Ультразвуковая технология Хильшера

Ультразвуковая экстракция белка из тканей и клеточных культур

  • Выделение белка является важной стадией подготовки проб в протеомике.
  • Белки можно экстрагировать из растительной и животной ткани, дрожжей и микроорганизмов.
  • Ультразвук - это надежный эффективный метод экстракции белка, обеспечивающий высокие выходы белка в течение короткого времени экстракции.

 

Экстракция белка из тканей и клеток

Выделение белка из тканей и культивируемых клеток является важной стадией подготовки проб, которая выполняется во многих биохимических и аналитических методах, таких как ELISA, PAGE, Вестерн-блоттинг, масс-спектрометрии или очистки белка. Ультразвуковой разрушение клеток, лизис и экстракция является точно контролируемой методикой для обеспечения высоких выходов белков.

Выделение белка из ткани животных

Для приготовления цельной ткани (например, почек, сердца, легких, мышц и т. Д.) Ткань должна быть расчленена на очень мелкие кусочки чистыми инструментами, предпочтительно на льду, и как можно быстрее, чтобы предотвратить деградацию протеазами (например, лизисный буфер, такой как RIPA или буфер гипотонического лизиса, содержащий коктейль ингибитора протеазы и фосфатазы). После вскрытия образец погружают в жидкий азот для замораживания замораживания. Образец можно хранить при -80 ° C для последующего использования или быть готовым на льду для немедленной гомогенизации. Непосредственно перед ультразвуковой экстракцией в пробирку быстро добавляют ледяной буфер для лизиса (с ингибиторами протеазы DTT, лейпептин и апротинин) (на 10 мг ткани рекомендуется около 600 мкл буфера). Прибл. В каждой пробирке рекомендуется 20-60 мг ткани.
Ультразвуковая гомогенизация, лизис и экстракция проводят с помощью ультразвукового гомогенизатора, такого как Uf200 ः т или UP200St, оснащенный сонотродом с микроконцом. Длительность ультразвука составляет 60-90 сек. при режиме ультразвукового цикла 15 с. ультразвук и 10 сек. время отдыха. Образец следует хранить во льду все время.
После ультразвуковой гомогенизации / экстракции лизат центрифугируют при 27000 г прибл. 20 мин. Затем собирают супернатант, так что концентрацию белка можно определить с помощью анализа белка, такого как анализ белка BCA Pierce.

Белковая звукоация является важным методом подготовки образцов

Ультразвуковая экстракция белка из клеток с UP200St

Запрос информации




Обратите внимание на наши политика конфиденциальности,


Выделение белка из сыворотки крови

Для гомогенной смеси сыворотки и фосфатного буфера образец сначала встряхивают перед лизису ультразвуковых клеток. Для ультразвукового лизиса образец обрабатывают ультразвуком с помощью ультразвукового лабораторного гомогенизатора, такого как UP100H для 8 циклов с амплитудой 20%, для циклов каждые 5 секунд и 15 секунд. Сонокацию проводят ультразвуком в циклах и размещением образца на льду, чтобы избежать перегрева и термического разложения образца. Поскольку сыворотка содержит большое количество высокомолекулярных белков (таких как альбумин, α1-антитрипсин, трансферрин, гаптоглобулин, иммуноглобулин G и иммуноглобулин А), которые препятствуют разделению низкомолекулярных белков во время IEF, рекомендуется их истощать из сыворотки с использованием колонки истощения.

Выделение белка из растительной ткани

Свежую, мягкую растительную ткань, например мха и т. Д., Можно легко разрушить простым размещением измельченного образца в буфере для лизиса для обработки ультразвуком. Жесткие, коренные растительные ткани, такие как семена, пихтовые иглы и т. Д., Должны быть высушены. Некоторые твердые древесные растительные материалы должны быть заморожены и измельчены в жидком азоте до экстракции ультразвуком. Для суспензий для культивирования растительных клеток в большинстве случаев достаточно ультразвуковой обработки в течение 30-150 секунд в буфере для лизиса. Более жесткий материал, такой как семена тыквы, требует более интенсивной обработки ультразвуком, как описано ниже.

Протокол ультразвуковой экстракции альбумина из семян тыквы

Ультразвуковой тканевый гомогенизатор UP400St с S24d40 - для экстракции белка из растительной и животной ткани (Нажмите, чтобы увеличить!)Для ультразвуковой экстракции белка альбумина из тонко измельченного порошка семян тыквы в стеклянном стакане емкостью 250 мл добавляют 10 г обезжиренного порошка семян тыквы и 100 мл деионизированной воды в качестве растворителя. Экстракция белка состоит из двух этапов: во-первых, образец обрабатывают ультразвуком с помощью ультразвукового ультразвукового зонда UP400St (400 Вт, 24 кГц) с установленным сонотродом S24d7. Стеклянный стакан помещают в ванну с холодной водой во время ультразвуковой гомогенизации. Установка ультразвукового устройства UP400St с подключаемым датчиком температуры гарантируется, что температура образца всегда остается ниже 30 ° C. При точном контроле температуры во время обработки ультразвуком избегается денатурация альбумина. Во-вторых, экстракцию проводили с помощью смесителя со скоростью 200 об / мин и при 30 ° С. Затем стакан переносится в термостатический шейкер. Глобулин удаляют диализом дистиллированной водой. После удаления глобулина белковый экстракт можно отбирать для определения профиля альбумина и затем доводят до pI = 3,0, используя 0,1 М HCl для коагуляции альбумина. Твердую фазу отделяют центрифугированием при 5000 g, 20oC и повторно растворяют в деионизированной воде. Коагуляция альбумина выполняется дважды, чтобы увеличить соотношение белка в концентрате альбумина.

Ультразвуковая экстракция щелочного белка для получения белкового концентрата из рисовых отрубей показывает, что ультразвуковая обработка приводит к более высокому выходу белка в значительно более короткое время экстракции – по сравнению с обычными методами извлечения.

Ультразвуковое устройство VialTweeter для экстракции белка из образцов тканей (Нажмите, чтобы увеличить!)

VialTweeter для косвенной обработки ультразвуком.

преимущества

  • быстрый
  • высокие урожаи
  • высокоэффективный
  • Точный контроль параметров
  • воспроизводимые результаты
  • линейная масштабируемость

Протокол подготовки проб для функционального фермента iNOS

Для получения полностью функционального фермента iNOS (например, для скрининга лекарств) рекомендуется следующий протокол: клеточная суспензия должна быть помещена на лед и обрабатывать ультразвуком UP100H при амплитуде 10 мкм при режиме цикла 5 сек. ультразвук и 25 сек. Отдых на льду. Процедуру следует повторить прибл. 3 раза. Время покоя между циклами ультразвуковой обработки снижает повышение температуры и, следовательно, снижает риск денатурации.

Ультразвуковая солюбилизация белка

Ультразвук может ускорить процесс солюбилизации белка, который обычно требует нескольких часов. Чтобы не перегревать образец и предотвратить разрушение белка и модификации растворов, содержащих мочевину, ультразвуковые всплески не должны длиться дольше нескольких секунд.

Основные инструкции

Контроль температуры: Для обеспечения высокого выхода белка без термической денатурации необходимо контролировать температуру во время экстракции. Современные ультразвуковые гомогенизаторы Hielscher – также называемый ультразвуковым дезинтегратором или ультразвуком – точно контролируются. Они оснащены встроенным температурным датчиком. В настройках ультразвукового гомогенизатора можно установить максимальную температуру. Когда достигается эта максимальная температура, ультразвуковой аппарат автоматически останавливается до тех пор, пока образец не остынет.
Буфер: Выбор подходящего буфера и правильного объема буфера изменяется от ткани к ткани и должен быть определен путем пробного и пробного тестирования.
Изоляция / очистка: Лизаты протеинов могут содержать избыток биомолекул, таких как ДНК или углеводы, которые могут быть удалены осаждением белка (дезоксихолат-трихлоруксусная кислота) или буферным обменом.

Читтапало и Ноомхорм (Chittapalo and Noomhorm, 2009) сообщили, что выход белка увеличивается с помощью обработки ультразвуком и что процесс гомогенизации и лизиса ультразвуковой ткани может значительно улучшить существующие процессы экстракции – что позволяет использовать новые возможности для коммерческого использования.

Звуковая защита с звуковым корпусом Hielscher SPB-L и ультразвуковым устройством UP200St. (Нажмите, чтобы увеличить!)

Ультразвуковой тканевый гомогенизатор UP200St для эффективной экстракции белка

Точный контроль ультразвуковой обработки (Нажмите, чтобы увеличить!)

Управление браузером для точной работы и мониторинга процесса обработки ультразвуком

Ультразвуковое оборудование для экстракции белков

Hielscher Ultrasonics предлагает широкий спектр ультразвуковых гомогенизаторов для дезинтеграции клеток, тканей, бактерий, микроорганизмов, дрожжей и спор.
Хирургические ультразвуковые аппараты Hielscher являются мощными и простыми в эксплуатации. Построенные для работы 24/7, они разработаны как надежные и эффективные лабораторные и настольные устройства. Для всех устройств можно точно контролировать выходную мощность и амплитуду. Широкий спектр аксессуары открывает дополнительные параметры настройки. Цифровые устройства, такие как VialTweeter, Uf200 ः т, UP200St, а также UP400St имеют встроенный контроль температуры и встроенную SD-карту для автоматической записи данных.
Для косвенной, бесконтактной и одновременной обработки ультразвуком нескольких образцов мы предлагаем VialTweeter или Ультразвуковой CupHorn,
В зависимости от вашего приложения, материала и объема образца мы рекомендуем вам наиболее подходящую настройку для вашего образца. Свяжитесь с нами сегодня!

Свяжитесь с нами! / Спросите нас!

Пожалуйста, используйте форму ниже, если вы хотите запросить дополнительную информацию о ультразвуковой гомогенизации. Мы будем рады предложить Вам ультразвуковые системы, отвечающей вашим требованиям.









Пожалуйста, обратите внимание на наши политика конфиденциальности,


Литература / Ссылки

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ультразвуковая щелочная экстракция белка из обезжиренных рисовых отрубей и свойств белковых концентратов. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simões, André ES :; Перейра, Диана М.; Amaral, Joana D .; Nunes, Ana F .; Гомес, София; Родригес, Педро М.; Lo, Adrian C .; Д'Ооге, Руди; Steer, Clifford J .; Thibodeau, Stephen N .; Borralho, Pedro M .; Rodrigues, Cecília MP (2013): Эффективное извлечение белков из нескольких исходных образцов после извлечения тризола или тризола LS РНК и длительного хранения. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Полезные сведения

протеомики

Proteomics - это область исследований, в которой исследуются белки и протеом. Белки полностью заполняют множество жизненно важных функций внутри организмов. Протеом представляет собой весь набор белков, выражаемых геномом, клеткой, тканью или организмом в определенное время. Протеом изменяется со временем и различными требованиями или стрессами, которые подвергаются клетке или организму. Более конкретно, это набор выраженных белков в данном типе клетки или организма в определенный момент времени в определенных условиях. Этот термин представляет собой смесь белков и генома. Протеомика - это исследование протеома.

белка

Белки представляют собой большие биомолекулы, так называемые макромолекулы – которые состоят из одной или нескольких длинных цепей аминокислотных остатков. Белки присутствуют во всех организмах как растительного, так и животного происхождения, и они имеют решающее значение для большинства биологических функций. Поскольку белки содержат много биологической информации, они извлекаются для аналитической цели, например, для протеомических исследований. Наиболее важная функция, выполняемая белками, включает катализ метаболических реакций, репликацию ДНК, реакцию на стимулы и перенос молекул из одного места в другое. Белки отличаются друг от друга в первую очередь в их последовательности аминокислот, которая продиктована нуклеотидной последовательностью их генов и которая обычно приводит к сгибанию белка в специфическую трехмерную структуру, которая определяет его активность. Белки – кроме пептидов – один из ключевых компонентов пищи. Поэтому протеомика является мощным инструментом в пищевой науке для оптимизации процессов, безопасности пищевых продуктов и оценки питания.

Электрофорез в геле

Гель-электрофорез является основным методом разделения и анализа макромолекул, таких как ДНК, РНК и белков, а также их фрагментов в зависимости от их размера и заряда. Он используется в клинической химии для отделения белков зарядом и / или размером (агароза IEF, по существу независимая от размера) и в биохимии, молекулярной биологии и протеомике для отделения смешанной популяции ДНК и фрагментов РНК по длине, для оценки размера ДНК и фрагменты РНК или разделить белки зарядом.

Клеточные культуры

Клеточная культура является контролируемым процессом выращивания, при котором клетки культивируются в контролируемых условиях. Условия клеточной культуры изменяются для каждого типа клеток. В общем, среда клеточной культуры состоит из подходящего сосуда (например, чашки Петри) с субстратом или средой, которая обеспечивает необходимые питательные вещества (аминокислоты, углеводы, витамины, минералы), факторы роста, гормоны и газы (CO2, The2), и регулирует физико-химическую среду (буфер рН, осмотическое давление, температуру). Большинство клеток нуждаются в поверхностном или искусственном субстрате, в то время как другие культуры клеток могут культивироваться свободно плавающим в культуральной среде (суспензионная культура, клеточная суспензия).
Массовые культуры линий клеток животных используются в промышленном производстве вирусных вакцин и других биотехнологических продуктов. Человеческие стволовые клетки культивируют, чтобы расширить количество клеток и дифференцировать клетки в различные типы соматических клеток для целей трансплантации.

Образцы тканей

Термин «ткань» описывает клеточный промежуточный продукт, где материал клетки находится на уровне организации между клетками и полным органом. В ткани собираются аналогичные клетки из того же источника, которые вместе выполняют определенную функцию. По функциональной группировке множественных тканей образуются сложные структуры органов.
Ткань отбирают для исследований в области биологии, гистологии / гистопатологии, паразитологии, биохимии, иммуногистохимии, а также для культивирования и экстракции ДНК. Его можно различить между животными (подразделение: ткань млекопитающих) и растительной тканью. Ткани животных сгруппированы в четыре основных типа соединительной, мышечной, нервной и эпителиальной ткани. Ткань растения подразделяют на следующие три тканевые системы: эпидермис, ткань почвы и сосудистую ткань.
Образцы тканей могут быть получены из частей животных или растений, например, кости, мышцы, листья и т. Д.

Телесные жидкости

Кровь, сыворотка, плазма, цереброспинальная жидкость, слюна и синовиальная жидкость являются жидкостями организма, которые предлагают отличный источник диагностически релевантной информации. Поэтому важна сложная подготовка образцов жидкости для анализа организма. Первая трудность связана с широким динамическим диапазоном компонентов, присутствующих в жидкостях организма.

Определение концентрации белка

Анализ Брэдфорда, анализ Лоури и анализ бицинхониновой кислоты (BCA) являются общими анализами для определения концентрации белков. Бычий сывороточный альбумин (BSA) является одним из наиболее часто используемых белковых стандартов.

Буфер для лизиса

Буфер для лизиса следует выбирать в соответствии с материалом клетки или тканью (культура ткани, растение, бактерии, грибы и т. Д.) И являются ли клетки в структуре и типе структуры. Широкий спектр буферов для лизиса для экстракции белков, мембран и органелл составлен с одним или несколькими моющими средствами. Моющее средство обычно выбирают с помощью пробных ошибок и – если доступно – согласно существующему протоколу экстракции белка. Моющее средство должно быть совместимо с источником ткани и белками. В общем, самое мягкое моющее средство, которое работает для конкретной ткани / белка, выбирается для поддержания максимальной функциональности экстракта. Кроме того, при экстракции мембран и органелл мягкое моющее средство сохраняет целостность мембраны. Обычно используемые моющие средства в буферах для лизиса в основном неионные или цвиттерионные, например CHAPS, дезоксихолат, Triton ™ X-100, NP40 и Tween 20.
Например, ткани, такие как мозг, печень, кишечник, почка, селезенка и т. Д., Могут быть просто забуферированы с помощью RIPA – однако должны быть включены ингибиторы протеазы и DTT (например, для гель-электрофореза).
Буфер для лизиса для ткани скелетных мышц (ледяной): 20 мМ Трис (рН 7,8), 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (мас. / Об.) Глицерина, 1 мМ ЭДТА , 1 мМ дитиотреитола, дополненного коктейлем ингибитора протеазы и фосфатазы
Таблица общих буферов и их диапазон рН. Обычно эти буферы обычно используют при концентрациях 20-50 мМ.

буфер Диапазон pH
Лимонная кислота – NaOH, 2,2 – 6,5
Цитрат натрия – Лимонная кислота 3.0 – 6,2
Ацетат натрия – уксусная кислота 3,6 – 5,6
Натриевая соль какодиловой кислоты – Hcl 5.0 – 7,4
МОИ – NaOH, 5,6 – 6,8
Дигидрофосфат натрия – динатрийгидрофосфат 5,8 – 8,0
имидазол – Hcl 6,2 – 7,8
МОПС – Ко 6,6 – 7,8
Триэтаноламин гидрохлорид – NaOH, 6,8 – 8,8
Трис – Hcl 7,0 – 9,0
ГЕПЕС – NaOH, 7,2 – 8,2
Трицин – NaOH, 7,6 – 8,6
Тетраборат натрия – борная кислота 7,6 – 9,2
бицин – NaOH, 7,7 – 8,9
Глицин – NaOH, 8,6 – 10,6

Большинство буферов показывают зависимость рН от температуры. Это особенно верно для буферов Tris. PKa изменяется от 8,06 при 25 ° C до 8,85 при 0 ° C.
(pH и pKa буфера: pH измеряет концентрацию ионов водорода в водном растворе. pKa (= константа диссоциации кислоты) является связанной, но более конкретной мерой, поскольку она помогает предсказать, как молекула будет действовать при определенном рН).

ТРИзол

TRIzol - это химический раствор, используемый для извлечения РНК / ДНК / белка во время экстракции тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния. Использование экстракции TRIzol с помощью ультразвука приводит к высоким выходам ДНК, РНК и белка из одного и того же образца и, следовательно, к другим способам экстракции.