Экстракция белка из опухолевой ткани с помощью ультразвука – протокол

В этом протоколе описан метод выделения белков из опухолевых тканей с помощью соникации, который расширяет стандартный рабочий процесс лизиса мочевины CPTAC за счет добавления этапа контролируемого зондирования во время разрушения ткани. Опираясь на разработанную стратегию подготовки протеома и фосфопротеома в глубоком масштабе CPTAC, эта модификация улучшает разрушение клеточных и субклеточных структур, снижает вязкость образца и улучшает выделение белков, которые обычно трудно извлечь только с помощью лизиса мочевины, особенно мембраносвязанных и ДНК-связывающих или связанных с ядром белков. В исследовании, положенном в основу, рабочий процесс с использованием соникации увеличил обнаружение как белков, так и фосфопептидов, сохранив при этом совместимость с последующим перевариванием в стиле CPTAC, маркировкой TMT, фракционированием, обогащением фосфопептидами и анализом методом ЖХ-МС/МС.

Экстракция белков из опухолевой ткани с помощью ультразвука для глубокого протеомного и фосфопротеомного анализа

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Область применения протокола

Используйте эту процедуру для:

• свежезамороженная, криопульверизированная опухолевая ткань
• гранулы клеток или другие биологические образцы, в которых уже применяется экстракция мочевиной
• глобальные рабочие процессы протеомики и фосфопротеомики с использованием триптического переваривания и дополнительной маркировки TMT

В исследовании Li et al. (2025) говорится, что этот рабочий процесс применим и к другим типам образцов, таким как клеточные линии, кровь и моча, однако может потребоваться оптимизация в зависимости от типа образца.

Оптимизированный рабочий процесс пробоподготовки с реализованным этапом соникации. Оптимизированный рабочий процесс и экспериментальный дизайн основаны на протоколе пробоподготовки CPTAC для глобального протеомного и фосфопротеомного анализа.
Исследование и схема: ©Li et al., 2025

Принцип работы

В оригинальном исследовании к стандартному процессу лизиса мочевины CPTAC добавили соникацию и обнаружили улучшенное обнаружение белков, связанных с мембранами и ядрами. Авторы утверждают, что параметры соникации должны быть точно отрегулированы в зависимости от размера/концентрации образца – путем выбора размера сонотрода, потребляемой энергии и времени импульса.

Например, для Hielscher UP200Ht и UP200St это означает:

• использовать амплитуду и режим импульсов в качестве основных управляющих переменных
• держите образцы в холоде (например, на льду)
• начните с консервативных настроек
• оптимизация в зависимости от чистоты образца, температуры, выхода белка и качества пептидов на выходе

 
Обе модели ультразвуковых гомогенизаторов Hielscher UP200Ht и UP200St мощностью 200 Вт предназначены для малых и средних объемов проб, с регулируемыми настройками амплитуды и импульса; оба ультразвуковых гомогенизатора имеют цифровое сенсорное управление для точной настройки параметров, автоматическую регистрацию данных, подключаемый датчик температуры, дистанционное управление, подсветку проб.
 

Реагенты для экстракции белков с помощью ультразвука

Буфер для лизиса с мочевиной

Приготовьте свежий продукт непосредственно перед использованием:

• 8 М мочевины
• 75 мМ NaCl
• 50 мМ Трис, pH 8,0
• 1 мМ ЭДТА
• 2 мкг/мл апротинина
• 10 мкг/мл леупептина
• 1 мМ PMSF
• 10 мМ NaF
• 20 мкМ PUGNAc
• Коктейль ингибиторов фосфатазы 2, 1:100 (v/v)
• Коктейль ингибиторов фосфатазы 3, 1:100 (v/v)

Мочевина должна быть полностью растворена перед добавлением добавок; ингибиторы следует добавлять непосредственно перед использованием; буфер следует хранить на льду; после добавления добавок рекомендуется не энергичное перемешивание, а взбалтывание.
 

Дополнительные реагенты:

• Реактивы для анализа белка BCA
• 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0
• DTT
• Йодоацетамид
• LysC
• трипсин
• Муравьиная кислота
• Реагенты TMT, если используется мультиплексная количественная протеомика
• Реагенты IMAC, если проводится обогащение фосфопептидов

Оборудование для экстракции белков с помощью ультразвука

Требуется

Рекомендуемый выбор датчика

Для образцов объемом 200-1000 мкл используйте сонотрод малого диаметра, подходящий для прямой высокоинтенсивной обработки небольших объемов. Компания Hielscher предлагает сонотроды разных диаметров, а меньший диаметр наконечника обеспечивает более высокую интенсивность на кончике.

Практическое замечание: Используйте самый маленький зонд, который обеспечивает эффективное перемешивание без чрезмерного вспенивания или контакта со стенками емкости.

Если вы работаете с несколькими образцами одновременно, вы можете рассмотреть следующие варианты Многотрубный звукосниматель VialTweeter или Микропланшетный звуковой анализатор UIP400MTP!

Пошаговые инструкции: Процедура экстракции белка с помощью ультразвука

A. Предварительное охлаждение и подготовка

1. Охладите центрифугу до 4°C.
2. Приготовьте свежий буфер для лизиса с мочевиной и держите его на льду.
3. Установите UP200Ht или UP200St на подставку внутри звукового корпуса.
4. Подготовьте баню со льдом, достаточно большую, чтобы пробирки с образцами стояли вертикально и устойчиво.

Подготовка свежего буфера и обработка холодом имеют решающее значение.

B. Первоначальное извлечение мочевины

1. Храните криопульверизированные ткани на льду.
2. Добавьте 200 мкл охлажденного буфера для лизиса с мочевиной на 50 мг влажной ткани.
3. Вихрь 5-10 с на высокой скорости.
4. Инкубируйте 15 минут при 4°C.
5. Повторите шаг "вихрь плюс инкубация" еще раз.
6. Центрифугируйте при 20 000g в течение 10 минут при 4°C.
7. Перенесите лизат/супернатант в чистую пробирку с низкой плотностью.

C. Сонизация с использованием UP200Ht или UP200St

Начальные условия для соникации

• Амплитуда: начинайте с 20-30%.
• Длительность импульса: 5 с ВКЛ.
• Охлаждение: 2 минуты на льду между импульсами
• Количество циклов: 4 цикла
• Общее время активного соника: 20 с
• Общее время процесса, включая охлаждение: около 8-10 минут

Этапы соникации

1. Перенесите лизат в пробирку, подходящую для соникации. Используйте узкую тонкостенную пробирку, обеспечивающую хороший теплообмен и безопасное погружение зонда.
2. Поместите пробирку в ванну со льдом. В статье говорится, что охлаждение во время соникации является критически важным для предотвращения теплового повреждения.
3. Погрузите наконечник зонда в образец. Держите наконечник достаточно погруженным для стабильной кавитации, но не позволяйте ему касаться стенок или дна пробирки.
4. Запустите один импульс длительностью 5 с с начальной амплитудой.
5. Немедленно верните образец на лед на 2 мин.
6. Повторяйте до тех пор, пока не будет выполнено 4 цикла.
7. Проверьте лизат после цикла.
8. Продолжайте только при необходимости, используя один дополнительный импульс длительностью 5 с за раз, всегда с последующим полным охлаждением.
9. Остановите процесс, когда лизат станет более однородным и менее вязким.
   Конечной точкой является более прозрачный лизат, образующий капли, а не непрерывный вязкий поток.
10. Центрифугируйте при 16 000g в течение 15 минут при 4°C.
11. Перенесите осветленный супернатант в свежую пробирку и измерьте концентрацию белка.

Сравнение глобальной протеомики и фосфопротеомики между сонированными и несонированными образцами.
a. Количество идентифицированных белков (глобальная протеомика) во всех опухолевых тканях PDX с соникацией и без нее. b. Количество идентифицированных фосфопептидов (обогащение IMAC) во всех опухолевых тканях PDX с соникацией и без нее. Учитывались только белки и фосфопептиды с коэффициентом обилия, превышающим или равным 25-му процентилю. Соотношение обилия было рассчитано между одинаковыми типами образцов.
Исследование и графики: ©Li et al., 2025

Переработка и анализ

После соникации и осветления действуйте, как описано в оригинальном рабочем процессе в стиле CPTAC:

1. Разбавьте лизат 1:3 (v/v) с 50 мМ Трис-HCl pH 8,0, чтобы уменьшить количество мочевины до <2 M.
2. Добавьте LysC в концентрации 1 мАЕ на 50 мкг белка и инкубируйте 2 ч при 25°C.
3. Добавьте трипсин в соотношении 1:49 фермент:субстрат (в/б) и переваривайте в течение ночи при 25°C.
4. Гасите муравьиной кислотой до конечной концентрации 1%.
5. Продолжайте обессоливание, маркировку ТМТ, фракционирование, обогащение фосфопептидами и ЖХ-МС/МС по мере необходимости.

Дифференциальная экспрессия фосфопептидов из ТМТ-меченых МС.
a. Базальный подтип, выделение некоторых фосфопептидов человека (начало и конец белковой последовательности), повышенных в сонизированных образцах по сравнению с несонизированными образцами. b. Люминальный подтип, выделение некоторых фосфопептидов человека (начало и конец белковой_последовательности), повышенных в сонизированных образцах по сравнению с несонизированными образцами. c. Обогащенные KEGG-пути, основанные на белках с повышенным содержанием фосфопептидов в сонизированных опухолях базального подтипа. d. Обогащенные KEGG-пути, основанные на белках с повышенным содержанием фосфопептидов в сонизированных опухолях люминального подтипа.
Исследование и графики: ©Li et al., 2025

Проектирование, производство и консалтинг – Качество «Сделано в Германии»

Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными условиями окружающей среды.

Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.

Литература / Литература