Ультразвуковой сдвиг ДНК

Во время сдвига ДНК и РНК длинные молекулы ДНК фрагментируются на более мелкие части, что является важным этапом подготовки образцов к созданию библиотеки секвенирования нового поколения (NGS). Ультразвуковой сдвиг ДНК использует акустические кавитационные силы для разрушения ДНК или РНК на фрагменты размером от 100 до 5 кб. Этот метод позволяет точно контролировать размер фрагмента, облегчая настройку в соответствии с желаемой длиной ДНК для достижения оптимальных результатов секвенирования.

Резка ДНК с помощью ультразвука

Hielscher Ultrasonics предлагает различные решения на основе ультразвука для сдвига ДНК, РНК и хроматина. Вы можете выбрать ультразвуковые аппараты зондового типа (например, UP100H) для прямой ультразвуковой обработки с помощью микронаконечника или VialTweeeter или ультразвуковой горн для непрямой подготовки ДНК различных образцов одновременно. Hielscher предлагает идеальное устройство с учетом ваших потребностей: будь то 1 или до 10 образцов, объемы от микролитров до литров – Ультразвуковые аппараты Hielscher удовлетворят ваши требования по получению фрагментов ДНК, РНК и хроматина нужной длины. Воспроизводимость, простота в эксплуатации и точное управление позволяют создать надежную библиотеку для секвенирования нового поколения.
В отличие от ферментативной фрагментации ДНК, ультразвуковой сдвиг применяет чисто механические силы сдвига без добавления каких-либо химических веществ. Благодаря точной настройке параметров процесса, ультразвуковой сдвиг позволяет получить высокомолекулярные фрагменты ДНК (плазмиды и геномные ДНК).
Очищенные нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы до или после стадии фрагментации.
Параметрами ультразвуковой обработки (мощностью, циклом импульсов? пакетов, временем и температурой) можно безопасно управлять с помощью настроек программного обеспечения.

Протоколы ультразвукового сканирования ДНК

Для иммунопреципитации хроматина

Вкратце, клетки были помещены в чашки диаметром 60 мм (400 000 на чашку) и трансфицированы миРНК RhoA (как описано); через 72 ч их инкубировали с формальдегидом (конечная концентрация 1%) в течение 10 мин при 37°С для сшивания белков с ДНК. Реакцию сшивания гасили добавлением одной десятой объема 1,25 моль/л глицина, что давало конечную концентрацию 125 ммоль/л. Клетки дважды промывали ледяным PBS, ресуспендировали в буфере радиоиммунопреципитационного анализа [150 ммоль/л NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолата, 0,1% SDS, 5 ммоль/л ЭДТА, 50 ммоль/л Tris-HCl (pH 8,0)], содержащем 1 ммоль/л фенилметилсульфонилфторида, 1 Ag/мл апротинина и 1 Ag/мл пепстатина А, и держали на льду в течение 30 минут. Затем клеточные лизаты были обработаны ультразвуком на льду с помощью Hielscher UP200S ультразвуковой ультразвуковой аппарат (3 х 40 с, амплитуда 40%, цикл 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) до тех пор, пока сшитые хроматины не были срезаны с получением фрагментов ДНК от 200 до 1000.н. Одна десятая часть цельного лизата была использована для количественного определения количества ДНК, присутствующей в различных образцах, и рассматривалась как “общая входная ДНК”. Надосадочную жидкость инкубировали с ДНК/белком агарозы-50% суспензии спермы лосося для снижения неспецифического фона. Затем иммунопреципитацию проводили в течение ночи при 4°C с 5 Ag анти-NF-nB p65 (Север штата) или без антител (отрицательный контроль). Эти надосадочные жидкости добавляли 5 моль/л NaCl и нагревали в течение ночи при 65°C для восстановления поперечных связей белка и ДНК. В дальнейшем иммунокомплексы обрабатывали ДНКазной и РНКазной протеиназой К, а ДНК очищали экстракцией фенол/хлороформ и осаждением этанола. ПЦР проводили с использованием специфических праймеров, соответствующих последовательности в промоторной области гена iNOS человека (праймер p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; праймер p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Дублье и др., 2008)

Исследования экспрессии EGFP

Для исследований экспрессии в различных средах, как описано ранее, культивировали рекомбинантный штамм L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Германия) с геном EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), интегрированным хромосомным ssu, и дополнительно добавляли 100 мг л^-1 Нурсеотрикин (Jena Bioscience, Германия). Во время культивирования отбирали образцы по 1 мл, центрифугировали (2000 × г, 20°С, 10 мин) и промывали 0,9% раствором NaCl. Пеллету ресуспендировали в буфере (20 мМ HEPES, 5 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT) и дезактивировали сонификацией с помощью ультразвукового процессора УП400С (применение энергии ∼ 400 Вт). Клеточный мусор удаляли центрифугированием (6000 × г, 4°С, 5 мин) и анализировали с помощью электрофореза в виде додецилсульфата натрия – полиакриламидного геля (SDS-PAGE) в восстановительных условиях по методу Laemmli (1970) с 12,5% полиакраламидными гелями. Экспрессию EGFP исследовали в перемешанной культуре. (Фриче и др. 2007)

иммунопреципитация хроматина

Иммунопреципитацию хроматина проводили с помощью аппарата ChIP-IT^ТМ Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions with some modifications. Briefly, differentiated human podocytes were cross-linked with 1% formaldehyde for 10 min at room temperature. Cells were washed with ice-cold PBS and the fixation reaction was stopped by adding 0.125 M glycine for 5 min at room temperature. Cells were washed again with ice-cold PBS and scraped from the dish. Cells were pelleted by centrifugation and resuspended in the lysis buffer. After centrifugation, pelleted nuclei were resuspended in the shearing buffer, incubated on ice for 30 min and the chromatin was sheared by sonication, e.g. УП100Ч (Hielscher Ultrasonics GmbH, Тельтов, Германия) при мощности 25% 5 импульсов по 20 сек на льду на фрагменты примерно 200–600.о. Затем срезанный хроматин центрифугировали и собирали надосадочную жидкость. Для иммунопреципитации 60 мкл хроматина инкубировали с 1 мкг антител Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, США), NF-κB p65 (Abcam, Кембридж, Великобритания) или NF-κB p50 (Abcam) или с антителами IgG кролика (Zymed Laboratories) в качестве отрицательного контроля в течение ночи при 4°C с осторожной ротацией. Иммунокомплексы, связанные с магнитными шариками, собирали с помощью магнитной подставки, тщательно промывали, а сшивки белок/ДНК переворачивали и элюировали ДНК для ПЦР-анализа в реальном времени. (Ристола и др. 2009)

Подготовка ДНК EHEC для анализа матрицы чипов

Расположение клеточных лизатов и выделенных ДНК
Бактериальные гранулы, взвешенные в PBS до желаемой конечной концентрации, обрабатывали ультразвуковой разрушитель UP100H (Hielscher GmbH, Германия) с микронаконечником MS1 (диаметр 1 мм). Рабочая частота составляла 30 кГц, а эффективная выходная мощность – 100 Вт. В ходе операции образцы охлаждались в ледяной водяной бане, перемешивались и центрифугировались. Образцы использовали для исследований проточной цитометрии, а для последующей обработки образцы подвергали тепловой обработке (95°C, 5 мин). Лизаты сырых клеток обрабатывали смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1). Равный объем этой смеси добавляли к образцу лизата, раствор энергично переворачивали в течение 15 с и центрифугировали при 15 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре (RT) около 22°C. Верхняя водная фаза, содержащая геномную ДНК, была тщательно отделена и собрана в новую стерильную пробирку Эппендорфа.
Впоследствии образцы были обработаны ультразвуком для фрагментации ДНК. Этап ультразвуковой обработки был реализован в тех же условиях, что и описанные выше. Для оценки эффектов фрагментации геномной ДНК образцы были проанализированы с помощью электрофореза в агарозном геле.
(…) Предварительно обработанные ультразвуком образцы в течение 2,5 мин подвергали стадии экстракции после термической обработки и центрифугирования. Высвобожденную ДНК дважды экстрагировали смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, а затем подвергали второму ультразвуку в течение 0 – 15 минут. Электрофорез в агарозном геле использовали для определения распределения по размерам ДНК, подвергнутой ультразвуковой фрагментации после экстракции (рис. вверху справа). Высокая фрагментация ДНК была очевидна по присутствию мазка ДНК, а не по высокомолекулярным полосам, которые были удалены из образцов, обработанных ультразвуком в течение 2,5 минут или дольше. Более длительная ультразвуковая обработка постепенно уменьшала длину фрагментов примерно до 150 – 600.н., а ультразвуковая обработка в течение 15 мин еще больше ухудшала эти фрагменты, что видно в основном по верхней части мазка. Таким образом, средний размер фрагмента ДНК постепенно уменьшался с течением времени ультразвука, а 5-минутная обработка позволила получить размеры фрагментов ДНК, наиболее подходящие для анализа чип-матриц. Наконец, была установлена процедура подготовки аналита ДНК, состоящая из первых 2 минут ультразвуковой обработки, экстракции ДНК (2×) и последующей 5-минутной ультразвуковой обработки. (Basselet et al. 2008)

Иммунопреципитация хроматина (ChIP)

Клетки HEK293 культивировали, как описано выше, и фиксировали 2 мМ дисукцинимидилглутарата в течение 45 мин при комнатной температуре. Впоследствии камеры дважды промывали PBS. Хроматин сшивали в течение 10 мин при комнатной температуре с использованием 1% (v/v) формальдегида и дважды промывали ледяным PBS. Реакцию сшивания останавливали инкубацией с глицином в конечной концентрации 0,125 М в течение 5 мин при комнатной температуре. После инкубации с трипсином клетки соскабливали с чашки для клеточной культуры и дважды промывали PBS. Клеточную гранулу ресуспендировали в буфере для лизиса (5 мМ трубок, pH 8,0, 85 мМ KCl и 0,5% (v/v) Nonidet P-40), инкубировали на льду в течение 10 мин и гомогенизировали с помощью гомогенизатора Dounce. Затем ядра гранулировали центрифугированием (3500 x g, 5 мин, 4 °C) и ресуспендировали в буфере для ядер (50 мМ Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA и 1% (w/v) SDS). Ядра были нарушены ультразвуком с тремя 20-секундными импульсами в течение Ультразвуковой аппарат UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) при задании цикла 0,5 и амплитуде 30%, с получением фрагментов геномной ДНК с объемным размером 200 – 1000.о. Для ChIP 50 г ДНК разбавляли в 4 раза в буфере для иммунопреципитации (16,7 мМ Tris-HCl, pH 8,1, 167 мМ NaCl, 1,2 мМ ЭДТА, 1,1% (v/v) Triton X-100 и 0,01% (w/v) SDS). (Вайске и др. 2006)

Анализ модификации гистонов методом иммунопреципитации хроматина (ChIP)

Вкратце, 6 x 10⁶ клетки дважды промывали PBS и сшивали на культуральной пластине в течение 15 мин при комнатной температуре в присутствии 0,5% формальдегида. Реакцию сшивания останавливали добавлением 0,125 М глицина. Все последующие этапы проводились при температуре 48°С. Все буферы были предварительно охлаждены и содержали ингибиторы протеазы (Complete Mini, Roche). Клетки дважды промывали PBS, а затем соскабливали. Собранные гранулы растворяли в 1 мл лизисного буфера (1% SDS, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ Tris pH 8) и обрабатывали ультразвуком в холодной этаноловой ванне в течение 10 циклов при 100% амплитуде с использованием Ультразвуковой аппарат UP50H (Хильшер, Тельтов, Германия). Фрагментацию хроматина визуализировали в 1% агарозном геле. Полученные фрагменты находились в диапазоне 200–500 пб. Растворимый хроматин получали центрифугированием образцов, обработанных ультразвуком, при 14 000 г в течение 10 мин при 48°С. Растворимую фракцию разводили на 1/10 в разбавляющем буфере (1% Triton X-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис pH 8, 150 мМ NaCl) затем аликвотировали и хранили при 80°С до использования. (Родригес и др. 2008)