Ультразвуковой лизис образцов Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster широко используется в лабораториях в качестве модельного организма. Поэтому часто приходится выполнять такие этапы преаналитической подготовки образцов Drosophila melanogaster, как лизис, разрушение клеток, экстракция белков и фрагментация ДНК под действием сдвига. Ультразвуковые дезинтеграторы надежны и эффективны и позволяют легко выполнять различные задачи, такие как лизис, экстракция белков или фрагментация ДНК, лишь регулируя параметры ультразвукового процесса. Таким образом, ультразвуковые гомогенизаторы являются универсальными инструментами с широким спектром применения.

Ультразвуковой лизис и экстракция белков

Лизис, солюбилизация клеток, гомогенизация тканей и экстракция белков – типичные задачи для ультразвуковых дезинтеграторов в биологических лабораториях. Ультразвуковые дезинтеграторы и устройства для разрушения клеток хорошо подходят для гомогенизации тканей животных, насекомых (например, Drosophila melanogaster, C. elegans) или растительных образцов. Другие области применения обработки ультразвуком включают лизис клеточных суспензий и осадков, а также экстракцию внутриклеточных белков.
Ультразвуковой лизис и экстракция белков – высоконадежные и воспроизводимые процессы, которые можно проводить на основе установленных протоколов. Поскольку интенсивность ультразвукового процесса можно точно регулировать с помощью таких параметров обработки ультразвуком, как амплитуда, циклический / импульсный режим, температура и объем образца, однажды проверенные протоколы можно многократно повторять с одним и тем же результатом.

Ультразвуковая фрагментация ДНК и РНК

После лизиса клеток и экстракции белков часто необходимым этапом подготовки образцов является разрушение под действием сдвига и фрагментация ДНК, РНК и хроматина, например перед иммунопреципитацией хроматина (ChIP). Фрагментацию ДНК и РНК можно надежно осуществлять путем разрыва ковалентных связей, удерживающих ДНК вместе, под действием физических сил. При использовании физического сдвига, например при обработке ультразвуком, сначала разрываются цепи ДНК, затем ДНК фрагментируется на более мелкие участки.
Ультразвуковая фрагментация ДНК надежна и эффективна для получения фрагментов ДНК заданной длины под действием сдвига, например 500bp (пар оснований). Основные преимущества ультразвуковой фрагментации ДНК включают точный контроль параметров и интенсивности ультразвукового процесса. Параметры ультразвукового процесса можно регулировать, точно настраивая интенсивность, циклы и время обработки ультразвуком. Это позволяет получать ДНК желаемого размера, причем заданную длину ДНК можно надежно получать и воспроизводить. Ультразвуковая фрагментация ДНК под действием сдвига также идеально подходит для получения фрагментов ДНК с высокой молекулярной массой.

Протоколы ультразвукового лизиса Drosophila melanogaster

Ниже представлены различные протоколы лизиса, экстракции белков и фрагментации ДНК или хроматина образцов Drosophila с помощью ультразвука.

Ультразвуковой лизис для анализа методом иммунопреципитации со сшиванием (CLIP)

Анализ CLIP проводили согласно ранее описанной методике с некоторыми модификациями. Примерно 20 mg яичников самок дикого типа в возрасте от 0 до 1 дня подвергали сшиванию УФ-излучением (3 × 2000 μJ/cm2), гомогенизировали на льду в 1 mL буфера RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM сахарозы, 1 mM DTT, 1× ингибиторы протеаз Complete без EDTA, 1 mM PMSF) с добавлением 300 U RNAseOUT и помещали на лед на 30 min. Гомогенат обрабатывали ультразвуком на льду при мощности 80% пятью импульсами по 20 s с паузами по 60 s между ними с использованием ультразвукового процессора Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) и центрифугировали (16 000 × g в течение 5 min при 4°C). Растворимый экстракт предварительно очищали с помощью 20 μl гранул Protein-G dynabeads в течение 20 min при 4°C. После отбора образцов для иммуноблоттинга и количественного определения исходной РНК (1%) HP1 иммунопреципитировали из 450 μl предварительно очищенного экстракта с помощью антитела anti-HP1 9A9 путем инкубации в течение 4 h с 50 μl гранул Protein-G dynabeads. Иммунопреципитаты промывали 4 раза буфером RCB. Для элюирования иммунопреципитированных РНК осажденные гранулы кипятили в 100 μL воды UltraPure, обработанной DEPC, в течение 5 min. К супернатанту, собранному для выделения РНК, добавляли 900 μL реагента Qiazol. Очищенную РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК с использованием олиго-dT, случайных гексамеров и обратной транскриптазы SuperScript III согласно протоколу производителя.
(Cassale et al. 2019)

Ультразвуковой лизис для анализа методом иммунопреципитации хроматина

Иммунопреципитацию хроматина проводили по методу, описанному Menet, с небольшими модификациями. Примерно 20 mg яичников самок дикого типа в возрасте от 0 до 1 дня гомогенизировали в 1 mL буфера NEB (10 mM HEPES-Na при pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na при pH 8, 0,5 mM EDTA-Na при pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM спермидина, 0,15 mM спермина, 1× ингибиторы протеаз Complete без EDTA) с помощью гомогенизатора / погружного диспергатора в течение 1 min (при 3000 rpm). Гомогенат переносили в предварительно охлажденный стеклянный гомогенизатор Даунса и выполняли 15 полных ходов плотно прилегающим пестиком. Затем свободные ядра центрифугировали при 6000xg в течение 10 min при 4°C. Осадки, содержащие ядра, ресуспендировали в 1 mL NEB и центрифугировали при 20 000 × g в течение 20 min в градиенте сахарозы (0,65 mL 1,6 M сахарозы в NEB, 0,35 mL 0,8 M сахарозы в NEB). Осадок ресуспендировали в 1 mL NEB с формальдегидом до конечной концентрации 1%. Ядра подвергали сшиванию в течение 10 min при комнатной температуре, после чего реакцию прекращали добавлением 1/10 объема 1,375 M глицина. Ядра собирали центрифугированием при 6000 × g в течение 5 min. Ядра дважды промывали в 1 mL NEB и ресуспендировали в 1 mL буфера для лизиса (15 mM HEPES-Na при pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA при pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% дезоксихолата Na, 0,1% SDS, 0,5% N-лауроилсаркозина и 1× ингибиторы протеаз Complete без EDTA). Ядра обрабатывали ультразвуком с использованием ультразвукового процессора Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) шестью циклами по 20 s обработки и 1 min на льду. Обработанные ультразвуком ядра центрифугировали при 13 000 × g в течение 4 min при 4°C. Большая часть обработанного ультразвуком хроматина имела длину от 500 до 1000 пар оснований (bp). Для каждой иммунопреципитации 15 μg хроматина инкубировали в присутствии 10 μg моноклонального антитела HP1 9A9 (3 h при 4°C на вращающемся колесе). Затем добавляли 50 μl гранул dynabeads protein G и продолжали инкубацию в течение ночи при 4°C. Супернатанты удаляли, а образцы дважды промывали в буфере для лизиса (каждое промывание – 15 min при 4 °C) и дважды в буфере TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl при pH 8). Хроматин элюировали с гранул в два этапа: сначала в 100 μl буфера для элюирования 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl при pH 8) при 65°C в течение 15 min, после чего проводили центрифугирование и собирали супернатант. Материал гранул повторно экстрагировали в 100 μl TE + 0,67% SDS. Объединенный элюат (200 μl) инкубировали в течение ночи при 65°C для устранения поперечных сшивок и обрабатывали 50 μg/ml RNaseA в течение 15 min при 65°C и 500 μg/ml протеиназы K в течение 3 h при 65°C. Образцы экстрагировали фенолом–хлороформом и осаждали этанолом. ДНК ресуспендировали в 25 μl воды. Для максимально полного молекулярного анализа иммунопреципитированной ДНК гены-кандидаты амплифицировали попарно по оптимизированному протоколу дуплексной ПЦР, используя в одной реакции два разных набора праймеров с близкими температурами плавления.
(Casale et al. 2019)
 

Высокопроизводительные ультразвуковые устройства для разрушения клеток в биологических образцах

Hielscher Ultrasonics – ваш партнер с многолетним опытом в области высокопроизводительных ультразвуковых аппаратов для разрушения клеток, лизиса, экстракции белков, фрагментации ДНК, РНК и хроматина, а также других этапов преаналитической подготовки образцов. Предлагая обширный ассортимент ультразвуковых лабораторных гомогенизаторов и устройств для подготовки образцов, Hielscher располагает идеальным ультразвуковым устройством для ваших биологических задач и требований.
Классический ультразвуковой аппарат зондового типа с микронаконечником, такой как UP200St (200W; см. изображение слева), или одно из ультразвуковых устройств для подготовки образцов VialTweeter или UP200ST_TD_CupHorn с VialHolder – популярные модели в исследовательских и аналитических лабораториях. Классический ультразвуковой зонд идеально подходит, когда необходимо провести лизис, экстракцию или фрагментацию небольшого числа образцов. Устройства для подготовки образцов VialTweeter и UP200St_TD_CupHorn позволяют одновременно обрабатывать ультразвуком до 10 или 5 флаконов соответственно.
Если требуется обработать большое количество образцов (например, 96-луночные планшеты, микротитровальные планшеты и т. д.), то UIP400MTP является идеальной установкой для обработки ультразвуком. UIP400MTP работает как увеличенный CupHorn, который заполняется водой и имеет достаточно места для размещения планшетов с микролунками. Благодаря мощному ультразвуковому процессору на 400 ватт UIP400MTP обеспечивает очень равномерную и интенсивную обработку многолуночных планшетов ультразвуком для разрушения клеток, лизиса образцов, солюбилизации осадков, экстракции белков или фрагментации ДНК под действием сдвига.

Точный контроль с помощью интеллектуального программного обеспечения

Все решения Hielscher для обработки ультразвуком мощностью от 200 ватт оснащены цифровым цветным сенсорным экраном и интеллектуальным программным обеспечением. Благодаря интеллектуальному протоколированию данных все параметры ультразвукового процесса автоматически сохраняются в виде файла CSV на встроенной SD-карте сразу после запуска ультразвукового аппарата. Это делает исследования и протоколирование гораздо удобнее. После испытаний обработки ультразвуком или подготовки образцов вы можете легко просмотреть параметры каждого сеанса обработки ультразвуком и сравнить их.
С помощью интуитивно понятного меню можно заранее задать множество параметров обработки ультразвуком: например, для контроля температуры образца и предотвращения его термического разложения можно установить верхний предел температуры образца. Подключаемый датчик температуры, входящий в комплект ультразвукового устройства, передает ультразвуковому процессору данные о фактической температуре обработки ультразвуком. При достижении верхнего предела температуры ультразвуковое устройство приостанавливает работу до достижения нижней границы заданного ∆T, после чего автоматически возобновляет обработку ультразвуком.
Если требуется обработка ультразвуком с определенным количеством вводимой энергии, вы можете заранее задать итоговое количество ультразвуковой энергии для сеанса обработки. Разумеется, ультразвуковую пульсацию и циклический режим также можно настраивать индивидуально.
Для повторного использования наиболее успешных параметров обработки ультразвуком вы можете сохранять различные режимы обработки (например, время обработки ультразвуком, интенсивность, циклический режим и т. д.) в качестве предустановленных режимов, чтобы легко и быстро запускать их снова.
Для большего удобства работы всеми цифровыми ультразвуковыми устройствами можно управлять дистанционно через любой распространенный браузер (например, InternetExplorer, Safari, Chrome и т. д.). Подключение к LAN выполняется по простому принципу plug-n-play и не требует установки дополнительного программного обеспечения.
В Hielscher мы знаем, что успешная обработка биологических образцов ультразвуком требует точности и повторяемости. Поэтому мы разработали наши ультразвуковые аппараты как интеллектуальные устройства со всеми функциями, обеспечивающими эффективную, надежную, воспроизводимую и удобную подготовку образцов.

Приведенная ниже таблица дает представление о приблизительной производительности наших ультразвуковых систем – от ультразвуковых микронаконечников и классических ультразвуковых гомогенизаторов до ультразвуковых аппаратов MultiSample для удобной и надежной подготовки большого количества образцов: