Экстракция белков с помощью обработки ультразвуком для фосфопротеомики

В современных науках о жизни фосфопротеомика стала ключевой технологией для расшифровки клеточных сигнальных путей и понимания механизмов заболеваний на системном уровне. Поскольку фосфорилирование регулирует важнейшие биологические функции – от активности ферментов до белок-белковых взаимодействий – его точное измерение необходимо как для фундаментальных исследований, так и для трансляционной медицины. Недавние достижения в масс-спектрометрии позволили идентифицировать десятки тысяч событий фосфорилирования в одном эксперименте, что подчёркивает необходимость надёжных, масштабируемых и воспроизводимых рабочих процессов пробоподготовки.
Одним из наиболее значимых достижений в этой области стало внедрение экстракции белков с помощью обработки ультразвуком, которая существенно повышает качество образцов, производительность обработки образцов и воспроизводимость. Ультразвуковые технологии, такие как VialTweeter и UIP400MTP, сегодня меняют подход лабораторий к работе с большими совокупностями образцов, особенно в высокопроизводительной фосфопротеомике.

Научное значение эффективной пробоподготовки в фосфопротеомике

Фосфорилирование белков – это высокодинамичная и обратимая посттрансляционная модификация, затрагивающая большинство белков в клетках человека. Оно регулирует структуру и локализацию белков, а также сети их взаимодействий; нарушения его регуляции связаны с такими заболеваниями, как рак и нейродегенерация.
Однако фосфопротеомный анализ сопряжён с особыми техническими трудностями. Фосфорилированные пептиды часто присутствуют в малых количествах и требуют тщательного обогащения и высокоэффективной предварительной пробоподготовки. Любая недостаточная эффективность экстракции или расщепления белков может привести к потере сигнала, низкой воспроизводимости и неполному охвату сайтов фосфорилирования.
Именно здесь обработка ультразвуком приобретает решающее значение.

Почему обработка ультразвуком меняет подход к экстракции белков

При обработке ультразвуком высокоинтенсивные ультразвуковые волны механически разрушают клетки и ткани, обеспечивая эффективное высвобождение белков из клеток, тканей, биологических жидкостей и внеклеточных везикул. По сравнению с традиционными методами лизиса обработка ультразвуком имеет несколько явных преимуществ:

• Во-первых, она обеспечивает быстрое и равномерное разрушение клеток, что особенно важно для сохранения кратковременных состояний фосфорилирования. В фосфопротеомике даже небольшие задержки или неполный лизис могут изменить профили передачи сигналов, поэтому быстрая и воспроизводимая экстракция необходима.
• Во-вторых, обработка ультразвуком повышает выход белков и улучшает их солюбилизацию, особенно в образцах, трудно поддающихся лизису, таких как плотные ткани или клетки с высоким содержанием мембран. Это непосредственно улучшает последующее расщепление белков и извлечение фосфопептидов.
• В-третьих, ультразвуковая обработка по своей природе масштабируема. Такие устройства, как VialTweeter, позволяют одновременно обрабатывать ультразвуком несколько герметично закрытых пробирок, обеспечивая одинаковые условия обработки всех образцов. Это устраняет вариабельность, возникающую при ручных манипуляциях.
• Для задач, требующих ещё более высокой производительности обработки образцов, UIP400MTP представляет собой значительный технологический прорыв. Он позволяет непосредственно обрабатывать ультразвуком целые микропланшеты или штативы с пробирками, включая виалы автосамплера, что делает его идеальным для параллельной обработки сотен образцов. Эта возможность особенно ценна в системной биологии и клинических исследованиях, где работа с большими совокупностями образцов является стандартной практикой.

Высокопроизводительная обработка ультразвуком: в центре внимания VialTweeter и UIP400MTP

Интеграция современных ультразвуковых устройств в фосфопротеомные рабочие процессы – это не просто удобство, а методологическое усовершенствование.
VialTweeter предназначен для синхронной ультразвуковой обработки нескольких закрытых виал, сводя к минимуму перекрёстное загрязнение и одновременно обеспечивая воспроизводимость. Он особенно подходит для задач со средней производительностью обработки образцов и стандартизированных рабочих процессов.
 

В отличие от него, UIP400MTP оптимизирован для работы с высокой производительностью обработки образцов и обеспечивает:

• Равномерную обработку ультразвуком по всей площади стандартных микропланшетов, например 96-луночных или 384-луночных
• Непосредственную обработку штативов с пробирками и виал автосамплера
• Значительное сокращение времени ручной работы
• Повышенную воспроизводимость в больших наборах данных

Такая масштабируемость идеально соответствует современным подходам фосфопротеомики, в которых рабочие процессы обычно предусматривают параллельную обработку от десятков до сотен образцов.

Общий протокол фосфопротеомной пробоподготовки с помощью обработки ультразвуком

Надёжный фосфопротеомный рабочий процесс объединяет эффективную экстракцию белков, ферментативное расщепление и обогащение фосфопептидами. Приведённая ниже схема отражает устоявшиеся передовые методы, адаптированные к пробоподготовке на основе обработки ультразвуком:

1. Быстрая остановка реакций в образцах и их сбор
   Реакции в клетках или тканях быстро останавливают – обычно путём мгновенного замораживания – для сохранения состояний фосфорилирования. Этот этап имеет решающее значение из-за кратковременного характера событий фосфорилирования.
2. Ультразвуковой лизис клеток и экстракция белков
   Образцы размораживают и подвергают обработке ультразвуком, обычно короткими циклами. Ультразвуковая энергия разрушает клеточные мембраны и эффективно высвобождает белки. В валидированных рабочих процессах обработку ультразвуком проводят в несколько циклов для обеспечения полного лизиса.
   Пример: после размораживания образцов на льду лизис клеток осуществляли обработкой ультразвуком, например с помощью прибора VialTweeter в течение 2 циклов по 1 мин каждый.
3. Осветление и количественное определение белков
   После лизиса образцы центрифугируют для удаления клеточных остатков. Надосадочную жидкость, содержащую растворимые белки, собирают и проводят количественное определение их содержания, чтобы обеспечить одинаковое исходное количество белка во всех образцах.
4. Восстановление и алкилирование
   Дисульфидные связи восстанавливают (например, с помощью DTT) и алкилируют (например, с помощью IAA) для стабилизации белков и повышения эффективности расщепления.
5. Протеолитическое расщепление
   Белки подвергают ферментативному расщеплению, обычно трипсином, получая пептиды, пригодные для масс-спектрометрического анализа. Узнайте больше о расщеплении белков, ускоренном ультразвуком!
6. Очистка и обессоливание пептидов
   Пептиды очищают методами на основе C18 для удаления примесей, которые могут мешать анализу LC-MS.
7. Обогащение фосфопептидами
   Учитывая низкое содержание фосфорилированных пептидов, для избирательного выделения фосфопептидов применяют методы обогащения, такие как аффинные методы на основе Fe-NTA или TiO₂.
8. Анализ LC-MS/MS и обработка данных
   Обогащённые образцы анализируют с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения, часто используя сбор данных, независимый от данных (DIA), для улучшения количественного определения и воспроизводимости.

Примечательно, что крупномасштабные рабочие процессы можно адаптировать к формату 96-луночных планшетов, обеспечивая параллельную обработку вплоть до сотен образцов – этот подход полностью совместим с обработкой ультразвуком с помощью UIP400MTP.
 

Оптимизированный протокол для быстрой остановки реакций фосфопротеома, обогащения фосфопептидами и Phos-DIA-MS.
Протокол и изображение: ©Die et al. 2023

Повышение воспроизводимости и качества данных с помощью обработки ультразвуком

Одна из основных задач фосфопротеомики – достижение согласованных результатов количественного определения в больших наборах данных. Вариабельность, возникающая при пробоподготовке, может скрывать биологически значимые различия.

Обработка ультразвуком решает эту задачу, обеспечивая:

1. Стандартизированное подведение энергии ко всем образцам
2. Снижение вариабельности, связанной с ручной работой
3. Повышенную воспроизводимость экстракции и расщепления белков

При сочетании с высокопроизводительными платформами, такими как UIP400MTP, лаборатории могут достичь уровня согласованности результатов, необходимого для исследований в области системной биологии и выявления клинических биомаркеров.

Будущее фосфопротеомики: автоматизация и масштабируемость

По мере дальнейшего расширения применения фосфопротеомики в крупномасштабных исследованиях и клинической практике потребность в автоматизации и производительности обработки образцов будет только расти. Пробоподготовка на основе обработки ультразвуком, особенно при интеграции с системами, совместимыми с микропланшетами, представляет собой ключевую технологию, открывающую эти возможности.
Объединяя эффективный ультразвуковой лизис, параллельную обработку и совместимость с автоматизированными рабочими процессами, такие устройства, как VialTweeter и UIP400MTP, устанавливают новые стандарты пробоподготовки в протеомике.
Узнайте больше об интеграции UIP400MTP в автоматизированные лабораторные рабочие процессы!

Воспользуйтесь преимуществами пробоподготовки с помощью обработки ультразвуком в фосфопротеомике!

Экстракция белков с помощью обработки ультразвуком стала важнейшим компонентом современной фосфопротеомики, обеспечивая непревзойдённую эффективность, масштабируемость и воспроизводимость. С ростом потребности в анализе сложных биологических систем на больших совокупностях образцов ультразвуковые технологии становятся не просто полезными, а необходимыми.
Обеспечивая высокопроизводительные стандартизированные рабочие процессы, такие решения, как VialTweeter и UIP400MTP, ускоряют открытия в области клеточной передачи сигналов, механизмов заболеваний и прецизионной медицины.

Проектирование, производство и консультирование – качество из Германии

Ультразвуковые приборы Hielscher хорошо известны высочайшими стандартами качества и проектирования. Надёжность и простота эксплуатации позволяют без затруднений интегрировать наши ультразвуковые приборы в промышленные объекты. Ультразвуковые приборы Hielscher легко справляются с суровыми условиями и сложными рабочими средами.

Hielscher Ultrasonics – компания, сертифицированная по ISO, которая уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым приборам, сочетающим передовые технологии и удобство использования. Разумеется, ультразвуковые приборы Hielscher соответствуют требованиям CE и отвечают требованиям UL, CSA и RoHs.

Модели ультразвуковых приборов Hielscher для обработки нескольких образцов: UIP400MTP для микропланшетов, VialTweeter и CupHorn – быстрая пробоподготовка с высокой производительностью обработки образцов