Ультразвуковая фрагментация ДНК для секвенирования нового поколения

Секвенирование нового поколения (NGS) требует надежного сдвига и фрагментации геномной ДНК для секвенирования геномных нитей ДНК и создания библиотек генома. Контролируемая фрагментация ДНК на фрагменты ДНК является важным этапом подготовки образца, необходимым перед секвенированием ДНК. Ультразвуковая технология доказала свою эффективность и надежность при фрагментации ДНК определенной длины. Протоколы ультразвуковой фрагментации ДНК позволяют получить воспроизводимые результаты фрагментации. Ультразвуковые аппараты Hielscher способны производить широкий спектр распределений по размерам фрагментов геномной ДНК, которые можно точно контролировать с помощью рабочих параметров. Поскольку ультразвуковые системы сдвига ДНК Hielscher доступны для одного и нескольких флаконов, а также для микропланшетов, подготовка образцов становится очень эффективной.

Секвенирование нового поколения: ультразвуковая фрагментация ДНК для подготовки библиотеки

Для того, чтобы выполнить секвенирование нового поколения, необходимо выполнить три основных этапа: (1) подготовку библиотеки, (2) секвенирование и (3) анализ данных. Во время подготовки библиотеки ДНК фрагментируется фрагмент, затем концы фрагментов восстанавливаются (полируются) путем добавления одного аденинового основания, а целевые фрагменты преобразуются в двухцепочечную ДНК. Наконец, так называемые адаптеры прикрепляются с помощью лигирования, ПЦР или маркации, чтобы конечный продукт ДНК библиотеки мог быть количественно определен для секвенирования.
Фрагментация ДНК с помощью ультразвуковой обработки: В частности, при использовании технологий короткого секвенирования, таких как Illumina, которые не могут легко считывать более длинные фрагменты ДНК, стойки ДНК должны быть фрагментированы до определенного размера, что может быть надежно достигнуто с помощью ультразвука.
Ультразвуковое исследование может быть надежно использовано для фрагментации ДНК, РНК и хроматина.

Секвенирование нового поколения – Подготовка библиотеки

Ультразвуковая фрагментация ДНК обычно используется при подготовке библиотек секвенирования ДНК для платформ секвенирования нового поколения (NGS). Этот метод используется для разбиения молекул ДНК на более мелкие фрагменты желаемого диапазона размеров, что облегчает последующие этапы подготовки библиотеки. Ультразвуковая фрагментация ДНК обычно требуется на этапе подготовки библиотеки в рабочих процессах NGS для фрагментации геномной ДНК на более мелкие части, пригодные для последующей обработки и секвенирования. Он играет решающую роль в обеспечении успеха эксперимента по секвенированию путем генерации фрагментов ДНК соответствующего диапазона размеров для конкретной используемой платформы секвенирования.

Секвенирование нового поколения – Этапы процесса:

• Ультразвуковая фрагментация ДНК: Перед созданием библиотеки геномная ДНК фрагментируется на более мелкие, более управляемые части. Ультразвуковая фрагментация предполагает использование высокочастотных звуковых волн для разрезания молекул ДНК на фрагменты нужного диапазона размеров. Этот шаг имеет решающее значение, поскольку он помогает гарантировать, что последующие чтения секвенирования будут иметь достаточную длину для используемой платформы секвенирования. Диапазон размеров фрагментов может быть скорректирован в зависимости от конкретных требований эксперимента по секвенированию.
• Клональная амплификация методом ПЦР: После ультразвуковой фрагментации фрагменты ДНК подвергаются репарации конца, лигированию адаптера и амплификации ПЦР для создания окончательных библиотек секвенирования ДНК. Эти этапы подготавливают фрагментированные молекулы ДНК к процессу секвенирования путем добавления адаптерных последовательностей, необходимых для связывания с платформой секвенирования, и предоставления прайминг-сайтов для амплификации ПЦР.
• Секвенирование ДНК методом синтеза: После того, как библиотеки секвенирования подготовлены, начинается процесс секвенирования ДНК путем синтеза (SBS). Во время SBS последовательность ДНК определяется путем последовательного добавления нуклеотидов к комплементарной цепи. Этот этап включает в себя циклические реакции включения нуклеотидов, визуализации и расщепления, что позволяет определить последовательность ДНК на основе флуоресцентных сигналов, излучаемых включенными нуклеотидами.
• Массивно-параллельное секвенирование: На последнем этапе пространственно сегрегированные, амплифицированные матрицы ДНК секвенируются одновременно массивно параллельным образом. Этот подход к секвенированию с высокой пропускной способностью позволяет генерировать от миллионов до миллиардов прочтений секвенирования за один прогон секвенирования, что позволяет эффективно и быстро определять последовательности ДНК.

Как работает ультразвуковая фрагментация ДНК?

Ультразвуковая обработка, также известная как акустическая обработка образцов, является широко используемым методом фрагментации ДНК. При ультразвуковом сдвиге ДНК образцы подвергаются воздействию ультразвуковых волн в контролируемых условиях. Принцип работы ультразвуковой фрагментации ДНК основан на вибрациях и кавитации, создаваемых ультразвуковыми волнами. Поперечные силы, возникающие в результате ультразвуковой (акустической) кавитации, разрушают высокомолекулярные молекулы ДНК. Настройка ультразвука, такая как интенсивность (амплитуда, продолжительность), режим пульсации и температура, позволяет точно фрагментировать фрагменты ДНК до определенной желаемой длины. В то время как ДНК часто восстанавливают до 100-600.о. с помощью ультразвука, более длинные фрагменты ДНК до 1300.о. могут быть получены при применении более мягких ультразвуковых условий.

Контроль температуры для предотвращения деградации ДНК

Двухцепочечная молекулярная форма ДНК очень чувствительна к повышенным температурам, поэтому точный контроль температуры на этапах подготовки образцов является решающим фактором для получения надежных результатов анализа.
Независимо от того, используете ли вы ультразвуковые датчики Hielscher, VialTweeter или UIP400MTP – Непрерывный мониторинг и контроль температуры обеспечивается благодаря подключаемому датчику температуры и программному обеспечению интеллектуального устройства. Для того чтобы поддерживать температуру в определенном диапазоне, можно установить верхний и нижний предел температуры. Следовательно, ультразвуковой аппарат приостанавливается, как только этот температурный предел будет превышен, и автоматически продолжит ультразвуковую обработку, когда температура снизится на заданный ∆T.
Сложное программное обеспечение ультразвуковых аппаратов Hielscher обеспечивает надежное поддержание идеальных условий обработки образцов.

Фрагментация массового образца ДНК с помощью ультразвукового аппарата UIP400MTP Multi-Well Plate

За последнее десятилетие количество выборок в медико-биологических науках значительно увеличилось. Это означает, что очень большое количество образцов (например, 384, 1536 или 3456 лунок на микропланшет) должно быть обработано во время подготовки и анализа образцов в постоянно равных условиях для получения сопоставимых и достоверных результатов. С UIP400MTP компания Hielscher Ultrasonics следует тенденции массовой обработки образцов. UIP400MTP представляет собой ультразвуковой аппарат для пробоподготовки с использованием микропланшетов. UIP400MTP может обрабатывать пластины с 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 или 3456 скважинами. В зависимости от типа микропланшета каждая лунка обычно может вмещать образцы объемом от десятков нанолитров до нескольких миллилитров. Широко используемый в медико-биологических исследованиях, UIP400MTP очень часто используется для подготовки образцов перед такими анализами, как ИФА (иммуноферментный анализ) или ПЦР, перед анализом белков, а также для получения хроматина перед CHiP и CHiP-секвенированием, идентификации модификации гистонов и других аналитических методов лечения (например, гель-электрофорез, масс-спектрометрия).

VialTweeter для прапарирования образцов до 10 флаконов

VialTweeter - это широко используемый лабораторный ультразвуковой аппарат VialTweeter, который позволяет эффективно и комфортно обрабатывать ультразвуком до 10 флаконов одновременно. Поскольку флаконы и пробирки (например, флаконы Эппендорфа, криопробирки, центрифужные пробирки) обрабатываются ультразвуком косвенно, любое перекрестное загрязнение исключено. Поскольку к каждому образцу подается ультразвук с одинаковой интенсивностью, все результаты ультразвуковой обработки являются однородными и воспроизводимыми. VialTweeter предлагает все интеллектуальные функции, как и другие наши цифровые устройства (например, умное меню, программируемые настройки, контроль температуры, дистанционное управление и т. д.), чтобы обеспечить максимальный комфорт пользователя.

Многопальцевые зонды для микролуночных планшетов

Многопальцевые датчики с 4 или 8 пальцами, доступные для ультразвуковых зондовых гомогенизаторов UP200Ht и UP200St, являются удобным вариантом для одновременного ультразвукового исследования нескольких образцов в одинаковых условиях. Например, сонотрод MTP-24-8-96 представляет собой восьмипальцевый зонд, который идеально подходит для интеграции в автоматизированные системы или эффективной ручной пробоподготовки лунок многолуночных планшетов. Многопальцевый сонотрод идеально подходит для автоматизации в лабораториях, где в основном обрабатываются стаканы и пробирки с использованием стандартного ультразвукового сонотрода. Многопальцевые и стандартные преобразователи могут быть быстро заменены в течение нескольких минут, превращая ультразвуковой преобразователь с одним зондом в ультразвуковой преобразователь с несколькими зондами.

Ультразвуковые аппараты Hielscher для фрагментации ДНК

Hielscher Ultrasonics предлагает различные платформы на основе ультразвука для фрагментации ДНК, РНК и хроматина. Эти различные платформы включают ультразвуковые зонды (сонотроды), решения для непрямой ультразвуковой обработки для одновременной подготовки образцов нескольких пробирок или многолуночных планшетов (например, 96-луночных планшетов, микротитровых планшетов), сонореакторы и ультразвуковые чашечные горны. Все платформы для анализа ДНК оснащены высокопроизводительными ультразвуковыми процессорами с частотной настройкой, которые точно управляются и обеспечивают воспроизводимые результаты.

Ультразвуковые процессоры для любого количества и размера образцов

С помощью многовыборочных ультразвуковых аппаратов Hielscher VialTweeter (до 10 пробирок) и UIP400MTP (для микропланшетов/многолуночных планшетов) можно легко сократить время обработки образцов за счет интенсивного и точно контролируемого ультразвука при одновременном получении желаемого распределения фрагментов ДНК по размерам и выходу. Ультразвуковая фрагментация ДНК делает пробоподготовку эффективной, надежной и масштабируемой. Протоколы могут быть линейно масштабированы от одного до нескольких образцов с применением постоянно контролируемого ультразвука.
Зондовые ультразвуковые аппараты с одним-пятью пальцами идеально подходят для подготовки образцов с меньшим количеством образцов. Лабораторные ультразвуковые аппараты Hielscher доступны в различных размерах, поэтому мы можем порекомендовать вам идеальное устройство для вашего применения и требований.

Точное управление технологическим процессом

Точно контролируемые настройки ультразвука имеют решающее значение, поскольку изнурительная сонификация может разрушить ДНК, РНК и хроматин, но недостаточный ультразвуковой сдвиг приводит к слишком длинным фрагментам ДНК и хроматина. Цифровые ультразвуковые аппараты Hielscher могут быть легко настроены на точный параметр ультразвуковой обработки. Конкретные настройки ультразвука также могут быть сохранены в виде запрограммированных настроек для быстрого повторения одной и той же процедуры.
Все ультразвуковые обработки автоматически протоколируются и сохраняются в виде CSV-файла на встроенной SD-карте. Это позволяет точно документировать выполненные испытания и позволяет легко пересматривать прогоны ультразвука.
С помощью дистанционного управления через браузер можно управлять всеми цифровыми ультразвуковыми аппаратами и контролировать их с помощью любого стандартного браузера. Установка дополнительного программного обеспечения не требуется, так как подключение к локальной сети позволяет очень просто настроить технологию plug-n-play.

Высочайшее удобство использования при ультразвуковой пробоподготовке

Все ультразвуковые аппараты Hielscher разработаны для обеспечения высокопроизводительного ультразвука, в то же время они всегда очень удобны в использовании и просты в эксплуатации. Все настройки хорошо структурированы в понятном меню, доступ к которому можно легко получить с помощью цветного сенсорного дисплея или пульта дистанционного управления в браузере. Интеллектуальное программное обеспечение с программируемыми настройками и автоматической записью данных обеспечивает оптимальные настройки ультразвука для надежных и воспроизводимых результатов. Понятный и простой в использовании интерфейс меню превращает ультразвуковые аппараты Hielscher в удобные и эффективные устройства.
В таблице ниже приведена приблизительная производительность наших лабораторных ультразвуковых аппаратов, которые идеально подходят для выполнения задач по подготовке образцов, таких как фрагментация ДНК и РНК, лизис клеток, а также экстракция белка: