Протеомные рабочие процессы с высокой пропускной способностью расщепления белка

Протеомика является важной областью для понимания биологических процессов и систем, а переваривание белка является критически важным этапом в ее рабочих процессах. Традиционно расщепление белка осуществляется в растворе с использованием протеолитических ферментов, таких как трипсин, который специфически гидролизует пептидные связи на остатках лизина и аргинина. В результате этого процесса образуются пептиды, хорошо подходящие для ионизации и фрагментации в масс-спектрометрии (МС). Тем не менее, традиционные методы разложения требуют 12–24 часов для завершения, что создает значительные узкие места в протеомных рабочих процессах.
Ультразвуковое исследование предлагает мощную альтернативу, значительно сокращая время пищеварения с нескольких часов до нескольких минут. В сочетании с передовыми ультразвуковыми аппаратами с несколькими образцами, такими как Hielscher CupHorn, VialTweeter и 96-луночный ультразвуковой аппарат UIP400MTP, ультразвуковое излучение обеспечивает ускоренную протеомику с высокой пропускной способностью. Эти технологии оптимизируют рабочие процессы, сокращая время подготовки образцов и повышая эффективность без ущерба для воспроизводимости или качества данных.

Роль ультразвуковой энергии в переваривании белка

При ультразвуковой обработке используются сфокусированные ультразвуковые волны для создания кавитации — локализованных микропузырьков, которые сворачиваются, создавая интенсивные силы сдвига. Это явление усиливает массоперенос, способствует смешиванию ферментов с субстратами и разворачивает белковые структуры, подвергая места расщепления воздействию протеолитических ферментов, таких как трипсин.
Каков результат? Значительное сокращение времени разложения без ущерба для эффективности или воспроизводимости.

Ультразвуковое протеолитическое расщепление: методология и результаты

Протокол ускоренного переваривания

Ультразвуковое сбраживание сочетает в себе протеолитические ферменты и ультразвуковую энергию для ускорения рабочих процессов. Например, с помощью Hielscher UP200St-CupHorn (200 Вт, 26 кГц) рабочий процесс разложения происходит следующим образом:

1. Восстановление: образцы белка (0,5 мг/мл, 20 мкл) обрабатывают DTT (2 мкл, 110 мМ) в буфере из бикарбоната аммония (12,5 мМ). Ультразвуковая обработка применяется с амплитудой 50% в течение 5 минут.
2. Алкилирование: После добавления IAA (2 μL, 400 mM) ультразвуковая обработка повторяется в тех же условиях.
3. Разложение: образцы разбавляют и инкубируют с иммобилизованными наночастицами трипсина. Заключительный раунд обработки ультразвуком (5 минут) завершает переваривание. Пептиды отделяют, сушат и хранят для анализа на РС.

Этот ультразвуковой метод сокращает общее время приготовления с 12 часов до менее чем 30 минут. Несмотря на ускоренный процесс, выход и качество пептидов остаются такими же, как и при традиционных методах овернайт.

Эффективность ультразвукового расщепления белка

В сравнительных исследованиях с использованием протеомов E. coli:

• Идентификация белка: Ультразвуковые образцы идентифицировали 777 белков за 5 минут, по сравнению с 817 за 12 часов. Общая идентификация белка превысила 70%.
• Воспроизводимость: Повторный анализ показал значения корреляции выше 98% в каждом методе, что свидетельствует о надежности.
• Избирательность: Определенные белки преимущественно переваривали каждым методом, при этом ультразвуковое разложение отдавало предпочтение 65 белкам, а ночное переваривание — 54 белкам. Такие тонкие различия подчеркивают уникальный потенциал ультразвука для конкретных применений.

Результаты количественного определения семи шиповидных белков в кишечной палочке без меток
образец. Следующие белки добавляли на двух разных уровнях, как указано в столбце
назван «Тео Рацио». Теокоэффициент — это теоретическое соотношение между двумя уровнями, используемое при этом
эксперимент. Бычий сывороточный альбумин (ALBU), β-лактоглобулин (LACB), казеин α-S1 (CASA1),
казеин α-S2 (CASA2), цитохром с (CYC), овальбумин (OVAL) и карбоангидраза 2
(CAH2). Соотношения рассчитывали с использованием интенсивностей белка LFQ, полученных с помощью MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Исследование и графика: © Martins et al., 2019)

Иммобилизованный наночастицами трипсин

Интеграция иммобилизованных наночастиц трипсина (например, T-FMNP) с ультразвуком еще больше улучшает рабочие процессы протеомики. Эти наночастицы обеспечивают большую площадь поверхности для взаимодействия фермента с подложкой, повышая эффективность. При применении к сложным протеомам, таким как кишечная палочка, комбинированный метод достигает:

• Скорость: Полное переваривание в течение 5 минут.
• Точность: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Масштабируемость: Адаптация к многоскважинным платформам, таким как UIP400MTP, обеспечивает высокую производительность обработки.

Нажмите здесь, чтобы ознакомиться с подробным протоколом и пошаговыми инструкциями!
(ср. Martins et al., 2019)

Протеолитическое сбраживание с высокой скоростью и высокой производительностью с помощью ультразвуковых аппаратов Хильшера

Лучшие модели ультразвуковых аппаратов для протеомики

Hielscher Ultrasonics предлагает различные модели ультразвуковых аппаратов для одновременной подготовки нескольких образцов, что способствует высокой производительности рабочих процессов. Независимо от того, работаете ли вы с флаконами, пробирками, многолуночными планшетами (например, 6-, 24-, 96-луночными планшетами) или чашками Петри – Мы предлагаем вам идеальные ультразвуковые аппараты для ваших экспериментов.

UIP400MTP многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат

Для достижения максимальной производительности UIP400MTP обеспечивает возможность ультразвуковой обработки 96-луночных планшетов. Совместимый с любым стандартным микропланшетом, UIP400MTP не требует дорогостоящих запатентованных расходных материалов и дает вам свободу выбора лучшего многолуночного планшета для ваших исследований. Доставляя равномерную энергию по всей пластине, он обеспечивает быстрое восстановление, алкилирование и разложение до 200 сложных протеомов всего за 1 час. Такой уровень автоматизации и эффективности имеет решающее значение для высокопроизводительной протеомики и клинических приложений. Узнайте больше о многолуночном планшетном ультразвуковике!

VialTweeter

VialTweeter предназначен для лабораторий, где требуется одновременное ультразвуковое воздействие до 10 флаконов или пробирок. Его неинвазивный подход устраняет риски перекрестного загрязнения, обеспечивая при этом воспроизводимое переваривание белка. Это устройство идеально подходит для исследователей, работающих с ограниченными объемами образцов или различными типами образцов.
Узнайте больше о многоламповом ультразвуковике VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Ультразвуковой аппарат CupHorn – это мощное устройство, предназначенное для одновременной обработки нескольких образцов в герметичных контейнерах. Он обеспечивает равномерное распределение ультразвуковой энергии и точный контроль температуры. Возможность одновременной обработки до пяти образцов в сочетании с сокращенными, алкилированными и расщепленными рабочими процессами делает CupHorn надежным инструментом для протеомики на основе МС.
Узнайте больше о CupHorn SonoReactor!

Пошаговый протокол ультразвукового протеолитического расщепления с использованием иммобилизованного наночастицами трипсина

Этот протокол Martins et al. (2019) оптимизирован для быстрого переваривания белка с использованием ультразвуковой энергии и иммобилизованного наночастицами трипсина (T-FMNPs). Описанные этапы обеспечивают эффективное восстановление, алкилирование и протеолиз, пригодные для масс-спектрометрии (МС).
Этапы протокола

1. Восстановление дисульфидных связей
   • Добавьте 2 мкл раствора DTT (110 мМ) к 20 мкл образца белка (0,5 мг/мл) в буфере AmBic.
   • Поместите пробирку с образцом в сонореактор UP200St-CupHorn.
   • Ультразвуком обрабатывайте образец в течение 2,5 минут с амплитудой 50% (200 Вт, 26 кГц).
   • Сделайте паузу на короткий промежуток времени, чтобы дать остыть, затем проведите ультразвуковую обработку еще 2,5 минуты в тех же условиях.
2. Алкилирование восстановленных остатков цистеина
   • Добавьте 2 мкл раствора IAA (400 мМ) в образец восстановленного белка.
   • Обрабатывайте ультразвуком в течение 2,5 минут с амплитудой 50% для облегчения алкилирования.
   • Сделайте паузу для остывания, затем протокайте ультразвуком еще 2,5 минуты.

   Примечание: Сведите к минимуму воздействие света на алкилированный образец, чтобы предотвратить деградацию IAA.

3. Разбавление образца
   • Разбавьте образец алкилированного белка до конечного объема 100 мкл с использованием 25 мМ буфера AmBic, содержащего 4% ацетонитрила (v/v).
   • Тщательно перемешайте с помощью аккуратной пипетки.
4. Протеолитическое разложение с иммобилизованным наночастицами трипсином
   • Добавьте 20 мкл раствора T-FMNP (3 мг/мл) в образец разведенного белка.
   • Ультразвуком смесь обработать в сонореакторе в течение 2,5 минут при амплитуде 50%.
   • Сделайте паузу для остывания, затем обрабатывайте ультразвуком еще 2,5 минуты в тех же условиях.
5. Разделение наночастиц трипсина
   • Используйте магнит для отделения T-FMNP от надосадочной жидкости, содержащей переваренные пептиды.
   • Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку.
6. Пептидный препарат для анализа на РС
   • Надосадочную жидкость, содержащую пептиды, высушить в вакуумной центрифуге.
   • Храните высушенные пептиды при температуре -20°C до дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии.