Ультразвуковой лизис образцов Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster широко используется в лабораториях в качестве модельного организма. Поэтому необходимо часто проводить этапы преаналитической подготовки, такие как лизис, разрушение клеток, экстракция белка и срез ДНК образцов Drosophila melanogaster. Ультразвуковые дисмембраны надежны и эффективны и могут использоваться для выполнения различных задач, таких как лизис, экстракция белка или фрагментация ДНК, легко регулируя только параметры ультразвукового процесса. Таким образом, ультразвуковые гомогенизаторы являются гибкими инструментами с широким спектром применения.

Ультразвуковой лизис и экстракция белка

Лизис, солюбилизация клеток, гомогенизация тканей и экстракция белка являются типичными задачами для ультразвуковых дисмбраторов в биологических лабораториях. Ультразвуковые дисмбраторы и клеточные разрушители хорошо подходят для гомогенизации тканей животных, насекомых (например, Drosophila melanogaster, C. elegans) или образцов растений. Последующими областями применения ультразвука являются лизис клеточных суспензий и гранул, а также экстракция внутриклеточных белков.
Ультразвуковой лизис и экстракция белка являются высоконадежными и воспроизводимыми процессами, которые могут быть выполнены на основе установленных протоколов. Поскольку интенсивность ультразвукового процесса может быть точно отрегулирована с помощью таких параметров ультразвука, как амплитуда, цикл/импульсный режим, температура и объем образца, однажды проверенные протоколы могут повторяться с одним и тем же результатом снова и снова.

Ультразвуковая фрагментация ДНК и РНК

После лизиса клеток и экстракции белка общим обязательным этапом подготовки образца является сдвиг и фрагментация ДНК, РНК и хроматина, например, перед иммунопреципитацией хроматина (ChIP). Фрагментация ДНК и РНК может быть надежно достигнута путем разрыва ковалентных связей, которые удерживают ДНК вместе под действием физических сил. При использовании физического среза, такого как ультразвуковая обработка, сначала разрываются нити ДНК, а затем ДНК фрагментируется на более мелкие части.
Ультразвуковая фрагментация ДНК надежна и эффективна при резке ДНК до целевой длины, например, 500.о. (пары оснований). К основным преимуществам ультразвуковой фрагментации ДНК можно отнести точный контроль параметров и интенсивности ультразвукового процесса. Параметры ультразвукового процесса можно регулировать путем точной настройки интенсивности ультразвуковой обработки, циклов и времени. Это позволяет создавать ДНК желаемого размера, а также надежно производить и воспроизводить целевую длину ДНК. Ультразвуковой сдвиг ДНК также идеально подходит для создания высокомолекулярных фрагментов ДНК.

Протоколы ультразвукового лизиса Drosophila melanogaster

Ниже приведены различные протоколы ультразвукового лизиса, экстракции белка и фрагментации ДНК или хроматина образцов дрозофилы.

Ультразвуковой лизис для иммунопреципитации с поперечным сшиванием (CLIP)

Анализ CLIP проводили, как сообщалось ранее, с некоторыми изменениями. Яичникам от 0 до 1 дня самок дикого типа вводили примерно 20 мг УФ-сшивки (3 × 2000 мкДж/см2), гомогенизировали на льду в буфере RCB объемом 1 мл (50 мМ HEPES pH 7,4, 200 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 мМ сахарозы, 1 мМ DTT, 1× полных ингибиторов протеазы без ЭДТА, 1 мМ PMSF) с добавлением 300 Ед РНКсеOUT и помещали на лед на 30 минут. Гомогенат подвергался ультразвуковой обработке на льду при мощности 80% пять раз за 20 с всплесками с перерывом в 60 с с использованием ультразвукового процессора Hielscher UP100H (100 Вт, 30 кГц) и центрифугированными (16000 × г в течение 5 мин при 4°C). Растворимый экстракт предварительно очищали с помощью 20 мкл динаб Protein-G в течение 20 мин при 4°C. После забора образцов для иммуноблоттинга и количественного определения поступления РНК (1%) HP1 иммунопреципитировали антителом против HP1 9A9 из 450 мкл предварительно очищенного экстракта путем инкубации в течение 4 ч с 50 мкл динаб Protein-G. Иммунопреципитаты промывали 4 раза РХБ. Для элюирования иммунопреципитированных РНК гранулированные гранулы кипятили в 100 мкл воды, обработанной ультрачистой DEPC, в течение 5 мин. К выделенному для получения РНК надосадочной жидкости добавляли 900 мкл реагента Qiazol. Очищенная РНК использовалась в качестве матрицы для синтеза кДНК с использованием олиго dT, случайных гексамеров и обратной транскриптазы III SuperScript в соответствии с протоколом производителя.
(Кассале и др. 2019)

