Экстракция белков из опухолевой ткани с помощью обработки ультразвуком – протокол

Этот протокол описывает метод экстракции белков из опухолевой ткани с помощью обработки ультразвуком, который совершенствует стандартный рабочий процесс CPTAC с лизисом в мочевине за счёт добавления контролируемого этапа обработки ультразвуковым зондом при разрушении ткани. Эта модификация, основанная на установленной стратегии CPTAC для подготовки образцов к углублённому анализу протеома и фосфопротеома, улучшает разрушение клеток и субклеточных структур, снижает вязкость образца и усиливает высвобождение белков, которые обычно труднее извлечь одним лишь лизисом в мочевине, особенно мембраносвязанных, ДНК-связывающих или ассоциированных с ядром белков. В исследовании, лежащем в основе протокола, рабочий процесс с обработкой ультразвуком увеличил выявление как белков, так и фосфопептидов, сохраняя совместимость с последующими этапами расщепления по схеме CPTAC, мечения TMT, фракционирования, обогащения фосфопептидов и анализа LC-MS/MS.

Экстракция белков из опухолевой ткани с помощью обработки ультразвуком для углублённого протеомного и фосфопротеомного анализа

Следующий протокол оптимизирован для экстракции белков из криоизмельчённой опухолевой ткани в лизирующем буфере с 8 M мочевины: дополнительный этап обработки ультразвуковым зондом улучшает извлечение трудноизвлекаемых классов белков, особенно ассоциированных с мембранами и ДНК/ядром, перед расщеплением и последующим анализом LC-MS/MS. В исследовании Li et al. (2025), лежащем в основе протокола, добавление обработки ультразвуком увеличило выявление белков, ассоциированных с мембранами и ядром, и обеспечило углублённый охват >12 000 белков и >25 000 фосфопептидов в рамках использованного авторами рабочего процесса.

Область применения протокола

Используйте эту процедуру для:

• свежезамороженной криоизмельчённой опухолевой ткани
• клеточных осадков или других биологических образцов, для которых экстракция на основе мочевины уже отработана
• рабочих процессов глобального протеомного и фосфопротеомного анализа с триптическим расщеплением и необязательным мечением TMT

В исследовании Li et al. (2025) указано, что рабочий процесс также применим к другим типам образцов, таким как клеточные линии, кровь и моча, однако в зависимости от типа образца может потребоваться оптимизация.

Оптимизированный рабочий процесс подготовки образцов с включённым этапом обработки ультразвуком. Оптимизированный рабочий процесс и план эксперимента основаны на протоколе CPTAC подготовки образцов для глобального протеомного и фосфопротеомного анализа.
Исследование и схема: ©Li et al., 2025

Принцип действия

В исходном исследовании обработку ультразвуком добавили к стандартному рабочему процессу CPTAC с лизисом в мочевине и выявили улучшенное обнаружение белков, ассоциированных с мембранами и ядрами. Авторы указывают, что параметры обработки ультразвуком необходимо точно подбирать с учётом размера/концентрации образца – выбирая размер сонотрода, подводимую энергию и временные параметры импульсов.

Например, для Hielscher UP200Ht и UP200St это означает:

• используйте амплитуду и импульсный режим в качестве основных регулируемых параметров
• поддерживайте образцы холодными на протяжении всей процедуры (то есть на льду)
• начинайте со щадящих настроек
• оптимизируйте параметры с учётом прозрачности образца, температуры, выхода белка и качества пептидов на последующих этапах

 
Обе модели ультразвуковых гомогенизаторов Hielscher мощностью 200 Вт, UP200Ht и UP200St, предназначены для малых и средних объёмов образцов и имеют регулируемые настройки амплитуды и импульсов; оба ультразвуковых гомогенизатора оснащены цифровым управлением через сенсорный экран для точной настройки параметров, автоматической регистрацией данных, подключаемым датчиком температуры, дистанционным управлением и подсветкой образца.
 

Реагенты для экстракции белков с помощью обработки ультразвуком

Лизирующий буфер с мочевиной

Приготовьте свежий буфер непосредственно перед использованием:

• 8 M мочевины
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL апротинина
• 10 µg/mL лейпептина
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Коктейль ингибиторов фосфатаз 2, 1:100 (v/v)
• Коктейль ингибиторов фосфатаз 3, 1:100 (v/v)

Мочевина должна полностью раствориться до внесения добавок; ингибиторы следует добавлять непосредственно перед использованием; буфер следует держать на льду; после внесения добавок рекомендуется перемешивание круговыми движениями, а не интенсивное перемешивание на вортексе.
 

Дополнительные реагенты:

• Реагенты для определения белка методом BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Йодацетамид
• LysC
• Трипсин
• Муравьиная кислота
• Реагенты TMT, если используется мультиплексная количественная протеомика
• Реагенты IMAC, если выполняется обогащение фосфопептидов

Оборудование для экстракции белков с помощью обработки ультразвуком

Необходимое оборудование

Рекомендации по выбору зонда

Для образцов объёмом около 200–1000 µL используйте сонотрод малого диаметра, подходящий для прямой высокоинтенсивной обработки малых объёмов. Hielscher предлагает сонотроды различных диаметров, причём меньшие диаметры наконечника обеспечивают более высокую интенсивность на наконечнике.

Практическое примечание: используйте самый маленький зонд, который обеспечивает эффективное перемешивание без чрезмерного пенообразования или контакта со стенкой сосуда.

Если вы работаете с несколькими образцами одновременно, можно рассмотреть ультразвуковой гомогенизатор VialTweeter для нескольких пробирок или ультразвуковой гомогенизатор UIP400MTP для микропланшетов!

Пошаговые инструкции: процедура экстракции белков с помощью обработки ультразвуком

A. Предварительное охлаждение и подготовка

1. Охладите центрифугу до 4°C.
2. Приготовьте свежий лизирующий буфер с мочевиной и держите его на льду.
3. Установите UP200Ht или UP200St на штатив внутри звукоизолирующего кожуха.
4. Подготовьте ледяную баню достаточного размера, чтобы пробирки с образцами устойчиво стояли вертикально.

Приготовление свежего буфера и работа в холодных условиях имеют критическое значение.

B. Первоначальная экстракция мочевиной

1. Держите криоизмельчённую ткань на льду.
2. Добавьте 200 µL охлаждённого лизирующего буфера с мочевиной на 50 mg влажной ткани.
3. Перемешивайте на вортексе 5–10 s на высокой скорости.
4. Инкубируйте 15 min при 4°C.
5. Повторите этап перемешивания на вортексе с последующей инкубацией ещё один раз.
6. Центрифугируйте при 20 000g в течение 10 min при 4°C.
7. Перенесите лизат/супернатант в чистую пробирку с низким связыванием белков.

C. Обработка ультразвуком с использованием UP200Ht или UP200St

Начальные условия обработки ультразвуком

• Амплитуда: начните с 20–30%
• Длительность импульса: 5 s во включённом состоянии
• Охлаждение: 2 min на льду между импульсами
• Количество циклов: 4 цикла
• Общее время активной обработки ультразвуком: 20 s
• Общее время процесса с учётом охлаждения: около 8–10 min

Этапы обработки ультразвуком

1. Перенесите лизат в пробирку, подходящую для обработки ультразвуком. Используйте узкую тонкостенную пробирку, обеспечивающую хороший теплообмен и безопасное погружение зонда.
2. Поместите пробирку в ледяную баню. В статье охлаждение во время обработки ультразвуком названо критически важным для предотвращения теплового повреждения.
3. Погрузите наконечник зонда в образец. Наконечник должен быть погружён достаточно глубоко для стабильной кавитации, но не должен касаться стенки или дна пробирки.
4. Выполните один импульс длительностью 5 s при начальной амплитуде.
5. Немедленно верните образец полностью на лёд на 2 min.
6. Повторяйте до завершения 4 циклов.
7. Осмотрите лизат после цикла.
8. Продолжайте только при необходимости, выполняя по одному дополнительному импульсу длительностью 5 s за раз и всегда обеспечивая полное охлаждение после него.
9. Остановитесь, как только лизат станет более однородным и менее тягучим/вязким.
   Конечная точка – более прозрачный лизат, который образует капли, а не непрерывную вязкую струю.
10. Центрифугируйте при примерно 16 000g в течение 15 min при 4°C.
11. Перенесите осветлённый супернатант в новую пробирку и измерьте концентрацию белка.

Сравнение глобального протеомного и фосфопротеомного анализа образцов, обработанных и не обработанных ультразвуком.
a. Количество идентифицированных белков (глобальный протеомный анализ) во всех опухолевых тканях PDX с обработкой ультразвуком или без неё. b. Количество идентифицированных фосфопептидов (обогащение IMAC) во всех опухолевых тканях PDX с обработкой ультразвуком или без неё. Учитывались только белки и фосфопептиды с отношением содержания, большим или равным 25-му процентилю. Отношение содержания рассчитывалось между образцами одного и того же типа.
Исследование и графики: ©Li et al., 2025

Последующее расщепление и анализ

После обработки ультразвуком и осветления продолжайте процедуру, как описано в исходном рабочем процессе по схеме CPTAC:

1. Разбавьте лизат 1:3 (v/v) буфером 50 mM Tris-HCl pH 8,0, чтобы снизить концентрацию мочевины до <2 M.
2. Добавьте LysC из расчёта 1 mAU на 50 µg белка и инкубируйте 2 h при 25°C.
3. Добавьте трипсин в соотношении фермент:субстрат 1:49 (w/w) и проводите расщепление в течение ночи при 25°C.
4. Остановите реакцию добавлением муравьиной кислоты до конечной концентрации 1%.
5. При необходимости переходите к обессоливанию, мечению TMT, фракционированию, обогащению фосфопептидов и LC-MS/MS.

Дифференциальная экспрессия фосфопептидов по данным MS с мечением TMT.
a. Базальный подтип: выделены некоторые фосфопептиды человека (начало и конец белковой последовательности), экспрессия которых повышена в образцах, обработанных ультразвуком, по сравнению с образцами без обработки ультразвуком. b. Люминальный подтип: выделены некоторые фосфопептиды человека (начало и конец белковой последовательности), экспрессия которых повышена в образцах, обработанных ультразвуком, по сравнению с образцами без обработки ультразвуком. c. Обогащённые пути KEGG, определённые на основе белков, соответствующих фосфопептидам с повышенной экспрессией в обработанных ультразвуком опухолях базального подтипа. d. Обогащённые пути KEGG, определённые на основе белков, соответствующих фосфопептидам с повышенной экспрессией в обработанных ультразвуком опухолях люминального подтипа.
Исследование и графики: ©Li et al., 2025

Проектирование, производство и консультирование – качество, созданное в Германии

Ультразвуковые гомогенизаторы Hielscher широко известны высочайшими стандартами качества и конструкции. Прочность и простота эксплуатации позволяют без затруднений интегрировать наши ультразвуковые гомогенизаторы в промышленные установки. Ультразвуковые гомогенизаторы Hielscher легко справляются с суровыми условиями и сложной рабочей средой.

Hielscher Ultrasonics – компания, сертифицированная по ISO, которая уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым гомогенизаторам, отличающимся передовыми технологиями и удобством использования. Разумеется, ультразвуковые гомогенизаторы Hielscher соответствуют требованиям CE и удовлетворяют требованиям UL, CSA и RoHs.

Литература / источники

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.