Ультразвуковая технология Хильшера

Ультразвуковая резка ДНК

  • Во время ДНК и РНК сдвига молекулы ДНК разбиваются на более мелкие куски. Фрагментация ДНК / РНК является одним из важных шагов, необходимых образец приготовительных создать библиотеки для следующего поколения секвенирования (NGS).
  • Ультразвуковые ДНК сдвиг использует силы акустической кавитации, чтобы сломать ДНК или РНК на куски 100 – 5кб пар оснований.
  • Ультразвуковая резка позволяет точно фрагментацию ДНК и адаптации к желаемой длине ДНК.

Ультразвуковая резка ДНК

Hielscher Ультразвук предлагает различные ультразвуковые на основе решения для ДНК, РНК и хроматина стрижки овец. Выбор между зондом типа ultrasonicators (например UP100H) для прямога обработки ультразвука с использованием микронаконечника, или использовать VialTweeeter или ультразвуковую cuphorn для непрямого препарата ДНК одновременно различных образцов. Hielscher предлагает идеальное устройство с учетом ваших потребностей: кастрированный бараном у вас есть 1 или до 10 образцов, объемы от микролитра до объемов литровых – Hielscher ультразвуковые процессоры доступны для удовлетворения ваших требований для подготовки ДНК, РНК и хроматина фрагментов в нужной длины. Воспроизводимость, простота в эксплуатации и точное управление обеспечивают надежную библиотеку для следующего поколения секвенирования.
В отличии от фрагментации ДНК ферментативной, ультразвуковая резка применяется чисто механические силы сдвига, без добавления каких-либо химических веществ. По точной настройке параметров процесса, ультразвуковые механические ножницы производят большие фрагменты молекулярной массы ДНК (плазмиды и геномная ДНК).
Очищенные нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы до или после стадии фрагментации.
Параметры обработки ультразвука (мощность, импульсный цикл / всплески, время и температура) можно регулировать с помощью безопасной настройки программного обеспечения.

Преимущества:

  • точный контроль
  • циклы обработки ультразвука и время точно адаптируемые до нужного размера ДНК
  • высокие фрагменты молекулярной массы ДНК
  • контроль температуры
  • Быстро
  • воспроизводимые результаты
  • автоклавируемый
  • различные решения: Зонд типа, VialTweeter а также Кухорн

Протоколы для ультразвуковой ДНК Shearing

Для хроматина иммунопреципитации

Вкратце, клетки высевали в чашки диаметром 60 мм (400 000 на блюдо) и трансфицировали RhoA siRNA (как описано); через 72 часа их инкубировали с формальдегидом (конечная концентрация, 1%) в течение 10 мин при 37 ° С для сшивания белков с ДНК. Реакцию поперечной сшивки гасили добавлением одного десятого объема 1,25 моль / л глицина с получением конечной концентрации 125 ммоль / л. Клетки промывали дважды ледяным PBS, ресуспендировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации [150 ммоль / л NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолата, 0,1% SDS, 5 ммоль / л ЭДТА, 50 ммоль / л Трис-HCl (pH 8,0 )], содержащей 1 ммоль / л фенилметилсульфонилфторида, 1 Аг / мл апротинина и 1 мкг / мл пепстатина А и выдерживали на льду в течение 30 мин. Затем клеточные лизаты обрабатывали ультразвуком на льду с помощью Хильшер UP200S УЗИ Sonicator (3 х 40 с, амплитуда 40%, 1 цикл; Хильшер Ультразвук GmbH) до сшитых chromatins были стриженый с получением ДНК-фрагментов от 200 до 1000 пар оснований. Одна десятой всего лизата была использована для определения количества ДНК, присутствующие в различных образцах и рассматривается как “общая ДНК ввода”, Супернатанты инкубируют с ДНК спермы лосося / белка агарозном-50% суспензии для снижения неспецифического фона. Иммунопреципитацию затем сделано в течение ночи при 4 ° С с 5 Ag анти-NF-NB p65 (Upstate) или без антител (отрицательный контроль). Эти супернатанты с добавлением 5 молей / л NaCl и нагревают в течение ночи при 65 ° C, чтобы вернуться белками-ДНК перекрестных ссылок. В иммунокомплексы дополнительно обрабатывали DNase- и РНКазы протеиназы К, и ДНК очищали фенол / хлороформ экстракции и осаждением этанолом. ПЦР проводили с специфических праймеров, соответствующих последовательности в промоторной области гена человека Inos (р1 праймер: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; р2 праймер: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier и др., 2008)