Ультразвуковой лизис для иммунопреципитации хроматина

Иммунопреципитацию хроматина проводили по методике, описанной Менэ, с незначительными модификациями. Примерно 20 мг яичников от 0-1-суточных самок дикого типа гомогенизировали в 1 мл буфера NEB (10 мМ HEPES-Na при pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 мМ EGTA-Na при pH 8, 0,5 мМ EDTA-Na при pH 8, 1 мМ DTT, 0,5% NP-40, 0,5 мМ спермидина, 0,15 мМ спермина, 1× полного ингибитора протеазы без ЭДТА) с помощью гомогенизатора/иммерсионного диспергатора 1 мин (при 3000 об/мин). Гомогенат перекладывали на предварительно охлажденный стеклянный слой и наносили 15 полных ударов тугим пестиком. Затем свободные ядра центрифугировали при 6000xg в течение 10 мин при 4°C. Гранулы, содержащие ядра, ресуспендировали в 1 мл НЭБ и центрифугировали при 20000 × г в течение 20 мин на градиенте сахарозы (0,65 мл 1,6 М сахарозы в НЭБ, 0,35 мл 0,8 М сахарозы в НЭБ). Гранулу ресуспендировали в 1 мл NEB и формальдегида до конечной концентрации 1%. Ядра сшивали в течение 10 мин при комнатной температуре и гасили добавлением 1/10 об. 1,375 М глицина. Ядра собирали центрифугированием при 6000 × г в течение 5 мин. Ядра дважды промывали в 1 мл NEB и ресуспендировали в 1 мл буфера для лизиса (15 мМ HEPES-Na при pH 7,6, 140 мМ NaCl, 0,5 мМ EGTA, 1 мМ ЭДТА при pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 мМ DTT, 0,1% Na дезоксихолата, 0,1% SDS, 0,5% N-лауроилсаркозина и 1× полноценных ингибиторов протеазы без ЭДТА). Ядра обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового процессора Хильшера UP100H (100 Вт, 30 кГц) шесть раз по 20 с на льду и 1 мин на льду. Обработанные ультразвуком ядра центрифугировали при 13000 × g в течение 4 мин при 4°С. Большая часть обработанного ультразвуком хроматина имела длину от 500 до 1000 пар оснований (.н.). Для каждой иммунопреципитации инкубировали 15 мкг хроматина в присутствии 10 мкг моноклонального антитела HP1 9A9 (3 ч при 4°C во вращающемся колесе). Затем добавляли 50 мкл белка G и инкубацию продолжали в течение ночи при 4°C. Надосадочную жидкость отбрасывали, и образцы дважды промывали в Lysis Buffer (каждая промывка 15 мин при 4 °C) и дважды в TE Buffer (1 мМ ЭДТА, 10 мМ TrisHCl при pH 8). Хроматин вымывался из гранул в два этапа; сначала в 100 мкл Eluition Buffer 1 (10 мМ ЭДТА, 1% SDS, 50 мМ TrisHCl при pH 8) при 65°C в течение 15 мин с последующим центрифугированием и восстановлением надосадочной жидкости. Материал гранул повторно экстрагировали в 100 мкл TE + 0,67% SDS. Комбинированный элюат (200 мкл) инкубировали в течение ночи при 65°С до обратных сшивок и обрабатывали 50 мкг/мл РНКазы в течение 15 мин при 65°С и 500 мкг/мл протеиназы К в течение 3 ч при 65°С. Образцы экстрагировали фенол-хлороформом и осаждали этанол. ДНК ресуспендировали в 25 μл воды. Для максимизации молекулярного анализа с иммунопреципитацией ДНК гены-кандидаты амплифицировались попарно с помощью оптимизированного протокола дуплексной ПЦР с использованием двух разных наборов праймеров с одинаковыми температурами плавления в одной реакции.
(Касале и др. 2019)
 

Высокопроизводительные ультразвуковые клеточные разрушители для биологических образцов

Hielscher Ultrasonics — ваш многолетний опытный партнер, когда речь идет о высокопроизводительных ультразвуковых аппаратах для разрушения клеток, лизиса, экстракции белка, фрагментации ДНК, РНК и хроматина, а также для других этапов преаналитической подготовки образцов. Предлагая широкий ассортимент ультразвуковых лабораторных гомогенизаторов и устройств для подготовки образцов, Hielscher предлагает идеальное ультразвуковое устройство для вашего биологического применения и требований.
Классический ультразвуковой аппарат зондового типа с микронаконечником, таким как УП200Ст (200 Вт; см. рисунок слева) или один из ультразвуковых блоков пробоподготовки VialTweeter или UP200St_TD_CupHorn с VialHolder являются любимыми моделями в исследовательских и аналитических лабораториях. Классический ультразвуковой зонд идеально подходит для подготовки меньшего количества образцов, которые необходимо лизировать, экстрагировать или фрагментировать. Блоки подготовки образцов VialTweeter и UP200St_TD_CupHorn позволяют одновременно производить ультразвук до 10 или 5 флаконов соответственно.
Если необходимо обрабатывать большое количество образцов (например, 96-луночные планшеты, микротитровальные планшеты и т. д.), UIP400MTP является идеальной установкой для ультразвуковой обработки. UIP400MTP функционирует как большой горн, который наполнен водой и имеет достаточно места для хранения микролуночных пластин. Работающий от мощного ультразвукового процессора мощностью 400 Вт, UIP400MTP обеспечивает очень равномерную и интенсивную ультразвуковую обработку многолуночных планшетов с целью разрушения клеток, лизирования образцов, солюбилизации гранул, извлечения белков или сдвига ДНК.

Точное управление с помощью интеллектуального программного обеспечения

Все ультразвуковые решения Hielscher мощностью от 200 Вт и выше оснащены цифровым цветным сенсорным экраном и интеллектуальным программным обеспечением. Благодаря интеллектуальному протоколу передачи данных все параметры ультразвукового процесса автоматически сохраняются в формате CSV на встроенной SD-карте сразу после запуска ультразвукового аппарата. Это делает исследования и протоколы намного более удобными. После испытаний ультразвука или подготовки образцов вы можете просто просмотреть параметры ультразвука каждого прогона ультразвука и сравнить их.
С помощью интуитивно понятного меню можно предварительно задать множество параметров перед ультразвуковой обработкой: например, для контроля температуры в образце и предотвращения его термического ухудшения можно установить верхний предел температуры образца. Вставной датчик температуры, который поставляется в комплекте с ультразвуковым блоком, дает ультразвуковому процессору обратную связь о фактической температуре ультразвука. При достижении верхнего температурного предела ультразвуковой аппарат делает паузу до тех пор, пока не будет достигнут нижний предел установленного ∆Тл, и затем снова начинает автоматическое ультразвуковое измерение.
Если требуется ультразвуковая обработка с определенным входом энергии, можно заранее установить окончательную ультразвуковую энергию прогона ультразвука. Конечно, ультразвуковая пульсация и режим цикла также могут быть настроены индивидуально.
Чтобы повторно использовать наиболее удачные параметры созвучия, вы можете сохранить различные режимы обработки звуком (например, время обработки звука, интенсивность, режим цикла и т. д.) в качестве предварительно установленных режимов, чтобы их можно было легко и быстро запустить снова.
Для большего удобства работы всеми цифровыми ультразвуковыми установками можно управлять с помощью дистанционного управления браузером в любом распространенном браузере (например, InternetExplorer, Safari, Chrome и т. д.). Подключение к локальной сети представляет собой простую настройку plug-n-play и не требует установки дополнительного программного обеспечения.
Мы в Hielscher знаем, что успешная ультразвуковая обработка биологических образцов требует точности и повторяемости. Поэтому мы разработали наши ультразвуковые аппараты как интеллектуальные устройства со всеми функциями, обеспечивающими эффективную, надежную, воспроизводимую и удобную подготовку образцов.

В таблице ниже приведена приблизительная производительность наших ультразвуковых систем от ультразвуковых микронаконечников и классических ультразвуковых гомогенизаторов до ультразвуковых аппаратов MultiSample для удобной и надежной подготовки многочисленных образцов: