Ультразвуковая пробоподготовка с помощью фильтров (FASP): улучшение рабочих процессов по протеомике с помощью усовершенствованного сонирования
Ультразвуковая пробоподготовка с использованием фильтров (FASP) становится высокоэффективным и воспроизводимым методом в современной протеомике. Интегрируя контролируемое озвучивание в существующие рабочие процессы FASP, исследователи могут значительно улучшить экстракцию белков, эффективность переваривания и общее качество данных. С ростом спроса на высокопроизводительную и воспроизводимую пробоподготовку такие соникаторы, как микропланшетный соникатор UIP400MTP, приобретают все большую научную и практическую значимость.
Научный контекст: Почему FASP имеет значение для протеомики
Фильтровальная пробоподготовка (FASP) стала золотым стандартом в протеомике "снизу вверх" благодаря своей способности удалять детергенты, соли и другие загрязнения, обеспечивая при этом эффективное ферментативное переваривание. Однако классические протоколы FASP часто сталкиваются с ограничениями, связанными с неполным лизисом, непоследовательным перевариванием и изменчивостью образцов. – особенно когда речь идет о сложных или эластичных биологических клетках или тканях.
Именно здесь сфокусированная ультразвуковая энергия (соникация) дает решающее преимущество. Благодаря механическим сдвиговым усилиям и кавитации соникация улучшает множество критических этапов рабочего процесса FASP, не нарушая целостности белка.
Многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP облегчает пробоподготовку с помощью фильтра (FASP)
Положительные эффекты соникации в ультразвуковом FASP
Соникация представляет собой управляемую акустическую кавитацию – образование и схлопывание микроскопических пузырьков – что приводит к возникновению локальных сдвиговых усилий и микропотоков.
Сонирование улучшает как алкилирование, так и переваривание в ультразвуковом FASP за счет улучшения массопереноса и ускорения кинетики реакции. Применение ультразвуковой энергии вызывает кавитацию, приводящую к локализованным микропотокам и переходным сдвиговым усилиям, которые способствуют быстрому перемешиванию и эффективному проникновению реагентов в белковую матрицу или среду фильтра. При алкилировании это приводит к более равномерной и быстрой модификации остатков цистеина йодоацетамидом. На этапе переваривания ультразвуковая обработка повышает доступность мест протеолитического расщепления и улучшает взаимодействие фермента с субстратом, тем самым ускоряя активность трипсина и повышая эффективность переваривания. В целом ультразвуковая обработка сокращает время обработки, сохраняя или улучшая полноту и воспроизводимость реакции.
В пробоподготовке для протеомики ультразвуковая FASP превращается в:
- Более эффективное разрушение клеток и извлечение белков, даже из жестких тканей или микробных образцов
- Улучшенная солюбилизация белков
- Улучшенная доступность ферментов в процессе пищеварения
- Сокращение времени обработки и повышение воспроизводимости
В отличие от традиционных механических или химических методов лизиса, ультразвуковая обработка хорошо поддается контролю и масштабированию, что делает ее особенно подходящей для стандартизированных рабочих процессов протеомики.
UIP400MTP не является ультразвуковой ванной. Это чашечный рупор высокой интенсивности для сфокусированной ультразвуковой обработки. Этот мощный бесконтактный ультразвуковой аппарат обеспечивает равномерную ультразвуковую обработку во всех лунках стандартной луночной пластины. У вас есть точный контроль над амплитудой, мощностью и пульсацией. Встроенный таймер и датчик температуры обеспечивают стабильные результаты. Ультразвуковой аппарат UIP400MTP пластины охлаждает образцы на водяной бане (внешний охладитель опционально).
Преимущества ультразвуковой ФАСП перед традиционными методами
Интеграция соникации в протоколы FASP дает ощутимые преимущества, которые напрямую влияют на результаты последующей масс-спектрометрии.
Ультразвуковой FASP обеспечивает более полное извлечение белка, особенно из сложных образцов, таких как волокнистые ткани или биопленки. Равномерное распределение энергии обеспечивает последовательную обработку всех реплик, снижая вариабельность – необходимое условие для количественной протеомики.