EGFP-экспрессирующие исследования

Для экспрессии исследований, рекомбинантного штамма L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Германия) с геном для EGFP (усиленный зеленый флуоресцирующий белок), хромосомная SSU интегрирован, культивировали в различных средах, как описано ранее, и кроме того, с добавлением 100 мг л-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Германия). Во время культивирования, отбирали пробы 1 мл, центрифугировали (2000 & bull; g, 20 ° C, 10 мин) и промывают 0,9% -ным раствором NaCl. Осадок ресуспендировали в буфере (20 мМ HEPES, 5 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ) и распадались обработкой ультразвуком с ультразвуковым процессором Up400s (Применение энергии ~ 400 Вт). Остатки клеток удаляли путем центрифугирования (6000 × г, 4 ° С, 5 мин) и анализировали с помощью додецилсульфата натрия - электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) в восстанавливающих условиях в соответствии с методом Laemmli (1970) с 12,5% polyacralamide гелей , EGFP-выражение было рассмотрено в возбужденном культуре. (Фриче и др., 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Электрофоретической анализ геномной ДНК штамма Е.coli EDL933 подвергает 0 - 15 мин ультразвука. L обозначает Ladder ДНК. (Basselet и др. 2008)

Запрос информации




Обратите внимание на наши политика конфиденциальности,


хроматин иммунопреципитация

Ультразвуковой клеточный разрушитель UP100H (100 Вт) для лизиса, разрушения клеток и разрушения ДНК.Анализ иммунопреципитации хроматина проводили с использованием чипа-ITТм Экспресс (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя с некоторыми изменениями. Вкратце, дифференцированный человек подоциты были сшитыми с 1% формальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки промывали охлажденным льдом PBS и реакцию фиксации останавливали добавлением 0,125 М глицин в течение 5 мин при комнатной температуре. Клетки снова промывали охлажденным льдом PBS и соскабливают с тарелки. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в буфере для лизиса. После центрифугирования осажденные ядра ресуспендировали в буфере сдвига, инкубировали на льду в течение 30 мин и хроматин был стриженый с помощью ультразвука, например, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Тельтов, Германия) при 25% мощности 5 импульсов по 20 секунд на льду на фрагменты приблизительно 200-600 б.п. Затем срезанный хроматин центрифугировали и супернатант собирали. Для иммунопреципитации 60 мкл хроматина инкубировали с 1 мкг Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) или антителами NF-κB p50 (Abcam) или с кроликом IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), как отрицательный контроль, в течение ночи при 4 ° C с нежным вращением. Иммунокомплексы, связанные с магнитными гранулами, собирали с использованием магнитной подставки, интенсивно промывали и сшивали белок / ДНК, и ДНК элюировали для анализа ПЦР в реальном времени. (Ristola et al., 2009)

ЭГЭЦ препарат ДНК для анализа массива чипа

Устройство клеточных лизатов и экстрагированных ДНК
Бактериальные гранулы суспендируют в PBS до желаемой конечной концентрации обрабатывали ультразвуковой дезинтегратор UP100H (Hielscher GmbH, Германия), оснащенный микропроцессором MS1 (1 мм в диаметре). Рабочая частота составляла 30 кГц, а эффективная выходная мощность составляла 100 Вт. Во время работы образцы охлаждали в бане с ледяной водой, смешивали и центрифугировали. Образцы использовались для исследований проточной цитометрии, а для последующей обработки образцы подвергались термообработке (95 ° С, 5 мин). Неочищенные клеточные лизаты обрабатывали смесью фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1). В образец лизата добавляли равный объем этой смеси, раствор интенсивно встряхивали в течение 15 с и центрифугировали при 15000 мкг в течение 2 мин при комнатной температуре (RT) около 22 ° С. Верхнюю водную фазу, содержащую геномную ДНК, тщательно отделяли и собирали в новой стерильной пробирке Эппендорфа.
Затем образцы обрабатывали ультразвуком для фрагментации ДНК. Шаг обработки ультразвуком осуществлялся в тех же условиях, которые описаны выше. Для оценки влияния фрагментации на геномную ДНК образцы анализировали с использованием электрофореза в агарозном геле.
(…) Образцы, обработанные ультразвуком ранее в течение 2,5 мин, подвергали стадии экстракции после термообработки и центрифугирования. Выделенный ДНК дважды экстрагировали смесью фенол: хлороформ: изоамиловый спирт, а затем подвергали второй обработке ультразвуком в течение 0-15 мин. Электрофорез в агарозном геле использовали для определения распределения по размерам ДНК, подвергнутой ультразвуковой фрагментации после экстракции (рис. В верхней правой части). Очень фрагментированная ДНК была очевидна из-за наличия ДНК-мазка, а не высокомолекулярных полос, которые были удалены из образцов, обработанных ультразвуком в течение 2,5 мин или дольше. Более длительная обработка ультразвуком постепенно уменьшала длину фрагмента до приблизительно 150-600 п.о., а обработка ультразвуком в течение 15 мин дополнительно ухудшала эти фрагменты, что видно, главным образом, верхней частью мазка. Таким образом, средний размер фрагмента ДНК постепенно снижался с временем ультразвука и 5-минутная обработка позволила получить размеры фрагментов ДНК, наиболее подходящих для анализов матрицы кристаллов. Наконец, была создана процедура получения анализируемого ДНК-ДНК, включающая первые 2 минуты ультразвуковой обработки, экстракцию ДНК (2 ×) и последующую 5-минутную обработку ультразвуком. (Basselet et al., 2008)

Иммунопреципитации хроматина (ЧИП)

Ультразвуковой процессор UP100H для ДНК, РНК и хроматина стрижки. (Нажмите, чтобы увеличить!)Клетки HEK293 культивировали, как описано выше, и фиксировали 2 мМ дисукцинимидилглутарата в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем клетки дважды промывали PBS. Хроматин сшивали в течение 10 мин при комнатной температуре с использованием 1% (об. / Об.) Формальдегида и дважды промывали ледяным PBS. Реакцию сшивания останавливали инкубацией с глицином при конечной концентрации 0,125 М в течение 5 мин при комнатной температуре. После инкубации с трипсином клетки очищали от чашки с культурой клеток и дважды промывали PBS. Осадок клеток ресуспендировали в буфере для лизиса (5 мМ труб, рН 8,0, 85 мМ KCl и 0,5% (об. / Об.) Нонидетом Р-40), инкубировали на льду в течение 10 мин и гомогенизировали гомогенизатором Dounce. Затем ядра осаждали центрифугированием (3500 × 10, 5 мин, 4 ° С) и ресуспендировали в буфере ядер (50 мМ Трис-HCl, pH 8,1, 10 мМ ЭДТА и 1% (мас. / Об.) SDS). Ядра были разрушены ультразвуком с тремя 20-мя импульсами в UP50H Sonicator (Хильшер Ultraschall Technologie) при установке цикла 0,5 и амплитуда 30%, получая геномные ДНК-фрагменты с насыпного размером 200 - 1000 пара оснований. Для ChIP, 50g ДНК разбавляли в 4 раза в иммунопреципитации буфера (16,7 мМ Трис-HCl, рН 8,1, 167 мМ NaCl, 1,2 мМ ЭДТА, 1,1% (об / об) Тритона X-100, и 0,01% (вес / v) SDS). (Weiske и др. 2006)

Анализ гистонов модификация иммунопреципитации хроматина (ЧИП)

Вкратце, 6 х 106 Клетки дважды промывали PBS и сшитый на культуральный планшет в течение 15 мин при комнатной температуре в присутствии 0,5% формальдегида. Реакция Сшивание останавливали добавлением 0,125 М глицина. Все последующие стадии проводили при 48 ° С. Все буферы были предварительно охлажденные и содержали ингибиторы протеазы (полный Mini, Roche). Клетки дважды промывали PBS, а затем соскабливают. Собранные гранулы растворяют в 1 мл буфера для лизиса (1% SDS, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ Трис рН 8) и обрабатывали ультразвуком в ванне холодным этанолом в течение 10 циклов при 100% амплитуды с использованием UP50H Sonicator (Хильшер, Teltow, Германия). Хроматина фрагментации визуализировали в 1% агарозном геле. Полученные фрагменты были в 200-500pb диапазоне. Растворимый хроматина получали центрифугированием обработанных ультразвуком образцов при 14000 в течение 10 мин при 48 ° С. Растворимую фракцию разбавляли 1/10 в буфере для разведения (1% Тритон Х-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис рН 8, 150 мМ NaCl), затем аликвоты и хранили при температуре 80 ° С до использования. (Родригес и др. 2008)

устройство Мощность [Вт] Тип Объем [мл]
VialTweeter 200 г. автономный 00,5 1,5
UP50H 50 лет портативный или standmounted 0+0,01 250 г.
UP100H 100 портативный или standmounted 0+0,01 500
Uf200 ः т 200 г. портативный или standmounted 00,1 1000 г.
UP200St 200 г. стоя 00,1 1000 г.
UP400St 400 стоя 5.0 2000 год
Кухорн 200 г. CupHorn, сонореактор 10 Лет 200 г.
GDmini2 200 г. бесконтактная проточная ячейка

Запрос информации




Обратите внимание на наши политика конфиденциальности,


Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter для подготовки ультразвуковых проб

Свяжитесь с нами! / Спросите нас!

Запросить дополнительную информацию

Пожалуйста, используйте форму ниже, если вы хотите запросить дополнительную информацию о ультразвуковой гомогенизации. Мы будем рады предложить Вам ультразвуковые системы, отвечающей вашим требованиям.









Пожалуйста, обратите внимание на наши политика конфиденциальности,


Литература / Ссылки

  • Basselet П., Wegrzyn Г., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska М. (2008): обработка образцов для ДНК-чип массива на основе анализа энтерогеморрагической кишечной палочки (EHEC). Микробные Клеточные заводы 7:29. 2008.
  • . Doublier С., Riganti Ч., Voena С., Костаманья С., Aldieri Е., Pescarmona Г., Гиго Д., Bosia А. (008): RhoA шумопоглотительные Возвращается устойчивость к доксорубицину в клетках рака толстой кишки человека. Молекулярный Cancer Research 6 (10), 2008.
  • Fredlund Е., Gidlund А., Olsen М., Börjesson Т., Spliid NHH, Симонссона М. (2008): оценка Метод экстракции ДНК из Fusarium мицелия и пшеницы для вниз потока ПЦР в реальном времени и количественной оценки корреляции с уровнями микотоксинов , Журнал микробиологических методов 2008.
  • Фриче В., Sitz М., Вейланд Н., Breitling Р., Поль Х.-Д. (2007): Характеристика поведения роста Leishmania tarentolae - новая система экспрессии рекомбинантных белков. Журнал микробиологии Basic 47, 2007. 384-393.
  • Ristola М., Arpiainen С., Салим М. А., Мэтисон П. В., Welsh Г. И., Лехтонен С., Holthöfer H. (2009): Регулирование Neph3 генов в подоцитах - ключевые роли факторов транскрипции NF-kB и Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
  • Родригес Дж, Вивес Л., Жорд М., Моралес С., Муньос М., Вендрелл Е., Peinado М. А. (2008): Геном отслеживание неметилированной ДНК Alu повторы в нормальных и раковые клетках. Nucleic Acids Research Vol. 36, № 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): гистидин триада Protein Hint1 Триггеры Апоптоз независимо от его ферментативной активности. Журнал биологической химии. Том 281, № 37, 2006. 27356-27366.


Полезные сведения

Ультразвуковая / акустическая кавитация создает весьма интенсивные усилия, что способствует процессам кристаллизации и осаждения (Нажмите, чтобы увеличить!)

Ультразвуковая ДНК сдвиг основан на акустической кавитации и его гидродинамические силы сдвига