Ультразвуковой сдвиг ДНК

Во время сдвига ДНК и РНК длинные молекулы ДНК фрагментируются на более мелкие части, что является важным этапом подготовки образцов к созданию библиотеки секвенирования нового поколения (NGS). Ультразвуковой сдвиг ДНК использует акустические кавитационные силы для разрушения ДНК или РНК на фрагменты размером от 100 до 5 кб. Этот метод позволяет точно контролировать размер фрагмента, облегчая настройку в соответствии с желаемой длиной ДНК для достижения оптимальных результатов секвенирования.

Резка ДНК с помощью ультразвука

Hielscher Ultrasonics предлагает различные решения на основе ультразвука для сдвига ДНК, РНК и хроматина. Вы можете выбрать ультразвуковые аппараты зондового типа (например, UP100H) для прямой ультразвуковой обработки с помощью микронаконечника или VialTweeeter или ультразвуковой горн для непрямой подготовки ДНК различных образцов одновременно. Hielscher предлагает идеальное устройство с учетом ваших потребностей: будь то 1 или до 10 образцов, объемы от микролитров до литров – Ультразвуковые аппараты Hielscher удовлетворят ваши требования по получению фрагментов ДНК, РНК и хроматина нужной длины. Воспроизводимость, простота в эксплуатации и точное управление позволяют создать надежную библиотеку для секвенирования нового поколения.
В отличие от ферментативной фрагментации ДНК, ультразвуковой сдвиг применяет чисто механические силы сдвига без добавления каких-либо химических веществ. Благодаря точной настройке параметров процесса, ультразвуковой сдвиг позволяет получить высокомолекулярные фрагменты ДНК (плазмиды и геномные ДНК).
Очищенные нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы до или после стадии фрагментации.
Параметрами ультразвуковой обработки (мощностью, циклом импульсов / пакетов, временем и температурой) можно безопасно управлять с помощью настроек программного обеспечения.

Протоколы ультразвукового сканирования ДНК

Для иммунопреципитации хроматина

Вкратце, клетки были помещены в чашки диаметром 60 мм (400 000 на чашку) и трансфицированы миРНК RhoA (как описано); через 72 ч их инкубировали с формальдегидом (конечная концентрация 1%) в течение 10 мин при 37°С для сшивания белков с ДНК. Реакцию сшивания гасили добавлением одной десятой объема 1,25 моль/л глицина, что давало конечную концентрацию 125 ммоль/л. Клетки дважды промывали ледяным PBS, ресуспендировали в буфере радиоиммунопреципитационного анализа [150 ммоль/л NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолата, 0,1% SDS, 5 ммоль/л ЭДТА, 50 ммоль/л Tris-HCl (pH 8,0)], содержащем 1 ммоль/л фенилметилсульфонилфторида, 1 Ag/мл апротинина и 1 Ag/мл пепстатина А, и держали на льду в течение 30 минут. Затем клеточные лизаты были обработаны ультразвуком на льду с помощью Hielscher UP200S ультразвуковой ультразвуковой аппарат (3 х 40 с, амплитуда 40%, цикл 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) до тех пор, пока сшитые хроматины не были срезаны с получением фрагментов ДНК от 200 до 1000.н. Одна десятая часть цельного лизата была использована для количественного определения количества ДНК, присутствующей в различных образцах, и рассматривалась как “общая входная ДНК”. Надосадочную жидкость инкубировали с ДНК/белком агарозы-50% суспензии спермы лосося для снижения неспецифического фона. Затем иммунопреципитацию проводили в течение ночи при 4°C с 5 Ag анти-NF-nB p65 (Север штата) или без антител (отрицательный контроль). Эти надосадочные жидкости добавляли 5 моль/л NaCl и нагревали в течение ночи при 65°C для восстановления поперечных связей белка и ДНК. В дальнейшем иммунокомплексы обрабатывали ДНКазной и РНКазной протеиназой К, а ДНК очищали экстракцией фенол/хлороформ и осаждением этанола. ПЦР проводили с использованием специфических праймеров, соответствующих последовательности в промоторной области гена iNOS человека (праймер p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; праймер p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Дублье и др., 2008)

Исследования экспрессии EGFP

Для исследований экспрессии в различных средах, как описано ранее, культивировали рекомбинантный штамм L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Германия) с геном EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), интегрированным хромосомным ssu, и дополнительно добавляли 100 мг л^-1 Нурсеотрикин (Jena Bioscience, Германия). Во время культивирования отбирали образцы по 1 мл, центрифугировали (2000 × г, 20°С, 10 мин) и промывали 0,9% раствором NaCl. Пеллету ресуспендировали в буфере (20 мМ HEPES, 5 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT) и дезактивировали сонификацией с помощью ультразвукового процессора УП400С (применение энергии ∼ 400 Вт). Клеточный мусор удаляли центрифугированием (6000 × г, 4°С, 5 мин) и анализировали с помощью электрофореза в виде додецилсульфата натрия – полиакриламидного геля (SDS-PAGE) в восстановительных условиях по методу Laemmli (1970) с 12,5% полиакраламидными гелями. Экспрессию EGFP исследовали в перемешанной культуре. (Фриче и др. 2007)

иммунопреципитация хроматина

Иммунопреципитацию хроматина проводили с помощью аппарата ChIP-IT^ТМ Экспресс (Active Motif, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя с некоторыми доработками. Короче говоря, дифференцированные подоциты человека сшивали 1% формальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки промывали ледяным PBS и останавливали реакцию фиксации добавлением 0,125 М глицина в течение 5 мин при комнатной температуре. Камеры снова промывали ледяным PBS и соскребли с посуды. Клетки гранулировали центрифугированием и ресуспендировали в буфере для лизиса. После центрифугирования гранулированные ядра ресуспендировали в буфере для сдвига, инкубировали на льду в течение 30 мин, а хроматин срезали с помощью ультразвука, например. УП100Ч (Hielscher Ultrasonics GmbH, Тельтов, Германия) при мощности 25% 5 импульсов по 20 сек на льду на фрагменты примерно 200–600.о. Затем срезанный хроматин центрифугировали и собирали надосадочную жидкость. Для иммунопреципитации 60 мкл хроматина инкубировали с 1 мкг антител Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, США), NF-κB p65 (Abcam, Кембридж, Великобритания) или NF-κB p50 (Abcam) или с антителами IgG кролика (Zymed Laboratories) в качестве отрицательного контроля в течение ночи при 4°C с осторожной ротацией. Иммунокомплексы, связанные с магнитными шариками, собирали с помощью магнитной подставки, тщательно промывали, а сшивки белок/ДНК переворачивали и элюировали ДНК для ПЦР-анализа в реальном времени. (Ристола и др. 2009)

Подготовка ДНК EHEC для анализа матрицы чипов

Расположение клеточных лизатов и выделенных ДНК
Бактериальные гранулы, взвешенные в PBS до желаемой конечной концентрации, обрабатывали ультразвуковой разрушитель UP100H (Hielscher GmbH, Германия) с микронаконечником MS1 (диаметр 1 мм). Рабочая частота составляла 30 кГц, а эффективная выходная мощность — 100 Вт. В ходе операции образцы охлаждались в ледяной водяной бане, перемешивались и центрифугировались. Образцы использовали для исследований проточной цитометрии, а для последующей обработки образцы подвергали тепловой обработке (95°C, 5 мин). Лизаты сырых клеток обрабатывали смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1). Равный объем этой смеси добавляли к образцу лизата, раствор энергично переворачивали в течение 15 с и центрифугировали при 15 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре (RT) около 22°C. Верхняя водная фаза, содержащая геномную ДНК, была тщательно отделена и собрана в новую стерильную пробирку Эппендорфа.
Впоследствии образцы были обработаны ультразвуком для фрагментации ДНК. Этап ультразвуковой обработки был реализован в тех же условиях, что и описанные выше. Для оценки эффектов фрагментации геномной ДНК образцы были проанализированы с помощью электрофореза в агарозном геле.
(…) Предварительно обработанные ультразвуком образцы в течение 2,5 мин подвергали стадии экстракции после термической обработки и центрифугирования. Высвобожденную ДНК дважды экстрагировали смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, а затем подвергали второму ультразвуку в течение 0 – 15 минут. Электрофорез в агарозном геле использовали для определения распределения по размерам ДНК, подвергнутой ультразвуковой фрагментации после экстракции (рис. вверху справа). Высокая фрагментация ДНК была очевидна по присутствию мазка ДНК, а не по высокомолекулярным полосам, которые были удалены из образцов, обработанных ультразвуком в течение 2,5 минут или дольше. Более длительная ультразвуковая обработка постепенно уменьшала длину фрагментов примерно до 150 – 600.н., а ультразвуковая обработка в течение 15 мин еще больше ухудшала эти фрагменты, что видно в основном по верхней части мазка. Таким образом, средний размер фрагмента ДНК постепенно уменьшался с течением времени ультразвука, а 5-минутная обработка позволила получить размеры фрагментов ДНК, наиболее подходящие для анализа чип-матриц. Наконец, была установлена процедура подготовки аналита ДНК, состоящая из первых 2 минут ультразвуковой обработки, экстракции ДНК (2×) и последующей 5-минутной ультразвуковой обработки. (Basselet et al. 2008)

Иммунопреципитация хроматина (ChIP)

Клетки HEK293 культивировали, как описано выше, и фиксировали 2 мМ дисукцинимидилглутарата в течение 45 мин при комнатной температуре. Впоследствии камеры дважды промывали PBS. Хроматин сшивали в течение 10 мин при комнатной температуре с использованием 1% (v/v) формальдегида и дважды промывали ледяным PBS. Реакцию сшивания останавливали инкубацией с глицином в конечной концентрации 0,125 М в течение 5 мин при комнатной температуре. После инкубации с трипсином клетки соскабливали с чашки для клеточной культуры и дважды промывали PBS. Клеточную гранулу ресуспендировали в буфере для лизиса (5 мМ трубок, pH 8,0, 85 мМ KCl и 0,5% (v/v) Nonidet P-40), инкубировали на льду в течение 10 мин и гомогенизировали с помощью гомогенизатора Dounce. Затем ядра гранулировали центрифугированием (3500 x g, 5 мин, 4 °C) и ресуспендировали в буфере для ядер (50 мМ Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA и 1% (w/v) SDS). Ядра были нарушены ультразвуком с тремя 20-секундными импульсами в течение Ультразвуковой аппарат UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) при задании цикла 0,5 и амплитуде 30%, с получением фрагментов геномной ДНК с объемным размером 200 – 1000.о. Для ChIP 50 г ДНК разбавляли в 4 раза в буфере для иммунопреципитации (16,7 мМ Tris-HCl, pH 8,1, 167 мМ NaCl, 1,2 мМ ЭДТА, 1,1% (v/v) Triton X-100 и 0,01% (w/v) SDS). (Вайске и др. 2006)

Анализ модификации гистонов методом иммунопреципитации хроматина (ChIP)

Вкратце, 6 x 10⁶ клетки дважды промывали PBS и сшивали на культуральной пластине в течение 15 мин при комнатной температуре в присутствии 0,5% формальдегида. Реакцию сшивания останавливали добавлением 0,125 М глицина. Все последующие этапы проводились при температуре 48°С. Все буферы были предварительно охлаждены и содержали ингибиторы протеазы (Complete Mini, Roche). Клетки дважды промывали PBS, а затем соскабливали. Собранные гранулы растворяли в 1 мл лизисного буфера (1% SDS, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ Tris pH 8) и обрабатывали ультразвуком в холодной этаноловой ванне в течение 10 циклов при 100% амплитуде с использованием Ультразвуковой аппарат UP50H (Хильшер, Тельтов, Германия). Фрагментацию хроматина визуализировали в 1% агарозном геле. Полученные фрагменты находились в диапазоне 200–500 пб. Растворимый хроматин получали центрифугированием образцов, обработанных ультразвуком, при 14 000 г в течение 10 мин при 48°С. Растворимую фракцию разводили на 1/10 в разбавляющем буфере (1% Triton X-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис pH 8, 150 мМ NaCl) затем аликвотировали и хранили при 80°С до использования. (Родригес и др. 2008)