• Во время сдвига ДНК и РНК молекулы ДНК разбиваются на более мелкие кусочки. Фрагментация ДНК / РНК является одним из важных шагов по подготовке образцов, необходимых для создания библиотек для секвенирования следующего поколения (NGS).
• Ультразвуковые ДНК сдвиг использует силы акустической кавитации, чтобы сломать ДНК или РНК на куски 100 – 5кб пар оснований.
• Ультразвуковая резка позволяет точно фрагментацию ДНК и адаптации к желаемой длине ДНК.

Сдвиг ДНК с использованием ультразвука

Hielscher Ультразвук предлагает различные ультразвуковые на основе решения для ДНК, РНК и хроматина стрижки овец. Выбор между зондом типа ultrasonicators (например UP100H) для прямога обработки ультразвука с использованием микронаконечника, или использовать VialTweeeter или ультразвуковую cuphorn для непрямого препарата ДНК одновременно различных образцов. Hielscher предлагает идеальное устройство с учетом ваших потребностей: кастрированный бараном у вас есть 1 или до 10 образцов, объемы от микролитра до объемов литровых – Hielscher ультразвуковые процессоры доступны для удовлетворения ваших требований для подготовки ДНК, РНК и хроматина фрагментов в нужной длины. Воспроизводимость, простота в эксплуатации и точное управление обеспечивают надежную библиотеку для следующего поколения секвенирования.
В отличии от фрагментации ДНК ферментативной, ультразвуковая резка применяется чисто механические силы сдвига, без добавления каких-либо химических веществ. По точной настройке параметров процесса, ультразвуковые механические ножницы производят большие фрагменты молекулярной массы ДНК (плазмиды и геномная ДНК).
Очищенные нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы до или после стадии фрагментации.
Параметры обработки ультразвука (мощность, импульсный цикл / всплески, время и температура) можно регулировать с помощью безопасной настройки программного обеспечения.

Протоколы для ультразвуковой ДНК Shearing

Для хроматина иммунопреципитации

Вкратце, клетки высевали в чашки диаметром 60 мм (400 000 на блюдо) и трансфицировали RhoA siRNA (как описано); через 72 часа их инкубировали с формальдегидом (конечная концентрация, 1%) в течение 10 мин при 37 ° С для сшивания белков с ДНК. Реакцию поперечной сшивки гасили добавлением одного десятого объема 1,25 моль / л глицина с получением конечной концентрации 125 ммоль / л. Клетки промывали дважды ледяным PBS, ресуспендировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации [150 ммоль / л NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолата, 0,1% SDS, 5 ммоль / л ЭДТА, 50 ммоль / л Трис-HCl (pH 8,0 )], содержащей 1 ммоль / л фенилметилсульфонилфторида, 1 Аг / мл апротинина и 1 мкг / мл пепстатина А и выдерживали на льду в течение 30 мин. Затем клеточные лизаты обрабатывали ультразвуком на льду с помощью Хильшер UP200S УЗИ Sonicator (3 х 40 с, амплитуда 40%, 1 цикл; Хильшер Ультразвук GmbH) до сшитых chromatins были стриженый с получением ДНК-фрагментов от 200 до 1000 пар оснований. Одна десятой всего лизата была использована для определения количества ДНК, присутствующие в различных образцах и рассматривается как “общая ДНК ввода”, Супернатанты инкубируют с ДНК спермы лосося / белка агарозном-50% суспензии для снижения неспецифического фона. Иммунопреципитацию затем сделано в течение ночи при 4 ° С с 5 Ag анти-NF-NB p65 (Upstate) или без антител (отрицательный контроль). Эти супернатанты с добавлением 5 молей / л NaCl и нагревают в течение ночи при 65 ° C, чтобы вернуться белками-ДНК перекрестных ссылок. В иммунокомплексы дополнительно обрабатывали DNase- и РНКазы протеиназы К, и ДНК очищали фенол / хлороформ экстракции и осаждением этанолом. ПЦР проводили с специфических праймеров, соответствующих последовательности в промоторной области гена человека Inos (р1 праймер: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; р2 праймер: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier и др., 2008)

EGFP-экспрессирующие исследования

Для экспрессии исследований, рекомбинантного штамма L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Германия) с геном для EGFP (усиленный зеленый флуоресцирующий белок), хромосомная SSU интегрирован, культивировали в различных средах, как описано ранее, и кроме того, с добавлением 100 мг л^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Германия). Во время культивирования, отбирали пробы 1 мл, центрифугировали (2000 & bull; g, 20 ° C, 10 мин) и промывают 0,9% -ным раствором NaCl. Осадок ресуспендировали в буфере (20 мМ HEPES, 5 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ) и распадались обработкой ультразвуком с ультразвуковым процессором Up400s (Применение энергии ~ 400 Вт). Остатки клеток удаляли путем центрифугирования (6000 × г, 4 ° С, 5 мин) и анализировали с помощью додецилсульфата натрия - электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) в восстанавливающих условиях в соответствии с методом Laemmli (1970) с 12,5% polyacralamide гелей , EGFP-выражение было рассмотрено в возбужденном культуре. (Фриче и др., 2007)

хроматин иммунопреципитация

Анализ иммунопреципитации хроматина проводили с использованием чипа-IT^Тм Экспресс (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя с некоторыми изменениями. Вкратце, дифференцированный человек подоциты были сшитыми с 1% формальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки промывали охлажденным льдом PBS и реакцию фиксации останавливали добавлением 0,125 М глицин в течение 5 мин при комнатной температуре. Клетки снова промывали охлажденным льдом PBS и соскабливают с тарелки. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в буфере для лизиса. После центрифугирования осажденные ядра ресуспендировали в буфере сдвига, инкубировали на льду в течение 30 мин и хроматин был стриженый с помощью ультразвука, например, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Тельтов, Германия) при 25% мощности 5 импульсов по 20 секунд на льду на фрагменты приблизительно 200-600 б.п. Затем срезанный хроматин центрифугировали и супернатант собирали. Для иммунопреципитации 60 мкл хроматина инкубировали с 1 мкг Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) или антителами NF-κB p50 (Abcam) или с кроликом IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), как отрицательный контроль, в течение ночи при 4 ° C с нежным вращением. Иммунокомплексы, связанные с магнитными гранулами, собирали с использованием магнитной подставки, интенсивно промывали и сшивали белок / ДНК, и ДНК элюировали для анализа ПЦР в реальном времени. (Ristola et al., 2009)

ЭГЭЦ препарат ДНК для анализа массива чипа

Устройство клеточных лизатов и экстрагированных ДНК
Бактериальные гранулы суспендируют в PBS до желаемой конечной концентрации обрабатывали ультразвуковой дезинтегратор UP100H (Hielscher GmbH, Германия), оснащенный микропроцессором MS1 (1 мм в диаметре). Рабочая частота составляла 30 кГц, а эффективная выходная мощность составляла 100 Вт. Во время работы образцы охлаждали в бане с ледяной водой, смешивали и центрифугировали. Образцы использовались для исследований проточной цитометрии, а для последующей обработки образцы подвергались термообработке (95 ° С, 5 мин). Неочищенные клеточные лизаты обрабатывали смесью фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1). В образец лизата добавляли равный объем этой смеси, раствор интенсивно встряхивали в течение 15 с и центрифугировали при 15000 мкг в течение 2 мин при комнатной температуре (RT) около 22 ° С. Верхнюю водную фазу, содержащую геномную ДНК, тщательно отделяли и собирали в новой стерильной пробирке Эппендорфа.
Затем образцы обрабатывали ультразвуком для фрагментации ДНК. Шаг обработки ультразвуком осуществлялся в тех же условиях, которые описаны выше. Для оценки влияния фрагментации на геномную ДНК образцы анализировали с использованием электрофореза в агарозном геле.
(…) Образцы, обработанные ультразвуком ранее в течение 2,5 мин, подвергали стадии экстракции после термообработки и центрифугирования. Выделенный ДНК дважды экстрагировали смесью фенол: хлороформ: изоамиловый спирт, а затем подвергали второй обработке ультразвуком в течение 0-15 мин. Электрофорез в агарозном геле использовали для определения распределения по размерам ДНК, подвергнутой ультразвуковой фрагментации после экстракции (рис. В верхней правой части). Очень фрагментированная ДНК была очевидна из-за наличия ДНК-мазка, а не высокомолекулярных полос, которые были удалены из образцов, обработанных ультразвуком в течение 2,5 мин или дольше. Более длительная обработка ультразвуком постепенно уменьшала длину фрагмента до приблизительно 150-600 п.о., а обработка ультразвуком в течение 15 мин дополнительно ухудшала эти фрагменты, что видно, главным образом, верхней частью мазка. Таким образом, средний размер фрагмента ДНК постепенно снижался с временем ультразвука и 5-минутная обработка позволила получить размеры фрагментов ДНК, наиболее подходящих для анализов матрицы кристаллов. Наконец, была создана процедура получения анализируемого ДНК-ДНК, включающая первые 2 минуты ультразвуковой обработки, экстракцию ДНК (2 ×) и последующую 5-минутную обработку ультразвуком. (Basselet et al., 2008)

Иммунопреципитации хроматина (ЧИП)

Клетки HEK293 культивировали, как описано выше, и фиксировали 2 мМ дисукцинимидилглутарата в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем клетки дважды промывали PBS. Хроматин сшивали в течение 10 мин при комнатной температуре с использованием 1% (об. / Об.) Формальдегида и дважды промывали ледяным PBS. Реакцию сшивания останавливали инкубацией с глицином при конечной концентрации 0,125 М в течение 5 мин при комнатной температуре. После инкубации с трипсином клетки очищали от чашки с культурой клеток и дважды промывали PBS. Осадок клеток ресуспендировали в буфере для лизиса (5 мМ труб, рН 8,0, 85 мМ KCl и 0,5% (об. / Об.) Нонидетом Р-40), инкубировали на льду в течение 10 мин и гомогенизировали гомогенизатором Dounce. Затем ядра осаждали центрифугированием (3500 × 10, 5 мин, 4 ° С) и ресуспендировали в буфере ядер (50 мМ Трис-HCl, pH 8,1, 10 мМ ЭДТА и 1% (мас. / Об.) SDS). Ядра были разрушены ультразвуком с тремя 20-мя импульсами в UP50H Sonicator (Хильшер Ultraschall Technologie) при установке цикла 0,5 и амплитуда 30%, получая геномные ДНК-фрагменты с насыпного размером 200 - 1000 пара оснований. Для ChIP, 50g ДНК разбавляли в 4 раза в иммунопреципитации буфера (16,7 мМ Трис-HCl, рН 8,1, 167 мМ NaCl, 1,2 мМ ЭДТА, 1,1% (об / об) Тритона X-100, и 0,01% (вес / v) SDS). (Weiske и др. 2006)

Анализ гистонов модификация иммунопреципитации хроматина (ЧИП)

Вкратце, 6 х 10⁶ Клетки дважды промывали PBS и сшитый на культуральный планшет в течение 15 мин при комнатной температуре в присутствии 0,5% формальдегида. Реакция Сшивание останавливали добавлением 0,125 М глицина. Все последующие стадии проводили при 48 ° С. Все буферы были предварительно охлажденные и содержали ингибиторы протеазы (полный Mini, Roche). Клетки дважды промывали PBS, а затем соскабливают. Собранные гранулы растворяют в 1 мл буфера для лизиса (1% SDS, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ Трис рН 8) и обрабатывали ультразвуком в ванне холодным этанолом в течение 10 циклов при 100% амплитуды с использованием UP50H Sonicator (Хильшер, Teltow, Германия). Хроматина фрагментации визуализировали в 1% агарозном геле. Полученные фрагменты были в 200-500pb диапазоне. Растворимый хроматина получали центрифугированием обработанных ультразвуком образцов при 14000 в течение 10 мин при 48 ° С. Растворимую фракцию разбавляли 1/10 в буфере для разведения (1% Тритон Х-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис рН 8, 150 мМ NaCl), затем аликвоты и хранили при температуре 80 ° С до использования. (Родригес и др. 2008)