Экстракция белков с помощью ультразвука для фосфопротеомики

В современных науках о жизни фосфопротеомика стала краеугольной технологией для расшифровки клеточных сигнальных путей и понимания механизмов заболеваний на системном уровне. Поскольку фосфорилирование регулирует важнейшие биологические функции – от активности ферментов до белок-белковых взаимодействий – Его точное измерение необходимо как для фундаментальных исследований, так и для трансляционной медицины. Последние достижения в области масс-спектрометрии позволили идентифицировать десятки тысяч событий фосфорилирования за один эксперимент, что подчеркивает необходимость в надежных, масштабируемых и воспроизводимых рабочих процессах подготовки образцов.
Среди наиболее значимых разработок в этой области - внедрение экстракции белков с помощью соникации, которая значительно повышает качество, производительность и воспроизводимость образцов. Ультразвуковые технологии, такие как VialTweeter и UIP400MTP, сегодня по-новому определяют методы работы лабораторий с большими группами образцов, особенно в высокопроизводительной фосфопротеомике.

Научное значение эффективной пробоподготовки в фосфопротеомике

Фосфорилирование белков - это высокодинамичная и обратимая посттрансляционная модификация, затрагивающая большинство белков в клетках человека. Оно регулирует структуру, локализацию и сети взаимодействия белков, а его дисрегуляция связана с такими заболеваниями, как рак и нейродегенерация.
Однако фосфопротеомический анализ представляет собой уникальную техническую задачу. Фосфорилированные пептиды часто малочисленны и требуют тщательного обогащения и высокоэффективной предварительной пробоподготовки. Любая неэффективность при выделении или переваривании белка может привести к потере сигнала, плохой воспроизводимости и неполному охвату фосфосита.
Именно здесь соника приобретает решающее значение.

Почему соникация меняет экстракцию белков

При соникации используются высокоинтенсивные ультразвуковые волны для механического разрушения клеток и тканей, что позволяет эффективно высвобождать белки из клеток, тканей, биологических жидкостей и внеклеточных везикул. По сравнению с традиционными методами лизиса соникация обладает рядом неоспоримых преимуществ:

• Во-первых, он обеспечивает быстрое и равномерное разрушение клеток, что особенно важно для сохранения переходных состояний фосфорилирования. В фосфопротеомике даже незначительные задержки или неполный лизис могут изменить сигнальные профили, поэтому быстрое и воспроизводимое извлечение крайне важно.
• Во-вторых, соникация улучшает выход и солюбилизацию белка, особенно в труднопроницаемых образцах, таких как плотные ткани или богатые мембранами клетки. Это напрямую приводит к лучшему последующему перевариванию и извлечению фосфопептидов.
• В-третьих, ультразвуковая обработка по своей сути масштабируема. Такие устройства, как VialTweeter, позволяют одновременно обрабатывать ультразвуком несколько герметичных пробирок, обеспечивая одинаковые условия обработки для всех образцов. Это устраняет вариабельность, возникающую при ручной обработке.
• Для еще более высоких требований к производительности UIP400MTP представляет собой большой технологический скачок. Он обеспечивает прямое сонирование целых микропланшетов или штативов с пробирками, включая флаконы с автодозатором, что делает его идеальным для параллельной обработки сотен образцов. Эта возможность особенно ценна в системной биологии и клинических исследованиях, где стандартными являются большие когорты образцов.

Высокопроизводительное сонирование: VialTweeter и UIP400MTP в фокусе

Интеграция современных ультразвуковых устройств в фосфопротеомные рабочие процессы - это не просто удобство – это методологическое усовершенствование.
VialTweeter предназначен для синхронизированной ультразвуковой обработки нескольких закрытых флаконов, минимизируя перекрестное загрязнение и обеспечивая воспроизводимость. Он особенно подходит для приложений со средней производительностью и стандартизированных рабочих процессов.
 

В отличие от этого, UIP400MTP оптимизирован для работы в условиях высокой пропускной способности, позволяя:

• Равномерное сонирование по всей площади стандартных микропланшетов, например, 96- или 384-луночных.
• Непосредственная обработка штативов для пробирок и флаконов автодозатора
• Значительное сокращение времени работы
• Повышенная воспроизводимость больших массивов данных

Такая масштабируемость прекрасно согласуется с современными подходами к фосфопротеомике, где рабочие процессы регулярно обрабатывают десятки и сотни образцов параллельно.

Общий протокол подготовки фосфопротеомных образцов с помощью ультразвукового воздействия

Надежный фосфопротеомный рабочий процесс включает в себя эффективную экстракцию белка, ферментативное переваривание и обогащение фосфопептидами. Приведенная ниже схема отражает передовой опыт, адаптированный к подготовке с помощью соникации:

1. Быстрое тушение и сбор образцов
   Клетки или ткани быстро затухают – обычно с помощью моментального замораживания – для сохранения состояния фосфорилирования. Этот шаг имеет решающее значение в связи с преходящим характером событий фосфорилирования.
2. Ультразвуковой лизис клеток и выделение белков
   Образцы размораживаются и подвергаются соникации, как правило, в коротких циклах. Ультразвуковая энергия разрушает клеточные мембраны и эффективно высвобождает белки. В проверенных рабочих процессах соникация проводится в несколько циклов для обеспечения полного лизиса.
   Пример: После размораживания образцов на льду лизис клеток осуществлялся с помощью соникации, например, на приборе Vialtweeter в течение 2 циклов, каждый цикл 1 мин.
3. Осветление и количественное определение белков
   После лизиса образцы центрифугируют для удаления мусора. Супернатант, содержащий растворимые белки, собирают и количественно определяют, чтобы обеспечить постоянство исходных данных для всех образцов.
4. Восстановление и алкилирование
   Дисульфидные связи восстанавливаются (например, с помощью DTT) и алкилируются (например, с помощью IAA), чтобы стабилизировать белки и повысить эффективность переваривания.
5. протеолитическое сбраживание
   Белки подвергаются ферментативному перевариванию, как правило, с помощью трипсина, в результате чего образуются пептиды, пригодные для масс-спектрометрического анализа. Узнайте больше об ускоренном ультразвуком переваривании белков!
6. Очистка и обессоливание пептидов
   Пептиды очищаются методом C18 для удаления загрязнений, которые могут помешать проведению ЖХ-МС анализа.
7. Обогащение фосфопептидов
   Учитывая низкое содержание фосфорилированных пептидов, для селективного выделения фосфопептидов применяются методы обогащения, такие как Fe-NTA или TiO₂ аффинные методы.
8. ЖХ-МС/МС анализ и обработка данных
   Обогащенные образцы анализируются с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения, часто с использованием независимого от данных сбора (DIA) для улучшения количественного определения и воспроизводимости.

Крупномасштабные рабочие процессы могут быть адаптированы к форматам 96-луночных планшетов, что позволяет параллельно обрабатывать до сотен образцов. – подход, полностью совместимый с соникацией на базе UIP400MTP.
 

Оптимизированный протокол для быстрого тушения фосфопротеома, обогащения фосфопептидов и Phos-DIA-MS.
Протокол и изображение: ©Die et al. 2023

Повышение воспроизводимости и качества данных с помощью ультразвука

Одной из главных задач фосфопротеомики является достижение согласованного количественного определения в больших наборах данных. Изменчивость, вносимая при подготовке проб, может затушевать биологически значимые различия.

Звуковое сопровождение решает эту проблему, обеспечивая:

1. Стандартизированный расход энергии для всех образцов
2. Снижение вариативности ручного управления
3. Улучшенная воспроизводимость при экстракции и переваривании белков

В сочетании с такими высокопроизводительными платформами, как UIP400MTP, лаборатории могут достичь уровня согласованности, который необходим для исследований в области системной биологии и клинического обнаружения биомаркеров.

Будущее фосфопротеомики: Автоматизация и масштабируемость

По мере распространения фосфопротеомики на крупномасштабные и клинические исследования потребность в автоматизации и пропускной способности будет только возрастать. Пробоподготовка на основе сонации, особенно при интеграции с системами, совместимыми с микропланшетами, представляет собой ключевую технологию, способствующую этому.
Сочетая эффективный ультразвуковой лизис, параллельную обработку и совместимость с автоматизированными рабочими процессами, такие устройства, как VialTweeter и UIP400MTP, устанавливают новые стандарты в пробоподготовке для протеомики.
Узнайте больше об интеграции UIP400MTP в автоматизированные лабораторные рабочие процессы!

Воспользуйтесь преимуществами подготовки образцов с помощью соникации в фосфопротеомике!

Экстракция белков с помощью ультразвука стала важнейшим компонентом современной фосфопротеомики, обеспечивая непревзойденную эффективность, масштабируемость и воспроизводимость. В условиях растущей потребности в анализе сложных биологических систем на больших группах образцов ультразвуковые технологии не просто выгодны. – они необходимы.
Благодаря высокопроизводительным стандартизированным рабочим процессам такие решения, как VialTweeter и UIP400MTP, ускоряют открытия в области клеточных сигналов, механизмов заболеваний и точной медицины.

Проектирование, производство и консалтинг – Качество «Сделано в Германии»

Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными условиями окружающей среды.

Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.

Многопробочный звуковой аппарат Hielscher моделей UIP400MTP для микропланшетов, VialTweeter и CupHorn: высокоскоростная и высокопроизводительная пробоподготовка