Протеомные рабочие процессы с высокопроизводительным расщеплением белков

Протеомика – важнейшая область для понимания биологических процессов и систем, а расщепление белков является критически важным этапом её рабочих процессов. Традиционно расщепление белков проводят в растворе с использованием протеолитических ферментов, таких как трипсин, который специфически гидролизует пептидные связи у остатков лизина и аргинина. Этот процесс образует пептиды, хорошо подходящие для ионизации и фрагментации при масс-спектрометрическом (MS) анализе. Однако для полного расщепления традиционными методами требуется 12–24 часа, что создаёт существенные узкие места в протеомных рабочих процессах.
Обработка ультразвуком предлагает мощную альтернативу, резко сокращая время расщепления с нескольких часов до всего нескольких минут. В сочетании с современными ультразвуковыми устройствами для обработки нескольких образцов, такими как Hielscher CupHorn, VialTweeter и устройство для обработки 96-луночных планшетов UIP400MTP, обработка ультразвуком позволяет ускорить протеомный анализ и повысить его производительность. Эти технологии оптимизируют рабочие процессы, сокращая время подготовки образцов и повышая эффективность без ущерба для воспроизводимости или качества данных.

Роль ультразвуковой энергии в расщеплении белков

При обработке ультразвуком используются сфокусированные ультразвуковые волны для создания кавитации – локализованных микропузырьков, которые схлопываются, создавая интенсивные силы сдвига. Это явление усиливает массоперенос, способствует смешиванию ферментов с субстратами и разворачивает белковые структуры, открывая участки расщепления для протеолитических ферментов, таких как трипсин.
Результат? Значительное сокращение времени расщепления без ущерба для эффективности или воспроизводимости.

Протеолитическое расщепление, усиленное ультразвуком: методика и результаты

Протокол ускоренного расщепления

Расщепление с помощью ультразвука сочетает протеолитические ферменты и ультразвуковую энергию для ускорения рабочих процессов. Например, при использовании Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) рабочий процесс расщепления проходит следующим образом:

1. Восстановление: образцы белка (0,5 mg/mL, 20 µL) обрабатывают DTT (2 µL, 110 mM) в бикарбонатном аммонийном буфере (12,5 mM). Обработку ультразвуком проводят при амплитуде 50% в течение 5 минут.
2. Алкилирование: после добавления IAA (2 µL, 400 mM) обработку ультразвуком повторяют в тех же условиях.
3. Расщепление: образцы разбавляют и инкубируют с наночастицами, несущими иммобилизованный трипсин. Заключительный цикл обработки ультразвуком (5 минут) завершает расщепление. Пептиды отделяют, высушивают и хранят для анализа методом MS.

Этот ультразвуковой метод сокращает общее время подготовки с 12 часов до менее чем 30 минут. Несмотря на ускорение процесса, выход и качество пептидов остаются сопоставимыми с традиционными методами, предполагающими обработку в течение ночи.

Эффективность ультразвукового расщепления белков

В сравнительных исследованиях с использованием протеомов E. coli:

• Идентификация белков: В образцах, подвергнутых ультразвуковому расщеплению, за 5 минут было идентифицировано 777 белков, по сравнению с 817 за 12 часов. Доля белков, идентифицированных обоими методами, превышала 70%.
• Воспроизводимость: Повторные анализы показали значения корреляции выше 98% в рамках каждого метода, что демонстрирует надёжность.
• Селективность: Каждый метод обеспечивал преимущественное расщепление определённых белков: ультразвуковое расщепление – 65 белков, а расщепление в течение ночи – 54 белка. Такие тонкие различия подчёркивают уникальный потенциал обработки ультразвуком для конкретных применений.

Результаты количественного определения без меток семи белков, добавленных в образец
E. coli. Следующие белки добавляли на двух разных уровнях, как указано в столбце
под названием «Theo Ratio». Theo Ratio – теоретическое соотношение между двумя уровнями, использованными в этом
эксперименте. Бычий сывороточный альбумин (ALBU), β-лактоглобулин (LACB), α-S1-казеин (CASA1),
α-S2-казеин (CASA2), цитохром c (CYC), овальбумин (OVAL) и карбоангидраза 2
(CAH2). Соотношения рассчитывали с использованием интенсивностей белков LFQ, полученных при анализе
в MaxQuant. Для сравнения значений, полученных каждым методом, применяли t-критерий Стьюдента (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Исследование и график: © Martins et al., 2019)

Трипсин, иммобилизованный на наночастицах

Сочетание наночастиц, несущих иммобилизованный трипсин (например, T-FMNPs), с обработкой ультразвуком дополнительно улучшает протеомные рабочие процессы. Эти наночастицы обеспечивают большую площадь поверхности для взаимодействий фермента с субстратом, повышая эффективность. При применении к сложным протеомам, таким как протеом E. coli, комбинированный метод обеспечивает:

• Скорость: Полное расщепление в течение 5 минут.
• Точность: Количественное определение белков, сопоставимое с традиционными методами (p > 0,01, n=3).
• Масштабируемость: Адаптация к многолуночным платформам, таким как UIP400MTP, позволяет проводить высокопроизводительную обработку.

Нажмите здесь, чтобы перейти к подробному протоколу с пошаговыми инструкциями!
(см. Martins et al., 2019)

Протеолитическое расщепление с высокой скоростью и производительностью с помощью ультразвуковых устройств Hielscher

Лучшие модели ультразвуковых устройств для протеомики

Hielscher Ultrasonics предлагает различные модели ультразвуковых устройств для одновременной подготовки нескольких образцов, облегчая высокопроизводительные рабочие процессы. Работаете ли вы с флаконами, пробирками, многолуночными планшетами (например, 6-, 24-, 96-луночными планшетами) или чашками Петри – мы предлагаем вам идеальные ультразвуковые устройства для ваших экспериментов.

Ультразвуковое устройство для многолуночных планшетов UIP400MTP

Для достижения максимальной производительности UIP400MTP обеспечивает возможность ультразвуковой обработки 96-луночных планшетов. Совместимый с любым стандартным микропланшетом, UIP400MTP не требует дорогостоящих фирменных одноразовых расходных материалов и позволяет свободно выбирать лучший многолуночный планшет для ваших исследований. Равномерно распределяя энергию по всему планшету, он обеспечивает быстрое восстановление, алкилирование и расщепление до 200 сложных протеомов всего за 1 час. Такой уровень автоматизации и эффективности имеет решающее значение для высокопроизводительной протеомики и клинических применений. Узнайте больше об ультразвуковом устройстве для многолуночных планшетов!

VialTweeter

VialTweeter предназначен для лабораторий, которым требуется одновременная обработка ультразвуком до 10 флаконов или пробирок. Его неинвазивный подход устраняет риски перекрёстного загрязнения, обеспечивая при этом воспроизводимое расщепление белков. Это устройство идеально подходит для исследователей, работающих с ограниченными объёмами образцов или разнообразными типами образцов.
Узнайте больше об ультразвуковом устройстве VialTweeter для обработки нескольких пробирок!

Hielscher UP200St-CupHorn

Ультразвуковое устройство CupHorn – мощный прибор, предназначенный для одновременной обработки нескольких образцов в герметичных ёмкостях. Оно обеспечивает равномерное распределение ультразвуковой энергии и точный контроль температуры. Возможность одновременной обработки до пяти образцов в сочетании с совместимостью с рабочими процессами, включающими восстановление, алкилирование и расщепление, делает CupHorn надёжным инструментом для протеомики на основе MS.
Узнайте больше о сонореакторе CupHorn!

Пошаговый протокол протеолитического расщепления с помощью ультразвука с использованием трипсина, иммобилизованного на наночастицах

Этот протокол Martins et al. (2019) оптимизирован для быстрого расщепления белков с использованием ультразвуковой энергии и трипсина, иммобилизованного на наночастицах (T-FMNPs). Описанные этапы обеспечивают эффективное восстановление, алкилирование и протеолиз, подходящие для масс-спектрометрического (MS) анализа.
Этапы протокола

1. Восстановление дисульфидных связей
   • Добавьте 2 µL раствора DTT (110 mM) к 20 µL образца белка (0,5 mg/mL) в буфере AmBic.
   • Поместите пробирку с образцом в сонореактор UP200St-CupHorn.
   • Обрабатывайте образец ультразвуком в течение 2,5 минут при амплитуде 50% (200 W, 26 kHz).
   • Сделайте короткую паузу для охлаждения, затем обрабатывайте ультразвуком ещё 2,5 минуты в тех же условиях.
2. Алкилирование восстановленных остатков цистеина
   • Добавьте 2 µL раствора IAA (400 mM) к восстановленному образцу белка.
   • Обрабатывайте ультразвуком в течение 2,5 минут при амплитуде 50%, чтобы способствовать алкилированию.
   • Сделайте паузу для охлаждения, затем обрабатывайте ультразвуком ещё 2,5 минуты.

   Примечание: сведите к минимуму воздействие света на алкилированный образец, чтобы предотвратить разложение IAA.

3. Разбавление образца
   • Разбавьте алкилированный образец белка до конечного объёма 100 µL, используя буфер AmBic 25 mM, содержащий 4% ацетонитрила (v/v).
   • Тщательно перемешайте осторожным пипетированием.
4. Протеолитическое расщепление с использованием трипсина, иммобилизованного на наночастицах
   • Добавьте 20 µL раствора T-FMNP (3 mg/mL) к разбавленному образцу белка.
   • Обрабатывайте смесь ультразвуком в сонореакторе в течение 2,5 минут при амплитуде 50%.
   • Сделайте паузу для охлаждения, затем обрабатывайте ультразвуком ещё 2,5 минуты в тех же условиях.
5. Отделение наночастиц с трипсином
   • Используйте магнит для отделения T-FMNPs от супернатанта, содержащего пептиды, полученные при расщеплении.
   • Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную пробирку.
6. Подготовка пептидов для анализа методом MS
   • Высушите супернатант, содержащий пептиды, в вакуумной центрифуге.
   • Храните высушенные пептиды при -20°C до дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии.