Ультразвуковая пробоподготовка с использованием фильтров (FASP): совершенствование рабочих процессов протеомики с помощью передовой обработки ультразвуком
Ультразвуковая пробоподготовка с использованием фильтров (FASP) становится высокоэффективным и воспроизводимым методом в современной протеомике. Включая контролируемую обработку ультразвуком в устоявшиеся рабочие процессы FASP, исследователи могут значительно улучшить экстракцию белков, эффективность расщепления и общее качество данных. С ростом потребности в высокопроизводительной и воспроизводимой пробоподготовке устройства для фокусированной обработки ультразвуком, такие как ультразвуковой прибор для микропланшетов UIP400MTP, приобретают всё большую научную и практическую значимость.
Научный контекст: почему FASP важна для протеомики
Пробоподготовка с использованием фильтров (FASP) стала золотым стандартом в протеомике по принципу «снизу вверх» благодаря способности удалять детергенты, соли и другие загрязняющие вещества, обеспечивая при этом эффективное ферментативное расщепление. Однако классические протоколы FASP часто имеют ограничения, связанные с неполным лизисом, неоднородным расщеплением и вариабельностью образцов – особенно при работе со сложными или устойчивыми к разрушению биологическими клетками или тканями.
Именно здесь фокусированная ультразвуковая энергия (обработка ультразвуком) обеспечивает решающее преимущество. Создавая механические силы сдвига и кавитацию, обработка ультразвуком улучшает несколько ключевых этапов рабочего процесса FASP без нарушения целостности белков.
Ультразвуковой прибор для многолуночных планшетов UIP400MTP облегчает пробоподготовку с использованием фильтров (FASP)
Положительное влияние обработки ультразвуком при ультразвуковой FASP
Обработка ультразвуком вызывает контролируемую акустическую кавитацию – образование и схлопывание микроскопических пузырьков – которая создаёт локальные силы сдвига и микропотоки.
Обработка ультразвуком улучшает как этап алкилирования, так и этап расщепления при ультразвуковой FASP благодаря улучшению массопереноса и ускорению кинетики реакций. Применение ультразвуковой энергии вызывает кавитацию, приводящую к возникновению локальных микропотоков и кратковременных сил сдвига, которые способствуют быстрому перемешиванию и эффективному проникновению реагентов в белковую матрицу или среду фильтра. При алкилировании это обеспечивает более равномерную и быструю модификацию остатков цистеина йодацетамидом. На этапе расщепления обработка ультразвуком повышает доступность участков протеолитического расщепления и улучшает взаимодействия фермента с субстратом, тем самым ускоряя действие трипсина и повышая эффективность расщепления. В целом ультразвуковая обработка сокращает время обработки, сохраняя или улучшая полноту протекания реакций и воспроизводимость.
При пробоподготовке для протеомики ультразвуковая FASP обеспечивает:
- Более эффективное разрушение клеток и экстракцию белков даже в плотных тканях или микробных образцах
- Улучшенную солюбилизацию белков
- Улучшенный доступ ферментов к белкам при расщеплении
- Сокращение времени обработки и повышение воспроизводимости
В отличие от традиционных методов механического или химического лизиса, ультразвуковая обработка отличается высокой управляемостью и масштабируемостью, что делает её особенно подходящей для стандартизированных рабочих процессов протеомики.
Преимущества ультразвуковой FASP перед традиционными подходами
Включение обработки ультразвуком в протоколы FASP обеспечивает измеримые преимущества, которые напрямую влияют на результаты последующей масс-спектрометрии.
Ультразвуковая FASP позволяет более полно извлекать белки, особенно из сложных образцов, таких как волокнистые ткани или биоплёнки. Равномерное распределение энергии обеспечивает одинаковую обработку повторных образцов, снижая вариабельность – это важнейшее требование для количественной протеомики.
Кроме того, обработка ультразвуком ускоряет кинетику расщепления благодаря улучшению взаимодействия фермента с субстратом. Это часто сокращает время расщепления и повышает выход пептидов при сохранении покрытия аминокислотной последовательности.
С точки зрения организации рабочего процесса ультразвуковые системы сокращают объём ручных операций и устраняют необходимость в агрессивной химической обработке, сохраняя целостность образцов и упрощая стандартизацию протоколов.
Диаграмма Венна, показывающая увеличение числа идентифицированных белков при ультразвуковой FASP по сравнению с FASP, проводимой в течение ночи
Изображение и исследование: ©Carvalho et al., 2020
Ультразвуковой прибор для многолуночных планшетов UIP400MTP для пробоподготовки с использованием фильтров (FASP)
Протокол: высокопроизводительная ультразвуковая FASP с UIP400MTP
В лабораториях, обрабатывающих большие группы образцов, ультразвуковой прибор для микропланшетов UIP400MTP позволяет одновременно обрабатывать ультразвуком стандартные многолуночные планшеты (например, 96-луночные), значительно повышая производительность обработки образцов и воспроизводимость.
В этом формате образцы (обычно 50–200 µL на лунку) подготавливают непосредственно в микропланшетах, совместимых с ультрафильтрацией или последующей обработкой. Буферы для лизиса аналогичны используемым в стандартных протоколах FASP.
UIP400MTP равномерно подаёт ультразвуковую энергию во все лунки. Обработку ультразвуком обычно проводят при амплитуде 60–80% в течение 2–4 минут в зависимости от типа образца. Контролируйте температуру с помощью подключаемого датчика температуры. Используйте импульсную обработку ультразвуком и, при необходимости, лабораторный охладитель.
Пример протокола:
- На этапе алкилирования образцы обрабатывают ультразвуком с помощью ультразвукового прибора для микропланшетов (UIP400MTP) при амплитуде 40% в течение 7 циклов (30 s включено, 15 s выключено; общее время обработки ультразвуком: 5 min 45 s).
- После обработки ультразвуком раствор йодацетамида (IAA) удаляют центрифугированием. Перед расщеплением трипсином образцы необходимо промыть для удаления остаточной мочевины – сильного хаотропного агента, подавляющего ферментативную активность. Поэтому образцы дважды промывают 200 μL раствора гидрокарбоната аммония (AmBic) с концентрацией 25 mM.
- Затем добавляют 100 μL раствора трипсина (соотношение фермента и белка 1:30), приготовленного в растворе гидрокарбоната аммония с концентрацией 12,5 mM. После этого расщепление белков проводят с помощью UIP400MTP при тех же условиях обработки ультразвуком (амплитуда 40%, 7 циклов, 30 s включено / 15 s выключено; общее время: 5 min 45 s).
- После обработки ультразвуком образцы переносят в фильтрующие планшеты или обрабатывают с использованием планшетных систем FASP. Этапы восстановления и алкилирования выполняют непосредственно в планшете, сохраняя рациональную организацию рабочего процесса.
- Расщепление трипсином проводят в контролируемых условиях (например, 37°C, 4–16 часов) с возможностью кратковременной ультразвуковой стимуляции для ускорения ферментативной активности и повышения выхода пептидов.
- Пептиды извлекают центрифугированием, после чего они готовы к анализу LC-MS/MS.
Ключевое преимущество этой системы заключается в способности обеспечивать одинаковые условия обработки во всех лунках, сводя к минимуму эффекты партий и позволяя проводить надёжные количественные сравнения в крупномасштабных протеомных исследованиях.
Ультразвуковой прибор для нескольких пробирок VialTweeter ускоряет и улучшает пробоподготовку с использованием фильтров (FASP) в протеомике
Научная значимость
Включение обработки ультразвуком в рабочие процессы FASP является не просто техническим усовершенствованием – оно представляет собой методологический прогресс в пробоподготовке для протеомики. По мере развития этой области в направлении повышения производительности, автоматизации и воспроизводимости ультразвуковые технологии устраняют фундаментальные ограничения при обработке образцов.
В недавних исследованиях всё чаще подчёркивается важность стабильной пробоподготовки для надёжного выявления биомаркеров и количественной протеомики. Ультразвуковая FASP напрямую способствует достижению этой цели, повышая эффективность экстракции, стабильность расщепления и общую надёжность рабочего процесса.
Кроме того, масштабируемость ультразвуковых систем – от отдельных флаконов с VialTweeter до целых микропланшетов с UIP400MTP – соответствует растущей потребности как в поисковых протеомных исследованиях, так и в исследованиях больших групп образцов.
Приобретите ультразвуковой прибор, чтобы облегчить ваш рабочий процесс FASP!
Ультразвуковая пробоподготовка с использованием фильтров сочетает проверенные преимущества FASP с физическими преимуществами обработки ультразвуком. Усиливая лизис, улучшая расщепление и стандартизируя рабочие процессы, ультразвуковые системы предлагают мощное решение для современной протеомики.
Ультразвуковой прибор для нескольких пробирок VialTweeter и ультразвуковой прибор для микропланшетов UIP400MTP демонстрируют, как фокусированная ультразвуковая энергия может превратить рутинную пробоподготовку в более эффективный, воспроизводимый и научно надёжный процесс – в конечном итоге обеспечивая более качественные протеомные данные и более глубокое понимание биологических процессов.
Выберите наиболее подходящий ультразвуковой прибор для вашей пробоподготовки с использованием фильтров
| Модель ультразвукового прибора | Преимущества для FASP | Оптимальное применение |
| Ультразвуковой прибор для микропланшетов UIP400MTP | Равномерная обработка ультразвуком целых микропланшетов; высоковоспроизводимая подача энергии; ускоряет алкилирование и ферментативное расщепление в высокопроизводительных рабочих процессах; совместим с автоматизированной пробоподготовкой. | Высокопроизводительные рабочие процессы FASP в 96-луночных или аналогичных форматах планшетов, включая скрининг в протеомике. |
| Ультразвуковой прибор для нескольких пробирок VialTweeter | Одновременная равномерная обработка ультразвуком нескольких закрытых пробирок; сводит к минимуму перекрёстное загрязнение и потери образцов; улучшает проникновение реагентов и перемешивание, повышая эффективность алкилирования и расщепления. | Параллельная обработка нескольких образцов FASP с умеренной производительностью и высокой воспроизводимостью. |
| CupHorn (непрямая обработка ультразвуком, «высокоинтенсивная ванна» для герметично закрытых пробирок) | Высокоинтенсивная непрямая обработка ультразвуком герметично закрытых сосудов; превосходный контроль температуры и обработка без загрязнения; способствует эффективному массопереносу без прямого контакта с зондом. | Обработка образцов в различных ёмкостях / чувствительных или опасных образцов, требующих закрытых ёмкостей и равномерного распределения энергии. |
| Лабораторные ультразвуковые приборы зондового типа (прямая обработка ультразвуком) | Максимальная интенсивность ультразвука и передача энергии; быстрое разрушение и ускорение реакций; эффективны для труднорасщепляемых или высокосложных белковых образцов. | Обработка отдельных образцов, более крупных образцов или сложных матриц, для которых требуются максимальная мощность и скорость. |
Разработка, производство и консультирование – качество из Германии
Ультразвуковые приборы Hielscher широко известны высочайшими стандартами качества и разработки. Прочная конструкция и простота эксплуатации позволяют легко интегрировать наши ультразвуковые приборы в промышленные объекты. Ультразвуковые приборы Hielscher легко справляются с суровыми условиями и сложной эксплуатационной средой.
Hielscher Ultrasonics – компания, сертифицированная по ISO, которая уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым приборам, сочетающим самые современные технологии и удобство использования. Разумеется, ультразвуковые приборы Hielscher соответствуют требованиям CE и отвечают требованиям UL, CSA и RoHs.
Часто задаваемые вопросы
Для чего используется пробоподготовка с использованием фильтров?
Пробоподготовка с использованием фильтров (FASP) применяется для подготовки белковых образцов к протеомному анализу на основе масс-спектрометрии. Она позволяет эффективно удалять детергенты, соли и другие низкомолекулярные загрязняющие вещества, удерживая при этом белки на фильтре с порогом отсечения по молекулярной массе, где их можно денатурировать, восстанавливать, алкилировать и ферментативно расщеплять до пептидов, пригодных для анализа LC–MS/MS.
Каковы преимущества FASP в протеомике?
Основные преимущества FASP в протеомике заключаются в возможности обрабатывать сложные образцы и образцы с высоким содержанием детергентов, получая при этом высокоочищенные пептидные смеси, совместимые с масс-спектрометрией. Метод повышает эффективность и воспроизводимость расщепления благодаря проведению реакций в ограниченном пространстве фильтра, снижает потери образцов по сравнению с методами на основе осаждения и позволяет эффективно заменять буфер. В целом FASP повышает выход пептидов, качество данных и покрытие протеома, что делает её надёжным и широко используемым рабочим процессом в протеомике по принципу «снизу вверх».
Литература / Ссылки
-
FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation — English version — Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter — Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Бесконтактный ультразвуковой прибор UIP400MTP облегчает FASP в 96-луночных планшетах
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы от лабораторных до промышленных размеров.