Кроме того, соникация ускоряет кинетику переваривания за счет улучшения взаимодействия фермента с субстратом. Это часто приводит к сокращению времени переваривания и увеличению выхода пептидов при сохранении покрытия последовательностей.
С точки зрения рабочего процесса ультразвуковые системы сокращают ручное вмешательство и устраняют необходимость в агрессивной химической обработке, сохраняя целостность образца и упрощая стандартизацию протокола.
Диаграмма Венна показывает увеличение количества белков, идентифицированных с помощью ультразвукового FASP по сравнению с ночным FASP
Изображение и исследование: ©Carvalho et al., 2020
Соникер для многолуночных планшетов UIP400MTP для подготовки проб с помощью фильтров (FASP)
Протокол: Высокопроизводительный ультразвуковой FASP с UIP400MTP
Для лабораторий, обрабатывающих большие группы образцов, микропланшетный соникатор UIP400MTP позволяет одновременно обрабатывать стандартные многолуночные планшеты (например, 96-луночные), что значительно повышает производительность и воспроизводимость.
В этом формате образцы (обычно 50-200 мкл на лунку) готовятся непосредственно в микропланшетах, совместимых с ультрафильтрацией или последующей обработкой. Буферы для лизиса аналогичны тем, что используются в стандартных протоколах FASP.
UIP400MTP равномерно распределяет ультразвуковую энергию по всем лункам. Ультразвуковая обработка обычно проводится при амплитуде 60-80% в течение 2-4 минут в зависимости от типа образца. Контролируйте температуру с помощью подключаемого датчика температуры. Использование импульсной ультразвуковой обработки и дополнительного лабораторного охладителя.
Примерный протокол:
- Для этапа алкилирования образцы обрабатывают с помощью микропланшетного соникатора (UIP400MTP) при амплитуде 40 % в течение 7 циклов (30 с включено, 15 с выключено; общее время обработки: 5 мин 45 с).
- После соникации раствор йодоацетамида (IAA) удаляется центрифугированием. Перед трипсиновым перевариванием образцы необходимо промыть, чтобы удалить остатки мочевины - сильного хаотропного агента, подавляющего ферментативную активность. Поэтому образцы дважды промывают 200 мкл 25 мМ бикарбоната аммония (AmBic).
- Затем добавляют 100 мкл раствора трипсина (соотношение фермента и белка 1:30), приготовленного в 12,5 мМ бикарбонате аммония. Затем проводится переваривание белков с помощью UIP400MTP при тех же условиях соникации (амплитуда 40 %, 7 циклов, 30 с ON / 15 с OFF; общее время: 5 мин 45 с).
- После соникации образцы переносятся на фильтровальные пластины или обрабатываются с помощью систем FASP на основе пластин. Этапы восстановления и алкилирования выполняются в планшете, что позволяет оптимизировать рабочий процесс.
- Трипсиновое переваривание проводится в контролируемых условиях (например, 37°C, 4-16 часов), с возможностью кратковременной ультразвуковой стимуляции для ускорения ферментативной активности и повышения выхода пептидов.
- Пептиды восстанавливаются центрифугированием и готовы к ЖХ-МС/МС анализу.
Ключевое преимущество этой системы заключается в способности обеспечить идентичные условия обработки во всех лунках, что сводит к минимуму влияние партии и позволяет проводить надежные количественные сравнения в крупномасштабных протеомических исследованиях.
Многотрубный звукосниматель VialTweeter ускоряет и улучшает пробоподготовку с помощью фильтров (FASP) в протеомике
Научная актуальность
Интеграция соникации в рабочие процессы FASP - это не просто техническое усовершенствование – Это методологическое достижение в области пробоподготовки в протеомике. По мере того как эта область движется в направлении повышения производительности, автоматизации и воспроизводимости, ультразвуковые технологии устраняют основные узкие места в обработке образцов.
Последние исследования все больше подчеркивают важность последовательной подготовки проб для надежного обнаружения биомаркеров и количественной протеомики. Ультразвуковая FASP вносит непосредственный вклад в достижение этой цели, повышая эффективность экстракции, последовательность переваривания и общую устойчивость рабочего процесса.
Кроме того, масштабируемость ультразвуковых систем – от отдельных флаконов с помощью VialTweeter до полных микропланшетов с помощью UIP400MTP – Это соответствует растущему спросу на исследования в области протеомики как исследовательского, так и крупногруппового характера.
Получите соникатор для облегчения рабочего процесса в FASP!
Ультразвуковая пробоподготовка с использованием фильтров сочетает в себе проверенные преимущества FASP с физическими преимуществами соникации. Усиливая лизис, улучшая переваривание и стандартизируя рабочие процессы, ультразвуковые системы предлагают мощное решение для современной протеомики.
Многотрубный соникатор VialTweeter и микропланшетный соникатор UIP400MTP демонстрируют, как сфокусированная ультразвуковая энергия может превратить рутинную подготовку образцов в более эффективный, воспроизводимый и научно обоснованный процесс. – В конечном итоге это позволяет получить более качественные протеомные данные и глубже понять биологию.
Выберите наиболее подходящий соникатор для подготовки проб с помощью фильтров
| Модель Sonicator | Преимущества для FASP | Лучшее использование |
| UIP400MTP микропланшетный ультразвуковой аппарат | Равномерное сонирование по всему микропланшету; высоковоспроизводимое потребление энергии; ускорение алкилирования и ферментативного переваривания в высокопроизводительных рабочих процессах; совместимость с автоматизированной пробоподготовкой. | Высокопроизводительные рабочие процессы FASP в 96-луночных или аналогичных форматах планшетов, включая приложения для скрининга протеомики. |
| VialTweeter Многоламповый ультразвуковой аппарат | Одновременное равномерное сонирование нескольких закрытых пробирок; минимизирует перекрестное загрязнение и потерю образцов; улучшает проникновение и смешивание реагентов, повышая эффективность алкилирования и дигестии. | Параллельная обработка нескольких образцов FASP с умеренной производительностью и высокой воспроизводимостью. |
| горн (непрямое сонирование “высокоинтенсивная ванна” для герметичных трубок) | Высокоинтенсивная непрямая соникация для герметичных сосудов; превосходный контроль температуры и обработка без загрязнений; способствует эффективному массопереносу без прямого контакта с зондом. | Обработка образцов в различных контейнерах для образцов / чувствительные или опасные образцы, требующие закрытых контейнеров и последовательного распределения энергии. |
| Лабораторные звуковые колонки зондового типа (прямое сонирование) | Максимальная интенсивность ультразвука и передача энергии; быстрое разрушение и ускорение реакции; эффективно для трудноперевариваемых или очень сложных белковых образцов. | Обработка одного образца, больших образцов или сложных матриц, где требуется максимальная мощность и скорость. |
Проектирование, производство и консалтинг – Качество «Сделано в Германии»
Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными условиями окружающей среды.
Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.
Часто задаваемые вопросы
Для чего используется подготовка образцов с помощью фильтров?
Система подготовки образцов с помощью фильтров (FASP) используется для подготовки белковых образцов для масс-спектрометрического протеомного анализа. Она позволяет эффективно удалять детергенты, соли и другие низкомолекулярные загрязнения, сохраняя белки на фильтре с отсечкой молекулярного веса, где они могут быть денатурированы, восстановлены, алкилированы и ферментативно переварены в пептиды, пригодные для ЖХ-МС/МС анализа.
Каковы преимущества FASP в протеомике?
Основные преимущества FASP в протеомике заключаются в способности работать со сложными и богатыми детергентами образцами, получая при этом высокоочищенные пептидные смеси, совместимые с масс-спектрометрией. Он повышает эффективность и воспроизводимость переваривания за счет проведения реакций в замкнутой фильтрующей среде, снижает потери образцов по сравнению с методами, основанными на преципитации, и позволяет эффективно менять буфер. В целом FASP улучшает извлечение пептидов, качество данных и охват протеома, что делает его надежным и широко распространенным рабочим процессом в протеомике "снизу вверх".
Литература / Литература
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Бесконтактный соникатор UIP400MTP облегчает проведение FASP в 96-луночных планшетах
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы от лаборатория Кому промышленного размера.