Ультразвуковая пробоподготовка с помощью фильтров (FASP): улучшение рабочих процессов по протеомике с помощью усовершенствованного сонирования
Ультразвуковая пробоподготовка с использованием фильтров (FASP) становится высокоэффективным и воспроизводимым методом в современной протеомике. Интегрируя контролируемое озвучивание в существующие рабочие процессы FASP, исследователи могут значительно улучшить экстракцию белков, эффективность переваривания и общее качество данных. С ростом спроса на высокопроизводительную и воспроизводимую пробоподготовку такие соникаторы, как микропланшетный соникатор UIP400MTP, приобретают все большую научную и практическую значимость.
Научный контекст: Почему FASP имеет значение для протеомики
Фильтровальная пробоподготовка (FASP) стала золотым стандартом в протеомике "снизу вверх" благодаря своей способности удалять детергенты, соли и другие загрязнения, обеспечивая при этом эффективное ферментативное переваривание. Однако классические протоколы FASP часто сталкиваются с ограничениями, связанными с неполным лизисом, непоследовательным перевариванием и изменчивостью образцов. – особенно когда речь идет о сложных или эластичных биологических клетках или тканях.
Именно здесь сфокусированная ультразвуковая энергия (соникация) дает решающее преимущество. Благодаря механическим сдвиговым усилиям и кавитации соникация улучшает множество критических этапов рабочего процесса FASP, не нарушая целостности белка.
Многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP облегчает пробоподготовку с помощью фильтра (FASP)
Положительные эффекты соникации в ультразвуковом FASP
Соникация представляет собой управляемую акустическую кавитацию – образование и схлопывание микроскопических пузырьков – что приводит к возникновению локальных сдвиговых усилий и микропотоков.
Сонирование улучшает как алкилирование, так и переваривание в ультразвуковом FASP за счет улучшения массопереноса и ускорения кинетики реакции. Применение ультразвуковой энергии вызывает кавитацию, приводящую к локализованным микропотокам и переходным сдвиговым усилиям, которые способствуют быстрому перемешиванию и эффективному проникновению реагентов в белковую матрицу или среду фильтра. При алкилировании это приводит к более равномерной и быстрой модификации остатков цистеина йодоацетамидом. На этапе переваривания ультразвуковая обработка повышает доступность мест протеолитического расщепления и улучшает взаимодействие фермента с субстратом, тем самым ускоряя активность трипсина и повышая эффективность переваривания. В целом ультразвуковая обработка сокращает время обработки, сохраняя или улучшая полноту и воспроизводимость реакции.
В пробоподготовке для протеомики ультразвуковая FASP превращается в:
- Более эффективное разрушение клеток и извлечение белков, даже из жестких тканей или микробных образцов
- Улучшенная солюбилизация белков
- Улучшенная доступность ферментов в процессе пищеварения
- Сокращение времени обработки и повышение воспроизводимости
В отличие от традиционных механических или химических методов лизиса, ультразвуковая обработка хорошо поддается контролю и масштабированию, что делает ее особенно подходящей для стандартизированных рабочих процессов протеомики.
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
Преимущества ультразвуковой ФАСП перед традиционными методами
Интеграция соникации в протоколы FASP дает ощутимые преимущества, которые напрямую влияют на результаты последующей масс-спектрометрии.
Ультразвуковой FASP обеспечивает более полное извлечение белка, особенно из сложных образцов, таких как волокнистые ткани или биопленки. Равномерное распределение энергии обеспечивает последовательную обработку всех реплик, снижая вариабельность – необходимое условие для количественной протеомики.
Кроме того, соникация ускоряет кинетику переваривания за счет улучшения взаимодействия фермента с субстратом. Это часто приводит к сокращению времени переваривания и увеличению выхода пептидов при сохранении покрытия последовательностей.
С точки зрения рабочего процесса ультразвуковые системы сокращают ручное вмешательство и устраняют необходимость в агрессивной химической обработке, сохраняя целостность образца и упрощая стандартизацию протокола.
Диаграмма Венна показывает увеличение количества белков, идентифицированных с помощью ультразвукового FASP по сравнению с ночным FASP
Изображение и исследование: ©Carvalho et al., 2020
Соникер для многолуночных планшетов UIP400MTP для подготовки проб с помощью фильтров (FASP)
Протокол: Высокопроизводительный ультразвуковой FASP с UIP400MTP
Для лабораторий, обрабатывающих большие группы образцов, микропланшетный соникатор UIP400MTP позволяет одновременно обрабатывать стандартные многолуночные планшеты (например, 96-луночные), что значительно повышает производительность и воспроизводимость.
В этом формате образцы (обычно 50-200 мкл на лунку) готовятся непосредственно в микропланшетах, совместимых с ультрафильтрацией или последующей обработкой. Буферы для лизиса аналогичны тем, что используются в стандартных протоколах FASP.
UIP400MTP равномерно распределяет ультразвуковую энергию по всем лункам. Ультразвуковая обработка обычно проводится при амплитуде 60-80% в течение 2-4 минут в зависимости от типа образца. Контролируйте температуру с помощью подключаемого датчика температуры. Использование импульсной ультразвуковой обработки и дополнительного лабораторного охладителя.
Примерный протокол:
- Для этапа алкилирования образцы обрабатывают с помощью микропланшетного соникатора (UIP400MTP) при амплитуде 40 % в течение 7 циклов (30 с включено, 15 с выключено; общее время обработки: 5 мин 45 с).
- После соникации раствор йодоацетамида (IAA) удаляется центрифугированием. Перед трипсиновым перевариванием образцы необходимо промыть, чтобы удалить остатки мочевины - сильного хаотропного агента, подавляющего ферментативную активность. Поэтому образцы дважды промывают 200 мкл 25 мМ бикарбоната аммония (AmBic).
- Затем добавляют 100 мкл раствора трипсина (соотношение фермента и белка 1:30), приготовленного в 12,5 мМ бикарбонате аммония. Затем проводится переваривание белков с помощью UIP400MTP при тех же условиях соникации (амплитуда 40 %, 7 циклов, 30 с ON / 15 с OFF; общее время: 5 мин 45 с).
- После соникации образцы переносятся на фильтровальные пластины или обрабатываются с помощью систем FASP на основе пластин. Этапы восстановления и алкилирования выполняются в планшете, что позволяет оптимизировать рабочий процесс.
- Трипсиновое переваривание проводится в контролируемых условиях (например, 37°C, 4-16 часов), с возможностью кратковременной ультразвуковой стимуляции для ускорения ферментативной активности и повышения выхода пептидов.
- Пептиды восстанавливаются центрифугированием и готовы к ЖХ-МС/МС анализу.
Ключевое преимущество этой системы заключается в способности обеспечить идентичные условия обработки во всех лунках, что сводит к минимуму влияние партии и позволяет проводить надежные количественные сравнения в крупномасштабных протеомических исследованиях.
Многотрубный звукосниматель VialTweeter ускоряет и улучшает пробоподготовку с помощью фильтров (FASP) в протеомике
Научная актуальность
Интеграция соникации в рабочие процессы FASP - это не просто техническое усовершенствование – Это методологическое достижение в области пробоподготовки в протеомике. По мере того как эта область движется в направлении повышения производительности, автоматизации и воспроизводимости, ультразвуковые технологии устраняют основные узкие места в обработке образцов.
Последние исследования все больше подчеркивают важность последовательной подготовки проб для надежного обнаружения биомаркеров и количественной протеомики. Ультразвуковая FASP вносит непосредственный вклад в достижение этой цели, повышая эффективность экстракции, последовательность переваривания и общую устойчивость рабочего процесса.
Кроме того, масштабируемость ультразвуковых систем – от отдельных флаконов с помощью VialTweeter до полных микропланшетов с помощью UIP400MTP – Это соответствует растущему спросу на исследования в области протеомики как исследовательского, так и крупногруппового характера.
Получите соникатор для облегчения рабочего процесса в FASP!
Ультразвуковая пробоподготовка с использованием фильтров сочетает в себе проверенные преимущества FASP с физическими преимуществами соникации. Усиливая лизис, улучшая переваривание и стандартизируя рабочие процессы, ультразвуковые системы предлагают мощное решение для современной протеомики.
Многотрубный соникатор VialTweeter и микропланшетный соникатор UIP400MTP демонстрируют, как сфокусированная ультразвуковая энергия может превратить рутинную подготовку образцов в более эффективный, воспроизводимый и научно обоснованный процесс. – В конечном итоге это позволяет получить более качественные протеомные данные и глубже понять биологию.
Выберите наиболее подходящий соникатор для подготовки проб с помощью фильтров
| Модель Sonicator | Преимущества для FASP | Лучшее использование |
| UIP400MTP микропланшетный ультразвуковой аппарат | Равномерное сонирование по всему микропланшету; высоковоспроизводимое потребление энергии; ускорение алкилирования и ферментативного переваривания в высокопроизводительных рабочих процессах; совместимость с автоматизированной пробоподготовкой. | Высокопроизводительные рабочие процессы FASP в 96-луночных или аналогичных форматах планшетов, включая приложения для скрининга протеомики. |
| VialTweeter Многоламповый ультразвуковой аппарат | Одновременное равномерное сонирование нескольких закрытых пробирок; минимизирует перекрестное загрязнение и потерю образцов; улучшает проникновение и смешивание реагентов, повышая эффективность алкилирования и дигестии. | Параллельная обработка нескольких образцов FASP с умеренной производительностью и высокой воспроизводимостью. |
| горн (непрямое сонирование “высокоинтенсивная ванна” для герметичных трубок) | Высокоинтенсивная непрямая соникация для герметичных сосудов; превосходный контроль температуры и обработка без загрязнений; способствует эффективному массопереносу без прямого контакта с зондом. | Обработка образцов в различных контейнерах для образцов / чувствительные или опасные образцы, требующие закрытых контейнеров и последовательного распределения энергии. |
| Лабораторные звуковые колонки зондового типа (прямое сонирование) | Максимальная интенсивность ультразвука и передача энергии; быстрое разрушение и ускорение реакции; эффективно для трудноперевариваемых или очень сложных белковых образцов. | Обработка одного образца, больших образцов или сложных матриц, где требуется максимальная мощность и скорость. |
Проектирование, производство и консалтинг – Качество «Сделано в Германии»
Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными условиями окружающей среды.
Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.
Часто задаваемые вопросы
Для чего используется подготовка образцов с помощью фильтров?
Система подготовки образцов с помощью фильтров (FASP) используется для подготовки белковых образцов для масс-спектрометрического протеомного анализа. Она позволяет эффективно удалять детергенты, соли и другие низкомолекулярные загрязнения, сохраняя белки на фильтре с отсечкой молекулярного веса, где они могут быть денатурированы, восстановлены, алкилированы и ферментативно переварены в пептиды, пригодные для ЖХ-МС/МС анализа.
Каковы преимущества FASP в протеомике?
Основные преимущества FASP в протеомике заключаются в способности работать со сложными и богатыми детергентами образцами, получая при этом высокоочищенные пептидные смеси, совместимые с масс-спектрометрией. Он повышает эффективность и воспроизводимость переваривания за счет проведения реакций в замкнутой фильтрующей среде, снижает потери образцов по сравнению с методами, основанными на преципитации, и позволяет эффективно менять буфер. В целом FASP улучшает извлечение пептидов, качество данных и охват протеома, что делает его надежным и широко распространенным рабочим процессом в протеомике "снизу вверх".
Литература / Литература
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Бесконтактный соникатор UIP400MTP облегчает проведение FASP в 96-луночных планшетах
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы от лаборатория Кому промышленного размера.