na strihanie chromatínu zvyčajne poskytujú riadenú ultrazvukovú energiu a štandardizovanú manipuláciu so vzorkami, čo umožňuje konzistentnú fragmentáciu vo viacerých vzorkách.

Ktorý sonikátor si vybrať na strihanie chromatínu?

Rôzne laboratórne pracovné postupy vyžadujú rôzne konfigurácie sonikácie. Optimálny systém závisí do veľkej miery od počtu vzoriek spracovaných za jednotku času, objemu a usporiadania experimentu.

Sondový sonikátor

Sondový sonikátor dodáva ultrazvukovú energiu priamo do vzorky prostredníctvom titánovej sondy. Táto konfigurácia poskytuje veľmi vysokú hustotu energie, a preto je vhodná na intenzívne rozrušovanie chromatínu v jednotlivých vzorkách.

Sondové sonikátory sú obzvlášť užitočné pre:

• Malé až stredné počty vzoriek
• Chromatín, ktorý sa ťažko fragmentuje
• Flexibilné experimentálne protokoly

Sonikátor pre viacero skúmaviek – VialTweeter

Pre laboratóriá, ktoré spracúvajú viacero vzoriek súčasne, predstavuje sonikátor pre viacero skúmaviek VialTweeter riešenie s vysokou reprodukovateľnosťou. Systém prenáša ultrazvukovú energiu nepriamo cez držiak liekoviek, čo umožňuje fragmentovať vzorky vo viacerých uzavretých skúmavkách za rovnakých podmienok.

Táto konfigurácia ponúka významné výhody:

• Paralelné strihanie chromatínu vo viacerých vzorkách
• Eliminácia kontaminácie sondy
• Vysoká reprodukovateľnosť medzi skúmavkami
• Zjednodušený pracovný postup prípravy vzoriek na ChIP

Takéto systémy pre viacero skúmaviek sú vhodné na rutinné experimenty ChIP a štúdie so stredným počtom vzoriek spracovaných za jednotku času.
 

Sonikátor pre mikrotitračné doštičky – UIP400MTP

Epigenetické štúdie s vysokou priepustnosťou sa čoraz viac spoliehajú na spracovanie vzoriek v mikrotitračných doštičkách. Sonikátor pre mikrotitračné doštičky UIP400MTP je navrhnutý na fragmentáciu chromatínu priamo v štandardných mikrotitračných doštičkách bez prenášania vzoriek.

Tento prístup umožňuje:

• Súčasné spracovanie desiatok alebo stoviek vzoriek
• Pracovné postupy vhodné na automatizáciu
• Rovnomerné rozloženie ultrazvukovej energie medzi jamkami
• Výrazné zníženie počtu krokov manipulácie so vzorkami

Pri rozsiahlych skríningových projektoch ChIP-seq alebo epigenetických štúdiách s vysokou priepustnosťou poskytuje sonikácia v mikrotitračných platničkách výnimočnú škálovateľnosť a účinnosť. Sonikátor pre viacjamkové platničky UIP400MTP je veľmi vhodný na integráciu do systémov na manipuláciu s kvapalinami a automatizovaných laboratórnych pracovných postupov.
 

Prečo uprednostniť sonikáciu pred inými technikami fragmentácie chromatínu?

V porovnaní s enzymatickými prístupmi poskytuje sonikácia pre ChIP neskreslenú fragmentáciu, pretože tento proces nezávisí od sekvenčne špecifickej aktivity enzýmov. To je obzvlášť dôležité pri epigenetických štúdiách celého genómu, pri ktorých je rovnomerné pokrytie nevyhnutné.
Ďalšou významnou výhodou je škálovateľnosť. Ultrazvukové systémy umožňujú spracovanie jednotlivých vzoriek, viacerých skúmaviek alebo celých mikrotitračných platničiek, vďaka čomu si laboratóriá môžu vybrať najvhodnejšiu konfiguráciu pre požadovanú priepustnosť spracovania vzoriek v experimentoch.
Napokon sonikácia poskytuje vynikajúcu kontrolu nad parametrami fragmentácie. Úpravou pulzných cyklov, trvania a úrovní výkonu môžu výskumníci spoľahlivo dosiahnuť požadované rozdelenie veľkostí fragmentov.

Ako kvantifikovať výťažok chromatínu a posúdiť jeho kvalitu po ultrazvukovej fragmentácii?

Po sonikácii pre ChIP musia výskumníci vyhodnotiť množstvo aj kvalitu fragmentovaného chromatínu. Tento overovací krok zabezpečuje, že fragmentácia chromatínu spĺňa požiadavky následných aplikácií, ako sú ChIP-qPCR alebo ChIP-seq.
Kvantifikácia sa zvyčajne začína meraním koncentrácie DNA. Spektrofotometrické metódy, ako je analýza pomocou Nanodrop, alebo fluorometrické stanovenia, ako je kvantifikácia DNA pomocou Qubit, poskytujú spoľahlivé odhady výťažku chromatínu po odstránení priečnych väzieb a purifikácii.
Samotná koncentrácia DNA však neprezrádza, či bola fragmentácia úspešná. Výskumníci preto hodnotia rozdelenie veľkostí fragmentov pomocou elektroforetických techník. Elektroforéza v agarózovom géli zostáva bežne používaným prístupom na vizualizáciu fragmentov DNA a overenie, že väčšina z nich spadá do cieľového rozsahu veľkostí.
Pokročilejšie laboratóriá často používajú systémy kapilárnej elektroforézy, ako sú Agilent Bioanalyzer alebo TapeStation. Tieto platformy poskytujú presné profily rozdelenia veľkostí a umožňujú výskumníkom odhaliť nadmernú fragmentáciu alebo neúplnú fragmentáciu.

Pri hodnotení kvality chromatínu po ultrazvukovej fragmentácii výskumníci zvyčajne overujú, či:

• Väčšina fragmentov DNA spadá do rozsahu 100–600 bp
• Rozdelenie fragmentov je konzistentné medzi replikátmi vzoriek
• Degradácia DNA je minimálna
• Celkový výťažok chromatínu je dostatočný na plánovaný test ChIP

Správna kontrola kvality zabezpečuje, že krok ultrazvukovej fragmentácie chromatínu poskytuje reprodukovateľné a biologicky relevantné výsledky.

Záver: Ultrazvuková fragmentácia chromatínu pre spoľahlivý výskum

Spoľahlivá fragmentácia chromatínu je základom úspešného výskumu pomocou ChIP a výskumu v oblasti epigenetiky. Ultrazvuková fragmentácia ponúka účinné riešenie, pretože umožňuje presné a reprodukovateľné narušenie chromatínu bez použitia reagencií v širokej škále experimentálnych formátov.
Dôslednou optimalizáciou parametrov sonikácie, overovaním distribúcie veľkosti fragmentov a výberom vhodného sonikačného systému – či už sondového sonikátora, sonikátora VialTweeter na viacero skúmaviek alebo vysokokapacitného sonikátora mikrotitračných platničiek UIP400MTP – môžu výskumníci dosiahnuť konzistentnú fragmentáciu chromatínu, ktorá podporuje vysokú kvalitu výsledkov ChIP a ChIP-seq.
Keďže výskum v oblasti epigenetiky naďalej smeruje k vyššej kapacite spracovania vzoriek a väčšej reprodukovateľnosti experimentov, ultrazvuková fragmentácia chromatínu zostáva jednou z najuniverzálnejších a najspoľahlivejších metód dostupných pre moderné laboratóriá molekulárnej biológie.

Návrh, výroba a poradenstvo – kvalita vyrobená v Nemecku

Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojimi najvyššími štandardmi kvality a dizajnu. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných prevádzok. Ultrazvukové prístroje Hielscher ľahko zvládajú drsné podmienky a náročné prostredia.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť certifikovaná podľa ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a jednoduchou obsluhou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v zhode s požiadavkami CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.

Literatúra / Referencie

• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
• Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
• José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
• Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)