Ультразвуковая фрагментация ДНК

При фрагментации ДНК и РНК длинные молекулы ДНК разделяются на более мелкие фрагменты – это важнейший этап подготовки образцов для создания библиотек для секвенирования нового поколения (NGS). При ультразвуковой фрагментации ДНК силы акустической кавитации используются для разрыва ДНК или РНК на фрагменты размером от 100 bp до 5 kb. Этот метод обеспечивает точный контроль размера фрагментов, позволяя получать ДНК требуемой длины для достижения оптимальных результатов секвенирования.

Фрагментация ДНК с помощью обработки ультразвуком

Hielscher Ultrasonics предлагает различные решения на основе ультразвука для фрагментации ДНК, РНК и хроматина. Выберите ультразвуковой аппарат зондового типа (например, UP100H) для прямой обработки ультразвуком с использованием микронаконечника либо используйте VialTweeter или ультразвуковой CupHorn для одновременной непрямой подготовки ДНК в различных образцах. Hielscher предлагает идеальное устройство с учётом ваших потребностей: независимо от того, обрабатываете ли вы 1 образец или до 10 образцов, объёмы от микролитров до литров – ультразвуковые аппараты Hielscher удовлетворят ваши требования к получению фрагментов ДНК, РНК и хроматина нужной длины. Воспроизводимость, простота эксплуатации и точный контроль позволяют получать надёжную библиотеку для секвенирования нового поколения.
В отличие от ферментативной фрагментации ДНК, ультразвуковая фрагментация осуществляется исключительно за счёт механических сил сдвига без добавления каких-либо химических веществ. Благодаря точной настройке параметров процесса ультразвуковая фрагментация позволяет получать высокомолекулярные фрагменты ДНК (плазмидной и геномной ДНК).
Очищенные нуклеиновые кислоты можно амплифицировать до или после этапа фрагментации.
Параметры обработки ультразвуком (мощность, цикл импульсов / серии импульсов, время и температура) можно безопасно контролировать с помощью программных настроек.

Протоколы ультразвуковой фрагментации ДНК

Для анализа методом иммунопреципитации хроматина

Вкратце, клетки высевали в чашки диаметром 60mm (400 000 на чашку) и трансфицировали siRNA к RhoA (как описано); через 72 h их инкубировали с формальдегидом (конечная концентрация 1%) в течение 10 min при 37°C для сшивания белков с ДНК. Реакцию сшивания останавливали добавлением одной десятой объёма раствора глицина с концентрацией 1,25 mol/L, получая конечную концентрацию 125 mmol/L. Клетки дважды промывали ледяным PBS, ресуспендировали в буфере для радиоиммунопреципитации [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолата, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], содержащем 1 mmol/L фенилметилсульфонилфторида, 1 Ag/mL апротинина и 1 Ag/mL пепстатина A, и выдерживали на льду в течение 30 min. Затем клеточные лизаты обрабатывали ультразвуком на льду с помощью Hielscher UP200S – ультразвукового аппарата (3 x 40 s, амплитуда 40%, доля времени включения 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), пока сшитый хроматин не фрагментировался с образованием фрагментов ДНК размером от 200 до 1 000 bp. Одну десятую всего лизата использовали для количественного определения ДНК в различных образцах и рассматривали как «общую исходную ДНК». Супернатанты инкубировали с 50% суспензией ДНК спермы лосося/белковой агарозы для снижения неспецифического фона. Затем иммунопреципитацию проводили в течение ночи при 4°C с 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) или без антитела (отрицательный контроль). К этим супернатантам добавляли 5 mol/L NaCl и нагревали в течение ночи при 65°C для устранения сшивок между белками и ДНК. Иммунокомплексы дополнительно обрабатывали протеиназой K, свободной от ДНКаз и РНКаз, а ДНК очищали экстракцией фенолом/хлороформом и осаждением этанолом. ПЦР проводили со специфическими праймерами, соответствующими последовательности в промоторной области гена iNOS человека (праймер p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; праймер p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Исследования экспрессии EGFP

Для исследований экспрессии рекомбинантный штамм L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Германия) с геном EGFP (усиленного зелёного флуоресцентного белка), интегрированным в хромосомный локус ssu, культивировали в различных средах, как описано ранее, с дополнительным добавлением нурзеотрицина в концентрации 100 mg l^-1 (Jena Bioscience, Германия). В процессе культивирования отбирали образцы объёмом 1 ml, центрифугировали (2000 × g, 20°C, 10 min) и промывали раствором 0,9% NaCl. Осадок ресуспендировали в буфере (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) и разрушали обработкой ультразвуком с помощью ультразвукового процессора UP400S (подведённая энергия ∼ 400 Ws). Клеточные остатки удаляли центрифугированием (6000 × g, 4°C, 5 min) и анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) в восстанавливающих условиях по методу Laemmli (1970) с использованием 12,5% полиакриламидных гелей. Экспрессию EGFP исследовали в культуре при перемешивании. (Fritsche et al. 2007)

Иммунопреципитация хроматина

Анализ методом иммунопреципитации хроматина проводили с использованием ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя с некоторыми изменениями. Вкратце, в дифференцированных подоцитах человека проводили сшивание с помощью 1% формальдегида в течение 10 min при комнатной температуре. Клетки промывали ледяным PBS, а реакцию фиксации останавливали добавлением 0,125 M глицина на 5 min при комнатной температуре. Клетки снова промывали ледяным PBS и соскребали с чашки. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в буфере для лизиса. После центрифугирования осаждённые ядра ресуспендировали в буфере для фрагментации, инкубировали на льду в течение 30 min, а хроматин фрагментировали обработкой ультразвуком, например с помощью UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Тельтов, Германия) при мощности 25%, подавая 5 импульсов по 20 sec каждый на льду, до получения фрагментов размером приблизительно 200–600 bp. Затем фрагментированный хроматин центрифугировали и собирали супернатант. Для иммунопреципитации 60 μl хроматина инкубировали с 1 μg антител к Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США), NF-κB p65 (Abcam, Кембридж, Великобритания) или NF-κB p50 (Abcam) либо с кроличьим IgG (Zymed Laboratories) в качестве отрицательного контроля в течение ночи при 4°C при осторожном вращении. Иммунокомплексы, связанные с магнитными частицами, собирали с помощью магнитного штатива, тщательно промывали, затем устраняли сшивки между белками и ДНК и элюировали ДНК для анализа методом ПЦР в реальном времени. (Ristola et al. 2009)

Подготовка ДНК EHEC для анализа на микрочипах

Подготовка клеточных лизатов и выделенных ДНК
Бактериальные осадки, суспендированные в PBS до требуемой конечной концентрации, обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора UP100H (Hielscher GmbH, Германия), оснащённого микронаконечником MS1 (диаметром 1mm). Рабочая частота составляла 30 kHz, а эффективная выходная мощность – 100 W. Во время работы образцы охлаждали в бане с ледяной водой, перемешивали и центрифугировали. Образцы использовали для исследований методом проточной цитометрии, а для дальнейшей обработки подвергали термообработке (95°C, 5 min). Неочищенные клеточные лизаты обрабатывали смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1). Равный объём этой смеси добавляли к образцу лизата, раствор интенсивно перемешивали на вортексе в течение 15 s и центрифугировали при 15 000 x g в течение 2 min при комнатной температуре (RT), около 22°C. Верхнюю водную фазу, содержащую геномную ДНК, осторожно отделяли и собирали в новую стерильную пробирку Eppendorf.
Затем образцы обрабатывали ультразвуком для фрагментации ДНК. Этап обработки ультразвуком проводили в тех же условиях, что описаны выше. Для оценки влияния фрагментации на геномную ДНК образцы анализировали методом электрофореза в агарозном геле.
(…) Образцы, ранее обработанные ультразвуком в течение 2,5 min, подвергали экстракции после термообработки и центрифугирования. Высвободившуюся ДНК дважды экстрагировали смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, а затем повторно обрабатывали ультразвуком в течение 0 – 15 min. Электрофорез в агарозном геле использовали для определения распределения размеров ДНК, подвергнутой ультразвуковой фрагментации после экстракции (рисунок вверху справа). Высокая степень фрагментации ДНК подтверждалась наличием размытой полосы ДНК вместо высокомолекулярных полос, которые исчезали в образцах, обработанных ультразвуком в течение 2,5 min или дольше. Более длительная обработка ультразвуком постепенно уменьшала длину фрагментов приблизительно до 150 – 600 bp, а обработка в течение 15 min приводила к дальнейшему разрушению этих фрагментов, что заметно главным образом по верхней части размытой полосы. Таким образом, средний размер фрагментов ДНК постепенно уменьшался с увеличением времени обработки ультразвуком, а обработка в течение 5 min позволяла получать фрагменты ДНК с размерами, наиболее подходящими для анализа на микрочипах. В итоге была установлена процедура подготовки анализируемой ДНК, включающая сначала 2 min обработки ультразвуком, экстракцию ДНК (2×) и последующую обработку ультразвуком в течение 5 min. (Basselet et al. 2008)

Иммунопреципитация хроматина (ChIP)

Клетки HEK293 культивировали, как описано выше, и фиксировали с помощью 2 mM дисукцинимидилглутарата в течение 45 min при комнатной температуре. Затем клетки дважды промывали PBS. Хроматин сшивали в течение 10 min при комнатной температуре с использованием 1% (v/v) формальдегида и дважды промывали ледяным PBS. Реакцию сшивания останавливали инкубацией с глицином в конечной концентрации 0,125 M в течение 5 min при комнатной температуре. После инкубации с трипсином клетки соскребали с культуральной чашки и дважды промывали PBS. Клеточный осадок ресуспендировали в буфере для лизиса (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl и 0,5% (v/v) Nonidet P-40), инкубировали на льду в течение 10 min и гомогенизировали с помощью гомогенизатора Даунса. Затем ядра осаждали центрифугированием (3500 x g, 5 min, 4 °C) и ресуспендировали в буфере для ядер (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA и 1% (w/v) SDS). Ядра разрушали обработкой ультразвуком тремя импульсами длительностью 20 s с помощью ультразвукового аппарата UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) при настройке доли времени включения 0,5 и амплитуде 30%, получая фрагменты геномной ДНК, основная часть которых имела размер 200 – 1000 bp. Для ChIP 50g ДНК разбавляли в 4 раза в буфере для иммунопреципитации (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 и 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Анализ модификаций гистонов методом иммунопреципитации хроматина (ChIP)

Вкратце, 6 x 10⁶ клеток дважды промывали PBS и проводили сшивание на культуральном планшете в течение 15 min при комнатной температуре в присутствии 0,5% формальдегида. Реакцию сшивания останавливали добавлением 0,125 M глицина. Все последующие этапы проводили при 48°C. Все буферы были предварительно охлаждены и содержали ингибиторы протеаз (Complete Mini, Roche). Клетки дважды промывали PBS, а затем соскребали. Собранные осадки растворяли в 1 ml буфера для лизиса (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) и обрабатывали ультразвуком в холодной этанольной бане в течение 10 циклов при амплитуде 100% с помощью ультразвукового аппарата UP50H (Hielscher, Тельтов, Германия). Фрагментацию хроматина визуализировали в 1% агарозном геле. Полученные фрагменты имели размер в диапазоне 200–500pb. Растворимый хроматин получали центрифугированием обработанных ультразвуком образцов при 14 000g в течение 10 min при 48°C. Растворимую фракцию разбавляли 1/10 в буфере для разведения (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), затем разделяли на аликвоты и хранили при 80°C до использования. (Rodriguez et al. 2008)