Ультразвуковая технология Хильшера

Ультразвуковой лизис E. Coli

  • Бактерии E. coli являются наиболее часто используемыми бактериями в микробиологии и биотехнологии.
  • Ультразвуковые клеточные разрушители обеспечивают надежные и воспроизводимые результаты для лизиса E. coli.
  • Интенсивные, но точно контролируемые кавитационные и сдвиговые силы приводят к полному разрушению и высоким выходам экстракции (например, белкам, ДНК).

Повреждение клеток кавитацией

Бактерии Escherichia coli надежно лизируются с использованием ультразвуковых тканевых гомогенизаторов.Ультразвуковые зондирующие гомогенизаторы работают прибл. 20 000 циклов в секунду (при 20 кГц) и вызывают кавитацию в жидкостях или суппозициях. Акустические кавитационные микроскопические области вакуум-подобных давлений и высоких температур, которые разрывают клетки друг от друга. Хотя температура может достигать нескольких тысяч градусов Цельсия, объемы кавитации настолько малы, что они не нагревают процесс значительно. Ультразвук генерирует акустическую кавитацию и сдвиговые силы, перфорирующие или разрушающие клеточную мембрану E.coli – в зависимости от настройки устройства ультразвукового гомогенизатора.

Преимущества ультразвукового лизиса

  • точный контроль лизиса (интенсивность, амплитуда, температура)
  • оптимальная адаптация к конкретным образцам
  • контроль температуры
  • для очень маленьких и очень больших образцов (мкл до литров)
  • чисто механическая обработка
  • линейное масштабирование от лаборатории к производству
Ультразвуковое устройство VialTweeter допускает одновременную подготовку проб до 10 флаконов в тех же условиях. (Нажмите, чтобы увеличить!)

VialTweeter для ультразвукового лизиса

Запрос информации




Обратите внимание на наши политика конфиденциальности,


Хотя химический и ферментативный лизис может быть проблематичным – поскольку химический лизис может изменять структуры белка и вводить проблемы очистки, а ферментативный лизис требует длительных инкубационных периодов и не воспроизводится – Ультразвуковое разрушение является сложным быстрым методом разрушения клеток.
Ультразвуковой изизоза основан только на механических силах. Никакие химикаты добавлены, sonication ломает стенку клетки усилием сдвига. Химический лисис может изменить структуру белка и ввести проблемы очистки. ферментативные нарушения требуют длительного инкубации времени и не воспроизводимы.

Общие рекомендации

Ультразвуковая машина UP400St с проточным реакторомУльтразвук является наиболее популярным методом лизирования очень малых, средних и больших количеств клеточных суспензий – от пико-литров до 100 л / ч (с использованием ультразвуковой проточной ячейки). Клетки лизируются жидкостным сдвигом и кавитацией. ДНК также подвергается стрижке во время обработки ультразвуком, поэтому нет необходимости добавлять ДНКазу в клеточную суспензию.
Контроль температуры:
Предварительным охлаждением образца и хранением образца во время обработки ультразвуком на льду можно легко предотвратить термическое разложение образца образца.
В идеале, образцы должны храниться ледяной во время лиза, но для большинства образцов этого достаточно, если температура не поднимается выше температуры культуры или источника ткани. Поэтому рекомендуется держать подвеску на льду и совмещеть с несколькими короткими ультразвуковыми импульсами 5-10 сек и паузами 10-30 сек. Во время пауз тепло может рассеиваться, чтобы восстановить низкую температуру. Для больших образцов клеток доступны различные реакторы клеток потока с охлаждающими куртками.

Протоколы подготовки лизатов E. Coli

Анализ экспрессии и очистка рекомбинантного белка

Осадок E. coli подвергали ультразвуковой обработке ультразвуковой системой UP100H (Хильшер). С этой целью клеточный осадок ресуспендировали в охлажденном буфере для лизиса (50 мМ Tris-HCl pH = 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF) и охлаждали на льду в течение 10 мин. Затем клеточную суспензию обрабатывали ультразвуком с 10 короткими всплесками 10 с с последующим интервалом 30 с для охлаждения. Наконец, клеточный дебрис удаляли ультрацентрифугированием при 4 ° С в течение 15 мин при 14000 об / мин. Для подтверждения экспрессии rPR супернатант проводили на 12% полиакриламидном геле и анализировали с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга. Очистку rPR проводили с использованием Ni2 евро-NTA (Invitrogen, США) в соответствии с руководством производителя. На этом этапе использовали метод местной очистки. Чистоту очищенного белка оценивали с использованием электрофореза на 12% полиакриламидном геле и последующем окрашивании Кумасси синим. Концентрацию очищенного белка измеряли с помощью набора для анализа белка Micro BCA (PIERCE, США). (Azarnezhad et al., 2016)

Ультразвуковой клеточный разрушитель UP100H (100 Вт) для лизиса, разрушения клеток и разрушения ДНК.

Ультразвуковые гомогенизаторы UP100H (100 Вт)

Рост клеток, сшивание и подготовка экстрактов клеток E. coli

Для SeqA и РНК-полимеразы ChIP-Chip E. coli MG1655 или MG1655 ΔseqA выращивали при 37 ° C до OD600 около 0,15 в 50 мл LB (+ 0,2% глюкозы) до добавления 27 мкл формальдегида (37%) на мл среды (конечная концентрация 1%). Сшивание проводили при медленном встряхивании (100 об / мин) при комнатной температуре в течение 20 мин с последующим гашением 10 мл 2,5 М глицина (конечная концентрация 0,5 М). Для экспериментов с тепловым шоком E. coli MG1655 выращивали в 65 мл среды LB при 30 ° C до OD600 около 0,3. Затем 30 мл культуры переносили в предварительно нагретую колбу при 43 ° С, а остаток поддерживали при 30 ° С. Сшивание и тушение были такими, как описано выше, за исключением того, что клетки выдерживали при 30 или 43 ° С в течение 5 мин перед дальнейшим медленным встряхиванием при комнатной температуре. Клетки собирали центрифугированием и дважды промывали холодным TBS (pH 7,5). После ресуспендирования в 1 мл буфера для лизиса (10 мМ Трис (рН 8,0), 20% сахарозы, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мг / мл лизоцима) и инкубации при 37 ° С в течение 30 мин с последующим добавлением 4 мл IP буфера, клетки обрабатывали ультразвуком на льду 12 раз 30 сек и 30 сек перерывами на UP400St ультразвуковой процессор (Hielscher Ultrasonics GmbH) со 100% -ной мощностью. После центрифугирования в течение 10 мин при 9000 г, 800 мкл аликвоты супернатанта хранили при -20 ° С. (Waldminghaus 2010)

Перепроизводство и очистка ферментов.

Для перепроизводства декастистидиновых (His10) -вязанных белков E. coli BL21 (DE3) трансформировали конструкциями pET19b. Прециркуляцию в течение ночи собирали центрифугированием, а 1% использовали для инокуляции культуры экспрессии. Клетки, несущие pET19mgtB, выращивали при 22 ° C до оптической плотности при 600 нм (OD600) 0,7. Культуру переносили до 17 ° С и индуцировали 100 мкМ IPTG. Через 16 часов культуру собирали центрифугированием при 7500 × g при 4 ° С. Клетки ресуспендировали в 50 мМ фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) с 0,3 М NaCl при рН 7,4 и разрушали ультразвуком с помощью сонотрода S2 с микроконцом UP200St ультразвуком (Hielscher, Teltow, Германия) в цикле 0,5 и амплитудой 75%.
Перепроизводство декастистидинового меченного GtfC индуцировали при 37 ° С при OD600 0,6 при 100 мкМ IPTG. Затем клетки инкубировали в течение 4 ч, собирали и лизировали, как указано выше для MgtB.
Экстракты из сырой клетки центрифугировали при 15000 × g и 4 ° C для осаждения клеточного дебриса. Осветленные экстракты загружали на 1 мл колонны HisTrap FF Crude с использованием системы ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Ферменты очищали в соответствии с протоколом производителя для градиентного элюирования His-меченых белков. Элюированные белковые растворы дважды диализовали против 1000 объемов 50 мМ PBS, pH 7,4, 0,3 М NaCl при 4 ° С. Очистку анализировали с помощью 12% SDS-PAGE. Концентрацию белка определяли методом Брэдфорда с использованием Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия). (Rabausch et al., 2013)

Экстракция белка из бактерий E. coli
Интересный белок-приманка (в данном случае MTV1 Arabidopsis thaliana) слит с тегом GST и экспрессируется в клетках BL21 Escherichia coli (E. coli).
1. Возьмите одну таблетку GST-MTV1 и GST (соответствующую 50 мл бактериальной культуры) и ресуспендируйте каждый в 2,5 мл ледяного экстракционного буфера.
2. Используйте ультразвуковой UP100H (с микротип-сонотродом MS3 для небольших объемов (2-5 мл)), чтобы разрушить бактериальные клетки до тех пор, пока они не будут лизированы, что проявляется в сниженной непрозрачности и повышенной вязкости. Это необходимо проводить на льду, и рекомендуется проводить ультразвуковое исследование с интервалом (например, 10 сек. Ультразвуком, затем 10 сек на льду и т. Д.). Следует проявлять осторожность, чтобы не слишком громко звучать. Если вспенивание или образование белого осадка обнаружено, интенсивность должна быть снижена.
3. Перенесите раствор лизированных бактерий в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и центрифугируйте при 4 ° C, 16 000 × 20 минут.

Аллицин-модифицированные белки в кишечной палочке

VialTweeter - это удобный ультразвуковой аппарат для небольшой гомогенизации образцовОпределение содержания сульфгидрила с помощью анализа 5,5'-дитиобиса (2-нитробензойной кислоты) (DTNB)
Для того, чтобы инокулировать минимальную среду MOPS (1: 100), использовали культуру ночи MG1655 E. coli. Культуру выращивали аэробно до достижения A600 0,4. Культуру разделяли на три культуры по 15 мл для лечения стресса. Нелеченная культура служила отрицательным контролем. 0,79 мМ аллицина (128 мкг мл-1) или 1 мМ диамида добавляли к одной из оставшихся двух культур каждый. Культуры инкубировали в течение 15 мин. 5 мл каждой культуры собирали центрифугированием (8525 × g, 4 ° C, 10 мин). Клетки промывали дважды 1 мл PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2Po4, pH 7,4, предварительно анаэробно до использования) и центрифугировали (13000 × g, 4 ° C, 10 мин). Клетки ресуспендировали в буфере для лизиса (PBS с 6 мМ гуанидиновой HCl, pH 7,4) до разрушения при 4 ° С с помощью ультразвука (VialTweeter ультразвук, Hielscher GmbH, Германия) (3 × 1 мин). Осколки клеток осаждали путем центрифугирования (13000 × g, 4 ° C, 15 минут). Супернатант переносили в кювету QS-макроса емкостью 3,5 мл (10 мм) с магнитной мешалкой и смешивали с 1 мл буфера для лизиса. Вымирание образцов контролировалось при 412 нм с помощью спектрофотометра Jasco V-650, снабженного держателем ячейки с контролируемой температурой PSC-718 (Jasco) при комнатной температуре. Добавляли 100 мкл раствора 3 мМ дитиобиса (2-нитробензойной кислоты). Угасание контролировалось до тех пор, пока оно не достигло насыщения. Расчет концентрации тиола проводили с использованием коэффициента экстинкции ε412 Г. = 13 700 М-1 см-1 для тио-2-нитробензойной кислоты (TNB). Концентрации клеточного тиола рассчитывали на основе объема клеток E. coli 6,7 × 10-15 литр и плотность клеток A600 = 0,5 (эквивалентно 1 × 108 клетки мл-1 культура). (Müller et al., 2016)

Определение in vivo Glutathione

E.coli MG1655 выращивали в минимальной среде MOPS в общем объеме 200 мл до тех пор, пока А600 0,5. Культуру разделяли на 50 мл культур для лечения стресса. После 15 мин инкубации с 0,79 мМ аллицина, 1 мМ диамида или диметилсульфоксида (контроль) клетки собирали при 4000 г при 4 ° С в течение 10 мин. Клетки промывали дважды буфером KPE перед ресуспендированием гранул в 700 мкл буфера KPE. Для депротеирования добавляли 300 л 10% (мас. / Об.) Сульфосалициловой кислоты до разрушения клеток с помощью ультразвука (3 х 1 мин; VialTweeter ультразвуковой дезинтегратор). Супернатанты собирали после центрифугирования (30 мин, 13000 г, 4 ° С). Концентрации сульфосалициловой кислоты снижали до 1% путем добавления 3 объемов буфера KPE. Измерения общего глутатиона и GSSG проводили, как описано выше. Концентрации клеточного глутатиона рассчитывали на основе объема клеток E. coli 6,7×10 Лет-15 литр и плотность клеток A600 0.5 (эквивалентно 1×10 Лет8 клетки мл-1 культура). Концентрации GSH рассчитывали путем вычитания 2 [GSSG] из общего количества глутатиона. (Müller et al., 2016)

Ультразвуковой разрушитель для клеточного лизиса и экстракции биологического материала (Нажмите, чтобы увеличить!)

Ультразвуковой зонд UP400St

Экспрессия человеческого mAspAT в E. coli

Ультразвуковой клеточный разрушитель UP400St (400 Вт) для экстракции внутриклеточного вещества (например, белки, органеллы, ДНК, РНК и т. Д.),Единственная колония E. coli BL21 (DE3), содержащая вектор экспрессии в 30 мл среды Luria-Bertani (LB), содержащей 100 мкг / мл ампициллина, и затем культивируется при 37ºC до оптической плотности (OD600) достигла 0,6. Клетки собирали центрифугированием при 4000 × g в течение 10 мин и ресуспендировали в 3L свежей среде LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина.
Затем экспрессию белка индуцировали 1 мМ изопропил-β-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) в течение 20 ч при 16ºC. Клетки собирали центрифугированием при 8000 × g в течение 15 мин и промывали буфером А (20 мМ NaH2PO4, 0,5 М NaCl, pH 7,4). Приблизительные 45 г (сырого веса) клетки получали из культуры 3 л. После центрифугирования клеточные гранулы ресуспендировали в 40 мл (для 1 л культуры) ледяного экстракционного буфера А и лизировали путем ультразвуковой обработки при охлаждении на льду с использованием UP400St инструмент (Dr. Hielscher GmbH, Германия). Лизис клеток центрифугировали при 12000 об / мин в течение 15 мин для разделения растворимых (супернатантов) и осажденных (гранул) фракций. (Jiang et al., 2015)

В приведенной ниже таблице приведена приблизительная производительность наших ультразвуковых аппаратов:

Объем партии Скорость потока Рекомендуемые устройства
0.5 до 1,5 мл не доступно VialTweeter
От 1 до 500 мл От 10 до 200 мл / мин UP100H
От 10 до 2000 мл От 20 до 400 мл / мин Uf200 ः т, UP400St
0.1 до 20L 0.2 до 4L / мин UIP2000hdT
От 10 до 100 литров От 2 до 10 л / мин UIP4000
не доступно От 10 до 100 л / мин UIP16000
не доступно больше кластер UIP16000

Свяжитесь с нами! / Спросите нас!

Пожалуйста, используйте форму ниже, если вы хотите запросить дополнительную информацию о ультразвуковой гомогенизации. Мы будем рады предложить Вам ультразвуковые системы, отвечающей вашим требованиям.









Пожалуйста, обратите внимание на наши политика конфиденциальности,


Литература / Ссылки



Полезные сведения

Е. coli

Escherichia coli (E. coli) представляет собой грамотрицательную, факультативно анаэробную, стержнеобразную бактерию кишечной палочки рода Escherichia, которая обычно встречается в нижнем отделе теплокровных организмов (эндотермы). Существует большое количество штаммов E. coli (или подтипов) с различными характеристиками. Большинство штаммов E. coli безвредны для людей, например штаммы B и K-12, которые обычно используются для исследовательских применений в лабораториях. Однако некоторые штаммы вредны и могут вызвать серьезную болезнь.
E. coli играет важную роль в современной биологической инженерии и промышленной микробиологии, так как бактерии легко манипулировать. Общие лабораторные приложения, которые часто используют E. coli, например, для создания рекомбинантной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или для работы в качестве модельного организма.
E. coli является очень универсальным хозяином для производства гетерологичных белков, и существуют многоклеточные системы экспрессии белка для получения рекомбинантных белков в E. coli. Используя плазмиды, которые позволяют экспрессию белка высокого уровня, гены могут быть введены в бактерии, что позволяет производить такие белки в больших количествах в промышленных ферментационных процессах.
E.coli используются в качестве клеточных фабрик для производства инсулина. Дальнейшие применения включают использование модифицированных клеток E. coli для разработки и производства вакцин и иммобилизованных ферментов, для производства биотоплива, а также для биоремедиации.
Штамм K-12 представляет собой мутантную форму E. coli, которая чрезмерно экспрессирует фермент щелочной фосфатазы (ALP). Эта мутация происходит из-за дефекта гена, который постоянно кодирует фермент. Если ген продуцирует продукт без какого-либо ингибирования, он известен как конститутивная активность. Эта специфическая мутантная форма используется для выделения и очистки фермента ALP.

Ультразвуковая резка ДНК

Ультразвуковые силы сдвига являются широко используемым методом для отделения от клетки и разрушения нитей ДНК на куски. Акустическая кавитация разрушает клеточные стенки и мембраны для извлечения ДНК из клеток и генерирует фрагменты около 600 – 800 bp в длину, что идеально подходит для анализа.
Нажмите здесь, чтобы узнать больше об ультразвуковых гомогенизаторах для фрагментации ДНК!