Ультразвуковая фрагментация ДНК для секвенирования нового поколения

Секвенирование нового поколения (NGS) требует надежного разрыва под действием сдвига и фрагментации геномной ДНК для секвенирования цепей геномной ДНК и создания геномных библиотек. Контролируемая фрагментация ДНК на фрагменты является важнейшим этапом подготовки образцов, необходимым перед секвенированием ДНК. Обработка ультразвуком зарекомендовала себя как эффективный и надежный метод фрагментации ДНК с получением фрагментов определенной длины. Протоколы ультразвуковой фрагментации ДНК обеспечивают воспроизводимые результаты фрагментации. Ультразвуковые устройства Hielscher способны обеспечивать широкий спектр распределений фрагментов геномной ДНК по размерам, точно управляемых посредством рабочих параметров. Поскольку системы Hielscher для ультразвукового разрыва ДНК доступны для отдельных и нескольких пробирок, а также для микропланшетов, подготовка образцов становится высокоэффективной.

Секвенирование нового поколения: ультразвуковая фрагментация ДНК для подготовки библиотек

Для проведения секвенирования нового поколения необходимо выполнить три основных этапа: (1) подготовку библиотеки, (2) секвенирование и (3) анализ данных. При подготовке библиотеки ДНК фрагментируют, затем концы фрагментов восстанавливают (полируют) путем добавления одного аденинового основания, а целевые фрагменты преобразуют в двухцепочечную ДНК. Наконец, так называемые адаптеры присоединяют посредством лигирования, ПЦР или тагментации, чтобы можно было количественно определить конечный продукт ДНК библиотеки для секвенирования.
Фрагментация ДНК с помощью обработки ультразвуком: Особенно при использовании технологий секвенирования коротких прочтений, таких как Illumina, которые не позволяют с легкостью считывать более длинные фрагменты ДНК, цепи ДНК необходимо фрагментировать до определенного размера, что надежно достигается с помощью обработки ультразвуком.
Обработку ультразвуком можно надежно применять для фрагментации ДНК, РНК и хроматина.

Секвенирование нового поколения – подготовка библиотек

Ультразвуковая фрагментация ДНК широко применяется при подготовке библиотек для секвенирования ДНК на платформах секвенирования нового поколения (NGS). Этот метод используют для разрыва молекул ДНК на более мелкие фрагменты в желаемом диапазоне размеров, что облегчает последующие этапы подготовки библиотеки. Ультразвуковая фрагментация ДНК обычно необходима на этапе подготовки библиотеки в рабочих процессах NGS, чтобы разделить геномную ДНК на более мелкие фрагменты, пригодные для дальнейшей обработки и секвенирования. Она играет решающую роль в обеспечении успешного проведения эксперимента по секвенированию, формируя фрагменты ДНК в диапазоне размеров, подходящем для конкретной используемой платформы секвенирования.

Секвенирование нового поколения – этапы процесса:

• Ультразвуковая фрагментация ДНК: Перед созданием библиотеки геномную ДНК фрагментируют на более мелкие части, с которыми проще работать. Ультразвуковая фрагментация предполагает использование высокочастотных звуковых волн для разрыва молекул ДНК под действием сдвига на фрагменты в желаемом диапазоне размеров. Этот этап имеет решающее значение, поскольку помогает обеспечить соответствие длины получаемых впоследствии прочтений используемой платформе секвенирования. Диапазон размеров фрагментов можно регулировать в соответствии с конкретными требованиями эксперимента по секвенированию.
• Клональная амплификация методом ПЦР: После ультразвуковой фрагментации фрагменты ДНК подвергают восстановлению концов, лигированию адаптеров и ПЦР-амплификации для получения конечных библиотек для секвенирования ДНК. Эти этапы подготавливают фрагментированные молекулы ДНК к процессу секвенирования путем добавления адаптерных последовательностей, необходимых для связывания с платформой секвенирования и предоставляющих участки связывания праймеров для ПЦР-амплификации.
• Секвенирование ДНК путем синтеза: После подготовки библиотек для секвенирования начинается процесс секвенирования ДНК путем синтеза (SBS). В ходе SBS последовательность ДНК определяют посредством последовательного добавления нуклеотидов к комплементарной цепи. Этот этап включает циклические реакции встраивания нуклеотидов, визуализации и расщепления, что позволяет определить последовательность ДНК по флуоресцентным сигналам, испускаемым встроенными нуклеотидами.
• Массовое параллельное секвенирование: На заключительном этапе пространственно разделенные амплифицированные матрицы ДНК секвенируют одновременно в массовом параллельном режиме. Этот высокопроизводительный подход к секвенированию позволяет получать от миллионов до миллиардов прочтений за один запуск секвенирования, обеспечивая эффективное и быстрое определение последовательностей ДНК.

Как работает ультразвуковая фрагментация ДНК?

Обработка ультразвуком, также известная как акустическая обработка образцов, является широко используемым методом фрагментации ДНК. Для ультразвукового разрыва ДНК образцы подвергают воздействию ультразвуковых волн в контролируемых условиях. Принцип работы ультразвуковой фрагментации ДНК основан на колебаниях и кавитации, создаваемых ультразвуковыми волнами. Сдвиговые силы, возникающие вследствие ультразвуковой (акустической) кавитации, разрывают высокомолекулярные молекулы ДНК. Настройки обработки ультразвуком, такие как интенсивность (амплитуда, продолжительность), импульсный режим и температура, позволяют точно фрагментировать ДНК до определенной желаемой длины фрагментов. Хотя при обработке ультразвуком ДНК часто сокращают до 100–600 bp, при применении более мягких условий ультразвуковой обработки можно получить более длинные фрагменты ДНК длиной до 1300 bp.

Контроль температуры для предотвращения деградации ДНК

Двухцепочечная молекулярная структура ДНК очень чувствительна к повышенным температурам, поэтому точный контроль температуры на этапах подготовки образцов является решающим фактором для получения надежных результатов анализа.
Независимо от того, используете ли вы зондовые ультразвуковые устройства Hielscher, VialTweeter или UIP400MTP, непрерывный мониторинг и контроль температуры обеспечиваются благодаря подключаемому датчику температуры и интеллектуальному программному обеспечению устройства. Для поддержания температуры в определенном диапазоне можно задать верхний и нижний температурные пределы. Соответственно, ультразвуковое устройство приостановит работу, как только этот температурный предел будет превышен, и автоматически продолжит обработку ультразвуком, когда температура снизится на заданную величину ∆T.
Совершенное программное обеспечение ультразвуковых устройств Hielscher обеспечивает надежное поддержание идеальных условий обработки образцов.

Фрагментация ДНК в большом количестве образцов с помощью ультразвукового устройства UIP400MTP для многолуночных планшетов

За последнее десятилетие количество образцов в науках о жизни значительно увеличилось. Это означает, что очень большое количество образцов (например, 384, 1536 или 3456 лунок на микропланшет) необходимо обрабатывать в ходе подготовки образцов и анализа в неизменно одинаковых условиях для получения сопоставимых и достоверных результатов. С устройством UIP400MTP компания Hielscher Ultrasonics следует тенденции обработки большого количества образцов. UIP400MTP представляет собой ультразвуковое устройство для подготовки образцов с использованием микропланшетов. UIP400MTP может обрабатывать планшеты с 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 или 3456 лунками. В зависимости от типа микропланшета каждая лунка обычно может вмещать образцы объемом от десятков нанолитров до нескольких миллилитров. UIP400MTP широко применяется в исследованиях в области наук о жизни и очень часто используется для подготовки образцов перед такими анализами, как ELISA (иммуноферментный анализ) или ПЦР, перед анализом белков, а также для подготовки хроматина перед CHiP и CHiP-seq, выявления модификаций гистонов и других аналитических процедур (например, гель-электрофореза, масс-спектрометрии).
Узнайте больше о высокопроизводительной обработке ПЦР-планшетов!

VialTweeter для подготовки образцов в количестве до 10 пробирок

VialTweeter – широко используемое лабораторное ультразвуковое устройство VialTweeter, позволяющее эффективно и удобно обрабатывать ультразвуком до 10 пробирок одновременно. Поскольку флаконы и пробирки (например, пробирки Eppendorf, криопробирки, центрифужные пробирки) обрабатываются ультразвуком косвенно, исключается любое перекрестное загрязнение. Поскольку каждому образцу передается ультразвук одинаковой интенсивности, все результаты обработки ультразвуком однородны и воспроизводимы. VialTweeter предлагает все интеллектуальные функции, которыми оснащены другие наши цифровые устройства (например, интеллектуальное меню, программируемые настройки, контроль температуры, дистанционное управление и т. д.), обеспечивая высочайший комфорт пользователя.

Многопальцевые зонды для планшетов с микролунками

Многопальцевые зонды с 4 или 8 пальцами, доступные для зондовых ультразвуковых гомогенизаторов UP200Ht и UP200St, представляют собой удобный вариант для одновременной обработки ультразвуком нескольких образцов в одинаковых условиях. Например, сонотрод MTP-24-8-96 является восьмипальцевым зондом, который идеально подходит для интеграции в автоматизированные системы или эффективной ручной подготовки образцов в лунках многолуночных планшетов. Многопальцевый сонотрод идеально подходит для автоматизации в лабораториях, где преимущественно обрабатывают образцы в стаканах и пробирках с помощью стандартного ультразвукового сонотрода. Многопальцевые и стандартные зонды можно быстро заменять один другим за несколько минут, превращая ультразвуковое устройство с одним зондом в многозондовый ультразвуковой дезинтегратор.

Ультразвуковые устройства Hielscher для фрагментации ДНК

Hielscher Ultrasonics предлагает различные ультразвуковые платформы для фрагментации ДНК, РНК и хроматина. Эти различные платформы включают ультразвуковые зонды (сонотроды), решения для косвенной обработки ультразвуком с целью одновременной подготовки образцов в нескольких пробирках или многолуночных планшетах (например, 96-луночных планшетах, микротитрационных планшетах), сонореакторы и ультразвуковые CupHorn. Все платформы для разрыва ДНК оснащены высокопроизводительными ультразвуковыми процессорами с настроенной частотой, которые обеспечивают точное управление и воспроизводимые результаты.

Ультразвуковые процессоры для любого количества и объема образцов

С помощью ультразвуковых устройств Hielscher для нескольких образцов VialTweeter (для обработки до 10 пробирок) и UIP400MTP (для микропланшетов / многолуночных планшетов) можно легко сократить время обработки образцов благодаря интенсивной и точно управляемой обработке ультразвуком, одновременно получая желаемое распределение фрагментов ДНК по размерам и желаемый выход. Ультразвуковая фрагментация ДНК делает подготовку образцов эффективной, надежной и масштабируемой. Протоколы можно линейно масштабировать от одного до множества образцов, применяя постоянно контролируемый ультразвук.
Зондовые ультразвуковые устройства с одним–пятью пальцами идеально подходят для подготовки меньшего количества образцов. Лабораторные ультразвуковые устройства Hielscher доступны в различных размерах, поэтому мы можем рекомендовать вам идеальное устройство для вашей задачи и требований.

Точный контроль процесса

Точно управляемые настройки обработки ультразвуком имеют решающее значение, поскольку чрезмерная обработка ультразвуком может разрушить ДНК, РНК и хроматин, а недостаточный ультразвуковой разрыв приводит к получению слишком длинных фрагментов ДНК и хроматина. Цифровые ультразвуковые устройства Hielscher можно легко настроить на точные параметры обработки ультразвуком. Конкретные настройки обработки ультразвуком также можно сохранить в качестве запрограммированных настроек для быстрого повторения той же процедуры.
Все сеансы обработки ультразвуком автоматически протоколируются и сохраняются в виде CSV-файла на встроенной SD-карте. Это обеспечивает точное документирование проведенных испытаний и позволяет легко просматривать сеансы обработки ультразвуком.
Всеми цифровыми ультразвуковыми устройствами можно управлять дистанционно через любой стандартный браузер и контролировать их работу. Установка дополнительного программного обеспечения не требуется, поскольку подключение по LAN обеспечивает очень простую настройку по принципу «подключи и работай».


Высочайшее удобство использования при ультразвуковой подготовке образцов

Все ультразвуковые устройства Hielscher разработаны для обеспечения высокопроизводительной ультразвуковой обработки и при этом всегда остаются очень удобными и простыми в эксплуатации. Все настройки хорошо структурированы в понятном меню, к которому можно легко получить доступ через цветной сенсорный дисплей или дистанционное управление в браузере. Интеллектуальное программное обеспечение с программируемыми настройками и автоматической записью данных обеспечивает оптимальные настройки обработки ультразвуком для получения надежных и воспроизводимых результатов. Понятный и простой в использовании интерфейс меню делает ультразвуковые устройства Hielscher удобными и эффективными.
Приведенная ниже таблица дает представление о приблизительной производительности наших лабораторных ультразвуковых устройств, которые идеально подходят для таких задач подготовки образцов, как фрагментация ДНК и РНК, лизис клеток и экстракция белков: