Ультразвуковой лизис кишечной палочки
- Бактерии E. coli являются наиболее часто используемыми бактериями в микробиологии и биотехнологии.
- Ультразвуковые клеточные разрушители обеспечивают надежные и воспроизводимые результаты лизиса E. coli.
- Интенсивные, но точно контролируемые кавитационные и сдвиговые силы приводят к полному разрушению и высокому выходу экстракции (например, белков, ДНК).
Почему ультразвуковое разрушение клеток E. coli является предпочтительным методом?
Ультразвуковые гомогенизаторы или ультразвуковые аппараты зондового типа имеют ряд преимуществ для лизиза E. coli, поскольку интенсивный ультразвук эффективно разрушает клеточные стенки и мембраны. Ультразвуковые аппараты зондового типа широко используются для лизиса кишечной палочки по следующим причинам:
Экстракция белка из клеток E.coli эффективно проводится с помощью ультразвуковой щуп УП200Ст
Ультразвуковой аппарат зондового типа имеет множество преимуществ для лизиса E. coli. Надежный и точный контроль параметров ультразвукового процесса позволяет оптимизировать рабочие параметры, такие как мощность, продолжительность и работа с образцом, для достижения желаемых результатов.
Электрофоретический анализ геномной ДНК E. coli EDL933, подвергнутой ультразвуковой обработке продолжительностью 0 – 15 минут. L указывает на лестницу ДНК.
(исследование и изображение: ©Basselet et al. 2008)
Разрушение клеток с помощью ультразвуковой кавитации
Ультразвуковые зондовые гомогенизаторы работают со скоростью около 20 000 циклов в секунду (при частоте 20 кГц) и вызывают кавитацию в жидкостях или суспензиях. Акустическая кавитация: микроскопические области вакуумного давления и высоких температур, которые разрывают клетки на части. Хотя температура может достигать нескольких тысяч градусов по Цельсию, объемы кавитации настолько малы, что не нагревают процесс значительно. Акустическая кавитация и силы сдвига, создаваемые ультразвуком, проникают или разрушают клеточную мембрану бактериальных клеток, таких как кишечная палочка. Ультразвуковые аппараты Hielscher позволяют точно контролировать параметры процесса, такие как интенсивность ультразвука, амплитуда, подвод энергии и температура. Таким образом, процесс ультразвукового лизиса может быть оптимально скорректирован в соответствии с типом клетки, клеточной культурой и целью процесса.
- точный контроль лизиса (интенсивность, амплитуда, температура)
- надежные, воспроизводимые результаты
- Оптимальная адаптация к конкретным образцам
- Контроль температуры
- для очень маленьких и очень больших образцов (μL в литры)
- Чисто механическая обработка
- удобная и безопасная эксплуатация
- Линейное масштабирование от лаборатории до производства
VialTweeter для ультразвукового лизиса
Ультразвуковой гомогенизатор в сравнении с другими методами лизиса
В то время как химический и ферментативный лизис может быть проблематичным – Поскольку химический лизис может изменить структуру белка и вызвать проблемы с очисткой, ферментативный лизис требует длительного времени инкубации и не воспроизводим – Ультразвуковое разрушение — это сложный, быстрый метод разрушения клеток.
Ультразвуковой лизис основан только на механических силах. Не добавляются химические вещества, ультразвук разрушает клеточную стенку под действием сил сдвига. Химический лизис может изменить структуру белка и вызвать проблемы с очисткой. Ферментативное разрушение требует длительного времени инкубации и не воспроизводимо. Ультразвуковое разрушение клеток бактерий E.coli является быстрым, простым, надежным и воспроизводимым. Именно поэтому ультразвуковые аппараты Hielscher используются в биологических и биохимических лабораториях по всему миру для подготовки образцов, предварительной аналитики, диагонтики in vitro и многообразных анализов.
Общие рекомендации по ультразвуковому лизису
Ультразвуковая обработка является наиболее популярным методом лизиса очень малых, средних и больших количеств клеточных суспензий – от пиколитров до 100л/час (с использованием ультразвуковой проточной ячейки). Клетки лизируются путем сдвига жидкости и кавитации. ДНК также сдвигается во время ультразвуковой обработки, поэтому добавлять ДНКазу в клеточную суспензию не нужно.
Контроль температуры при ультразвуковом лизисе E.coli
Благодаря предварительному охлаждению образца и удержанию образца на льду во время ультразвуковой обработки можно легко предотвратить термическую деградацию образца.
В идеале образцы должны храниться в ледяном холоде во время лизиса, но для большинства образцов достаточно, чтобы температура не поднималась выше температуры культуры или источника ткани. Поэтому рекомендуется держать суспензию на льду и проводить ультразвуковую обработку несколькими короткими ультразвуковыми импульсами по 5-10 сек и паузами по 10-30 сек. Во время пауз тепло может рассеиваться, чтобы восстановить низкую температуру. Для более крупных образцов ячеек доступны различные проточные реакторы с охлаждающими рубашками.
Читайте здесь подробные советы и рекомендации для успешного проведения ультразвукового лизиса!
Протоколы ультразвукового приготовления лизатов кишечной палочки
Исследователи используют ультразвуковые гомогенизаторы Hielscher для разрушения клеток E.coli. Ниже вы можете ознакомиться с различными проверенными и проверенными протоколами лизиса E.coli с использованием ультразвуковых гомогенизаторов Hielscher для различных применений, связанных с E. coli.
Рост клеток, сшивание и получение экстрактов клеток кишечной палочки с помощью ультразвука
Для SeqA и РНК-полимеразы ChIP-Chip E. coli MG1655 или MG1655 ΔseqA выращивали при 37°C до OD600 около 0,15 в 50 мл LB (+ 0,2% глюкозы) перед добавлением 27 мкл формальдегида (37%) на мл среды (конечная концентрация 1%). Сшивание проводили при медленном встряхивании (100 об/мин) при комнатной температуре в течение 20 мин с последующим закаливанием 10 мл 2,5 М глицина (конечная концентрация 0,5 М). Для экспериментов с тепловым шоком E. coli MG1655 выращивали в среде объемом 65 мл LB при 30°C до OD600 около 0,3. Впоследствии 30 мл культуры переносили в предварительно подогретую колбу при 43°С, а оставшуюся часть хранили при 30°С. Сшивание и гашение происходили так, как описано выше, за исключением того, что элементы выдерживали при температуре 30 или 43°С в течение 5 мин перед дальнейшим медленным встряхиванием при комнатной температуре. Клетки собирали центрифугированием и дважды промывали холодным TBS (pH7,5). После ресуспендирования в 1 мл лизисисного буфера (10 мМ Трис (pH 8,0), 20% сахарозы, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мг/мл лизоцима) и инкубации при 37°C в течение 30 мин с последующим добавлением 4 мл IP-буфера, клетки подвергали ультразвуковой обработке на льду с перерывами 12 раз по 30 сек и 30 сек с использованием ультразвукового процессора Hielscher UP400St при 100% мощности. После центрифугирования в течение 10 мин при 9000 г 800 мкл аликвот надосадочной жидкости хранили при -20°С. (Вальдмингхаус 2010)
Перепроизводство и очистка ферментов с помощью ультразвукового зонда
Для гиперпродукции белков, меченных декагистидином (His10), E. coli BL21(DE3) трансформировали с помощью конструкций pET19b. За ночь прекультуру собирали центрифугированием, а 1% использовали для инокуляции экспрессионной культуры. Клетки, несущие pET19mgtB, выращивали при 22°C до оптической плотности на длине волны 600 нм (OD600) 0,7. Культуру переносили при 17°C и индуцировали 100 мкМ IPTG. Через 16 ч культуру собирали методом центрифугирования при 7500 × г при 4°С. Клетки ресуспендировали в 50 мМ фосфатно-солевом буфере (PBS) с 0,3 М NaCl при pH 7,4 и разрушали ультразвуком с микрозонатором S2 на ультразвуковом аппарате Hielscher UP200St с циклом 0,5 и амплитудой 75%.
Перепроизводство меченного декагистидином GtfC индуцировали при 37°C при наружном диаметре600 0,6 при 100 мкМ IPTG. Затем клетки инкубировали в течение 4 ч, собирали и лизировали, как указано выше для MgtB.
Экстракты сырых клеток центрифугировали при 15 000 × г и 4°C для осаждения клеточного мусора. Осветленные экстракты загружали в колонны HisTrap FF Crude объемом 1 мл с использованием системы ÄKTAprime Plus. Ферменты очищали в соответствии с протоколом производителя по градиентному элюированию His-меченых белков. Растворы элютированных белков дважды диализовали в сравнении с 1000 объемами 50 мМ PBS, pH 7,4, с 0,3 M NaCl при 4°C. Очистка была проанализирована по 12% SDS-PAGE. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда с использованием Роти-Кванта. (Рабауш и др. 2013)
Ультразвуковая экстракция белка из бактерий E. coli
Представляющий интерес белок-приманка (в данном случае MTV1 Arabidopsis thaliana) сливается с меткой GST и экспрессируется в клетках BL21 Escherichia coli (E. coli).
- Возьмите по одной грануле GST-MTV1 и GST (что соответствует 50 мл бактериальной культуры) и повторно суспендируйте каждую в 2,5 мл ледяного экстракционного буфера.
- Используйте ультразвуковой аппарат UP100H (оснащенный микронаконечником-сонотродом MS3 для небольших объемов около 2-5 мл) для разрушения бактериальных клеток до тех пор, пока они не лизируются, что проявляется в снижении помутнения и повышенной вязкости. Это необходимо проводить на льду, и рекомендуется проводить ультразвуковую обработку с интервалами (например, 10 секунд обработки ультразвуком, затем 10-секундная пауза на льду и так далее). Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не проводить ультразвуковую обработку со слишком высокой интенсивностью. При обнаружении пенообразования или образования белого осадка интенсивность нужно понизить.
- Перелейте раствор лизированных бактерий в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируйте при температуре 4°C, 16 000 x g в течение 20 минут.
Ультразвуковые аппараты зондового типа, такие как UP400St использовать принцип работы акустической кавитации для эффективного лизиса кишечной палочки.
Анализ экспрессии и очистка рекомбинантного белка с помощью ультразвуковой обработки
Гранулы кишечной палочки обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового аппарата Hielscher UP100H. С этой целью клеточную гранулу ресуспендировали в охлажденном буфере для лизиса (50 мМ Tris-HCl pH=7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ DTT, 1 мМ PMSF) и охлаждали на льду в течение 10 мин. Затем суспензию клеток обрабатывали ультразвуком с 10 короткими всплесками по 10 с с последующим интервалом в 30 с для охлаждения. Наконец, клеточный мусор удаляли ультрацентрифугированием при 4°C в течение 15 мин при 14000 об/мин. Для подтверждения экспрессии rPR надосадочную жидкость наносили на 12% полиакриламидный гель и анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Очистку rPR проводили с помощью смолы Ni2+-NTA (Invitrogen, США) в соответствии с руководством производителя. На этом этапе использовался нативный метод очистки. Чистоту очищенного белка оценивали с помощью электрофореза на 12% полиакриламидном геле и последующего окрашивания в синий цвет Кумасси. Концентрацию очищенного белка измеряли с помощью набора для анализа белка Micro BCA (PIERCE, США). (Azarnezhad et al. 2016)
Ультразвуковые гомогенизаторы для лизиса E. coli
Hielscher Ultrasonics разрабатывает, производит и поставляет высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы для надежного и эффективного лизиса бактерий E. coli и других типов клеток, тканей и клеточных культур.
Широкий ассортимент ультразвуковых датчиков, а также систем непрямой ультразвуковой обработки позволяет нам предложить вам идеальный ультразвуковой гомогенизатор тканей для разрушения клеток и экстракции.
Проектирование, производство и консалтинг – Качество «Сделано в Германии»
Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Интеллектуальное программное обеспечение, интуитивно понятное меню, программируемые настройки и автоматическое протоколирование данных — это лишь некоторые из особенностей ультразвуковых аппаратов Hielscher. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в исследовательские и биотехнологические установки. Даже в суровых условиях и сложных условиях окружающей среды ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с ними.
Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.
В таблице ниже приведена примерная производительность обработки наших ультразвуковых аппаратов:
| Объем партии | Расход | Рекомендуемые устройства |
|---|---|---|
| Многолуночные / микротитровальные планшеты | н.а. | UIP400MTP |
| CupHorn для флаконов или стакана | н.а. | Ультразвуковой чашечный рожок |
| Ультразвуковой микропоточный реактор | н.а. | ГДмини2 |
| до 10 флаконов объемом от 0,5 до 1,5 мл | н.а. | VialTweeter |
| 0от 0,5 до 1,5 мл | н.а. | VialTweeter |
| от 1 до 500 мл | От 10 до 200 мл/мин | УП100Ч |
| от 10 до 2000 мл | от 20 до 400 мл/мин | УП200Хт, УП400Ст |
| 0.1 до 20 л | 0от 0,2 до 4 л/мин | УИП2000HDT |
| От 10 до 100 л | От 2 до 10 л/мин | UIP4000 |
| н.а. | От 10 до 100 л/мин | UIP16000 |
| н.а. | больше | Кластер UIP16000 |
Свяжитесь с нами! / Спросите нас!
Дополнительные протоколы ультразвукового лизиса E. coli
Аллицин-модифицированные белки в E. coli с помощью ультразвукового флакона Tweeter
Определение содержания сульфгидрилов методом анализа 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) (DTNB)
Ночная культура E. coli MG1655 была использована для инокуляции минимальной среды MOPS (1:100). Культуру выращивали аэробно до тех пор, пока не был достигнут A600 0,4. Культуру разделили на три культуры по 15 мл для лечения стресса. Необработанный посев служил негативным контролем. К каждой из оставшихся двух культур добавляли 0,79 мМ аллицина (128 мкг мл-1) или 1 мМ диамида. Культуры инкубировали в течение 15 мин. По 5 мл каждой культуры собирали центрифугированием (8 525 × г, 4°С, 10 мин). Клетки дважды промывали 1 мл PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4, pH 7,4, хранили в анаэробном состоянии перед использованием) и центрифугировали (13 000 × г, 4°C, 10 мин). Клетки ресуспендировали в буфере для лизиса (PBS с 6 мМ гуанидиния HCl, pH 7,4) до разрушения при 4°C под действием ультразвука (VialTweeter ультразвуковой аппарат, Hielscher GmbH, Германия) (3 × 1 мин). Клеточный мусор гранулировали центрифугированием (13 000 × г, 4 °C, 15 мин). Надосадочную жидкость переносили в кювету QS-macro объемом 3,5 мл (10 мм) с магнитной мешалкой и смешивали с 1 мл буфера для лизиса. Вымирание образцов контролировали при длине волны 412 нм с помощью спектрофотометра Jasco V-650, оснащенного терморегулируемым держателем ячеек PSC-718 при комнатной температуре. Добавляли 100 мкл 3 мМ раствора дитиобиса (2-нитробензойной кислоты). За вымиранием следили до тех пор, пока оно не достигло насыщения. Расчет концентрации тиола проводили с использованием коэффициента экстинкции ε412 = 13 700 м-1 см-1 для тио-2-нитробензойной кислоты (ТНБ). Концентрации тиола в клетках рассчитывали исходя из объема клеток E. coli 6,7 × 10-15 литр и плотность ячеек А600 = 0,5 (эквивалентно 1 × 108 ячеек мл-1 культура). (Müller et al. 2016)
Определение глутатиона in vivo с помощью ультразвуковой клеточной дробилки
E.coli MG1655 выращивали в среде с минимальным содержанием MOPS в общем объеме 200 мл до достижения A600 0,5. Культуру разделили на культуры по 50 мл для лечения стресса. После 15 мин инкубации с 0,79 мМ аллицина, 1 мМ диамида или диметилсульфоксида (контроль) клетки собирали при 4000 г при 4°С в течение 10 мин. Перед повторной суспензией гранул в 700 мкл буфера KPE камеры дважды промывали буфером KPE. Для депротеинизации добавляли 300 л 10% (w/v) сульфосалициловой кислоты перед разрушением клеток ультразвуком (3 x 1 мин; VialTweeter ультразвуковой аппарат). Надосадочную жидкость собирали после центрифугирования (30 мин, 13 000 г, 4°C). Концентрации сульфосалициловой кислоты снижались до 1% путем добавления 3 объемов буфера KPE. Измерения общего глутатиона и GSSG проводили, как описано выше. Концентрации глутатиона в клетках рассчитывали исходя из объема клеток E. coli, равного 6,7×10-15 литр и плотность ячеек А600 0,5 (эквивалентна 1×108 ячеек мл-1 культура). Концентрации GSH рассчитывали путем вычитания 2[GSSG] из общего глутатиона. (Müller et al. 2016)
Экспрессия mAspAT человека в кишечной палочке с помощью ультразвукового гомогенизатора
Одиночная колония E. coli BL21 (DE3), содержащая вектор экспрессии в 30 мл среды Лурии-Бертани (LB), содержащей ампициллин 100 мкг/мл, затем культивируется при 37ºC до получения оптической плотности (OD600) достиг 0,6. Клетки собирали центрифугированием при 4000 × г в течение 10 мин и ресуспендировали в 3 л свежей LB-среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.
В дальнейшем экспрессию белка индуцировали с помощью изопропила β-ᴅ-1-тиогалакпиранозида (IPTG) в дозе 1 мМ в течение 20 ч при 16ºC. Клетки собирали центрифугированием при 8000 × г в течение 15 мин и промывали буфером A (20 мМ NaH2PO4, 0,5 М NaCl, pH 7,4). Приблизительно 45 г (сырого веса) клеток были получены из культуры объемом 3 л. После центрифугирования клеточные гранулы ресуспендировали в 40 мл (для 1 л культуры) в буфере для ледяной экстракции А и лизировали ультразвуком при ледяной температуре с помощью ультразвуковой клеточной дробилки Hielscher UP400St. Лизис клеток центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 15 мин для разделения растворимых (надосадочная жидкость) и осажденных (пеллет) фракций. (Цзян и др. 2015)
Факты, которые стоит знать
Кишечная палочка
Escherichia coli (E. coli) — грамотрицательная, факультативно анаэробная, палочковидная, колиформная бактерия рода Escherichia, которая обычно встречается в нижних отделах кишечника теплокровных организмов (эндотерм). Существует большое количество штаммов (или подтипов) E. coli с разнообразными характеристиками. Большинство штаммов кишечной палочки безвредны для человека, например, штаммы B и K-12, которые обычно используются для исследовательских применений в лабораториях. Однако некоторые штаммы вредны и могут вызвать серьезные заболевания.
Кишечная палочка играет важную роль в современной биологической инженерии и промышленной микробиологии, поскольку бактерией легко манипулировать. Распространенные лабораторные применения, которые часто включают использование E. coli, например, для создания рекомбинантной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или для работы в качестве модельного организма.
E. coli является очень универсальным хозяином для производства гетерологичных белков, и для производства рекомбинантных белков в E. coli доступны различные системы экспрессии белков. Используя плазмиды, которые обеспечивают высокий уровень экспрессии белка, гены могут быть введены в бактерии, что позволяет производить такие белки в больших количествах в процессах промышленной ферментации.
E.coli используются в качестве клеточных фабрик для производства инсулина. Другие области применения включают использование модифицированных клеток E. coli для разработки и производства вакцин и иммобилизованных ферментов, для производства биотоплива, а также для биоремедиации.
Штамм K-12 представляет собой мутантную форму E. coli, которая чрезмерно экспрессирует фермент щелочную фосфатазу (ЩФ). Эта мутация происходит из-за дефекта в гене, который постоянно кодирует фермент. Если ген продуцирует продукт без какого-либо ингибирования, это известно как конститутивная активность. Эта специфическая мутантная форма используется для выделения и очистки фермента ЩФ.
Бактерии E. coli также широко используются в качестве клеточных фабрик. Сконструированные микробы (например, бактерии) и растительные клетки могут быть использованы в качестве так называемых клеточных фабрик. Эти генетически модифицированные клетки производят молекулы, химические вещества, полимеры, белки и другие вещества, которые используются, например, в фармацевтической, пищевой и химической промышленности. Для высвобождения молекул, образующихся внутри таких биоинженерных клеток, ультразвуковой лизис является распространенным методом разрушения клеточных стенок и переноса целевых веществ в окружающую жидкость. Узнайте больше о лизисе биоинженерных клеток!
Ультразвуковой сдвиг ДНК
Ультразвуковые сдвиговые силы являются широко используемым методом высвобождения молекул, органелл и белков из внутренней части клетки, а также для разрыва нитей ДНК на части. Акустическая кавитация разрушает клеточные стенки и мембраны для извлечения ДНК из клеток и получения фрагментов около 600 – 800.о. в длину, что идеально подходит для анализа.
Нажмите здесь, чтобы узнать больше об ультразвуковых гомогенизаторах для фрагментации ДНК!
Литература / Литература
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы от лаборатория Кому промышленного размера.