Ультразвуковая экстракция белков из тканей и клеточных культур
- Экстракция белков – важнейший этап подготовки образцов в протеомике.
- Белки можно экстрагировать из растительных и животных тканей, дрожжей и микроорганизмов.
- Обработка ультразвуком – надёжный и эффективный метод экстракции белков, обеспечивающий высокий выход белков за короткое время экстракции.
Экстракция белков из тканей и клеток
Экстракция белков из тканей и культивируемых клеток – важнейший этап подготовки образцов при выполнении многих биохимических и аналитических методов, таких как ELISA, PAGE, вестерн-блоттинг, масс-спектрометрия или очистка белков. Ультразвуковое разрушение клеток, лизис и экстракция представляют собой точно контролируемый нетермический метод, обеспечивающий высокий выход белков.
Экстракция белков из клеток с помощью ультразвукового зонда UP200St
- Быстрота
- Высокий выход
- Высокая эффективность
- Точный контроль параметров
- Воспроизводимые результаты
- Линейная масштабируемость
Общие инструкции по ультразвуковому лизису и экстракции белков
- Контроль температуры: Чтобы обеспечить высокий выход белков без термической денатурации, необходимо контролировать температуру во время экстракции. Современные ультразвуковые гомогенизаторы Hielscher – также называемые ультразвуковыми дезинтеграторами или ультразвуковыми аппаратами – поддаются точному управлению. Они поставляются с подключаемым датчиком температуры. В настройках ультразвукового гомогенизатора можно задать максимальную температуру. При достижении этой максимальной температуры ультразвуковой аппарат автоматически останавливается до охлаждения образца.
- Буфер: Выбор подходящего буфера и его необходимого объёма зависит от типа ткани и должен определяться экспериментально методом проб и ошибок.
- Выделение / очистка: Белковые лизаты могут содержать избыток биомолекул, таких как ДНК или углеводы, которые можно удалить осаждением белков (дезоксихолат–трихлоруксусная кислота) или заменой буфера.
Chittapalo и Noomhorm (2009) сообщили в своём исследовании, что обработка ультразвуком увеличивает выход белков, а ультразвуковая гомогенизация и лизис тканей могут значительно улучшить существующие процессы экстракции – открывая новые возможности для экстракции в промышленных масштабах.
Ультразвуковой CupHorn для одновременной высокоэффективной подготовки нескольких образцов в одинаковых условиях для выделения белков и фрагментации ДНК.
Экстракция белков из животных тканей
Для подготовки целых тканей (например, почки, сердца, лёгкого, мышцы и т. д.) ткань следует разрезать чистыми инструментами на очень мелкие кусочки, предпочтительно на льду, и как можно быстрее, чтобы предотвратить разрушение протеазами (например, лизирующий буфер, такой как RIPA, или гипотонический лизирующий буфер, содержащий смесь ингибиторов протеаз и фосфатаз). После разрезания образец погружают в жидкий азот для быстрого замораживания. Образец можно хранить при -80°C для последующего использования или держать на льду для немедленной гомогенизации. Непосредственно перед ультразвуковой экстракцией в пробирку с образцом быстро добавляют охлаждённый на льду лизирующий буфер (с ингибиторами протеаз DTT, лейпептином и апротинином) (на ~10 mg ткани рекомендуется приблизительно ~600 μL буфера). На одну пробирку с образцом рекомендуется приблизительно 20–60mg ткани.
Ультразвуковую гомогенизацию, лизис и экстракцию выполняют с помощью ультразвукового гомогенизатора, такого как UP100H или UP200Ht, оснащённого сонотродом с микронаконечником. Продолжительность обработки ультразвуком составляет 60–90 с в циклическом режиме: 15 с обработки ультразвуком и 10 с паузы. Образец следует постоянно держать во льду.
После ультразвуковой гомогенизации / экстракции лизат центрифугируют при 27 000g приблизительно 20 мин. Затем собирают супернатант, чтобы определить концентрацию белка с помощью анализа белка, например анализа Pierce BCA.
Экстракция белков из сыворотки крови
Для получения однородной смеси сыворотки и фосфатного буфера образец сначала перемешивают на вортексе перед ультразвуковым лизисом клеток. Для ультразвукового лизиса образец обрабатывают ультразвуком с помощью лабораторного ультразвукового гомогенизатора, такого как UP100H, в течение 8 циклов при амплитуде 20%; каждый цикл включает 5 секунд работы и 15 секунд паузы. Экстракцию белков проводят посредством циклической обработки ультразвуком (импульсный режим), помещая образец на лёд, чтобы избежать его перегрева и термического разрушения. Поскольку сыворотка содержит большое количество высокомолекулярных белков (таких как альбумин, α1-antitrypsin, трансферрин, гаптоглобулин, иммуноглобулин G и иммуноглобулин A), которые мешают разделению низкомолекулярных белков при IEF, рекомендуется удалять их из сыворотки с помощью колонки для удаления этих белков.
Экстракция белков из растительных тканей
Свежие мягкие растительные ткани, например мох и т. д., можно легко разрушить, просто поместив измельчённый материал образца в лизирующий буфер для обработки ультразвуком. Жёсткие одревесневшие растительные ткани, такие как семена, хвоя пихты и т. д., следует измельчать в сухом виде. Некоторые твёрдые одревесневшие растительные материалы необходимо замораживать и измельчать в жидком азоте перед экстракцией посредством обработки ультразвуком. Для суспензий растительных клеточных культур обычно достаточно обработки ультразвуком в лизирующем буфере в течение 30–150 секунд. Более жёсткий материал, например семена тыквы, требует более интенсивной обработки ультразвуком, как описано ниже.
Протокол ультразвуковой экстракции альбумина из семян тыквы
Для ультразвуковой экстракции белка альбумина из тонкоизмельчённого порошка семян тыквы в стеклянный стакан объёмом 250mL добавляют 10 g обезжиренного порошка семян тыквы и 100 mL деионизированной воды в качестве растворителя. Экстракция белка состоит из двух этапов: сначала образец обрабатывают ультразвуком с помощью ультразвукового аппарата зондового типа UP400St (400W, 24kHz), оснащённого сонотродом S24d7. Во время ультразвуковой гомогенизации стеклянный стакан помещают в холодную водяную баню. Подключаемый датчик температуры и настройки контроля температуры ультразвукового аппарата UP400St обеспечивают постоянное поддержание температуры образца ниже 30°C. Точный контроль температуры во время обработки ультразвуком позволяет избежать денатурации альбумина. На втором этапе экстракцию проводили с помощью смесителя при скорости 200 rpm и температуре 30°C. Затем стакан переносят в термостатируемый шейкер. Глобулин удаляют посредством диализа с дистиллированной водой. После удаления глобулина из белкового экстракта можно отобрать пробу для определения профиля альбумина; затем экстракт доводят до pI=3,0 с помощью 0,1 M HCl для коагуляции альбумина. Твёрдую фазу отделяют центрифугированием при 5000g, 20°C и повторно растворяют в деионизированной воде. Коагуляцию альбумина проводят дважды, чтобы увеличить долю белка в альбуминовом концентрате.
Ультразвуковая щелочная экстракция белков для получения белкового концентрата из рисовых отрубей показывает, что обработка ультразвуком обеспечивает более высокий выход белка за значительно более короткое время экстракции – по сравнению с традиционными методами экстракции.
Протокол подготовки образцов для получения функционального фермента iNOS
Для получения полностью функционального фермента iNOS (например, для скрининга лекарственных препаратов) рекомендуется следующий протокол: клеточную суспензию следует поместить на лёд и обработать ультразвуком с помощью UP100H при амплитуде 10µm в циклическом режиме: 5 с обработки ультразвуком и 25 с паузы на льду. Процедуру следует повторить приблизительно 3 раза. Паузы между циклами обработки ультразвуком уменьшают повышение температуры и тем самым снижают риск денатурации.
Ультразвуковая солюбилизация белков
Обработка ультразвуком может ускорить процесс солюбилизации белков, который обычно занимает несколько часов. Чтобы не перегреть образец и предотвратить разрушение и модификации белков в растворах, содержащих мочевину, ультразвуковые импульсы не должны длиться дольше нескольких секунд.
Ультразвуковой аппарат UP200Ht с микронаконечником S26d2 диаметром 2mm для обработки ультразвуком небольших образцов.
Ультразвуковое оборудование для экстракции белков
Hielscher Ultrasonics предлагает широкий ассортимент ультразвуковых гомогенизаторов для разрушения клеток, тканей, бактерий, микроорганизмов, дрожжей и спор.
Лабораторные ультразвуковые аппараты Hielscher мощны и просты в эксплуатации. Созданные для работы в режиме 24/7, они представляют собой надёжные и эффективные лабораторные и настольные устройства. У всех устройств можно точно контролировать выходную энергию и амплитуду. Широкий ассортимент принадлежностей открывает дополнительные возможности конфигурации. Цифровые ультразвуковые аппараты, такие как VialTweeter, UP200Ht, UP200St и UP400St, оснащены встроенной системой контроля температуры и встроенной SD-картой для автоматической записи данных.
Для непрямой одновременной обработки нескольких образцов ультразвуком без перекрёстного загрязнения мы предлагаем VialTweeter или ультразвуковой CupHorn.
В таблице ниже представлен обзор наших ультразвуковых аппаратов для подготовки образцов, разрушения клеток и экстракции. Нажмите на тип устройства, чтобы получить дополнительную информацию о каждом ультразвуковом гомогенизаторе. Наши хорошо подготовленные технические специалисты с многолетним опытом будут рады помочь вам выбрать наиболее подходящий ультразвуковой аппарат для подготовки ваших образцов!
| Объём партии | Расход | Рекомендуемые устройства |
|---|---|---|
| до 10 флаконов или пробирок | не применимо | VialTweeter |
| многолуночные / микротитрационные планшеты | не применимо | UIP400MTP |
| несколько пробирок / сосудов | не применимо | CupHorn |
| от 1 до 500mL | от 10 до 200mL/min | UP100H |
| от 10 до 1000mL | от 20 до 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| от 10 до 2000mL | от 20 до 400mL/min | UP400St |
В зависимости от вашей области применения, материала и объёма образца мы порекомендуем наиболее подходящую конфигурацию для подготовки ваших образцов. Свяжитесь с нами сегодня!
Свяжитесь с нами! / Задайте нам вопрос!
Цифровые ультразвуковые аппараты Hielscher оснащены функцией дистанционного управления через браузер и автоматического протоколирования данных на встроенной SD-карте.
VialTweeter для непрямой обработки ультразвуком.
Полезные сведения
Протеомика
Протеомика – область исследований, изучающая белки и протеом. Белки выполняют огромное множество жизненно важных функций в организмах. Протеом – полный набор белков, экспрессируемых геномом, клеткой, тканью или организмом в определённый момент времени. Протеом меняется со временем и в зависимости от конкретных потребностей или стрессов, испытываемых клеткой или организмом. Точнее, это набор белков, экспрессируемых в определённом типе клеток или организме в определённый момент времени при заданных условиях. Термин образован сочетанием слов «белки» и «геном». Протеомика изучает протеом.
Белок
Белки – крупные биомолекулы, так называемые макромолекулы, состоящие из одной или нескольких длинных цепей аминокислотных остатков. Белки присутствуют во всех организмах как растительного, так и животного происхождения и имеют решающее значение для большинства биологических функций. Поскольку белки содержат много биологической информации, их экстрагируют для аналитических целей, например для протеомных исследований. К наиболее важным функциям белков относятся катализ метаболических реакций, репликация ДНК, ответ на стимулы и транспорт молекул из одного места в другое. Белки отличаются друг от друга главным образом последовательностью аминокислот, которая определяется нуклеотидной последовательностью их генов и обычно приводит к сворачиванию белка в специфическую трёхмерную структуру, определяющую его активность. Белки – наряду с пептидами – являются одним из ключевых компонентов пищи. Поэтому протеомика представляет собой мощный инструмент в науке о пищевых продуктах для оптимизации процессов, обеспечения безопасности пищевых продуктов и оценки их пищевой ценности.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction представляет собой преаналитическую процедуру разделения и предварительного концентрирования аналитов. В сочетании с обработкой ультразвуком экстракцию при температуре помутнения можно интенсифицировать, делая процесс более эффективным, быстрым и экологичным. При использовании обработки ультразвуком экстракция при температуре помутнения становится значительно более эффективным методом подготовки аналитов. Узнайте больше об экстракции при температуре помутнения с применением ультразвука!
Гель-электрофорез
Гель-электрофорез – основной метод разделения и анализа макромолекул, таких как ДНК, РНК и белки, а также их фрагментов на основе их размера и заряда. Он используется в клинической химии для разделения белков по заряду и/или размеру (IEF в агарозе, практически независимо от размера), а в биохимии, молекулярной биологии и протеомике – для разделения смешанной популяции фрагментов ДНК и РНК по длине, оценки размера фрагментов ДНК и РНК или разделения белков по заряду.
Клеточные культуры
Культивирование клеток – контролируемый процесс роста, при котором клетки выращивают в контролируемых условиях. Условия культивирования различаются для каждого типа клеток. В целом среда клеточной культуры включает подходящий сосуд (например, чашку Петри) с субстратом или средой, обеспечивающей необходимые питательные вещества (аминокислоты, углеводы, витамины, минералы), факторы роста, гормоны и газы (CO2, O2) и регулирующей физико-химические условия (буфер для поддержания pH, осмотическое давление, температуру). Большинству клеток необходима поверхность или искусственный субстрат, тогда как другие клеточные культуры можно выращивать в свободно плавающем состоянии в культуральной среде (суспензионная культура, клеточная суспензия).
Массовые культуры клеточных линий животных используются в промышленном производстве вирусных вакцин и других продуктов, получаемых биотехнологическими методами. Стволовые клетки человека культивируют для увеличения количества клеток и их дифференцировки в различные типы соматических клеток с целью трансплантации.
Образцы тканей
Термин «ткань» описывает промежуточный уровень клеточной организации, при котором клеточный материал находится между отдельными клетками и целым органом. В ткани объединены сходные клетки общего происхождения, совместно выполняющие определённую функцию. Функциональное объединение нескольких тканей формирует сложные структуры органов.
Образцы тканей отбирают для исследований в биологии, гистологии/гистопатологии, паразитологии, биохимии, иммуногистохимии, а также для культивирования и экстракции ДНК. Различают животные ткани (подраздел: ткани млекопитающих) и растительные ткани. Животные ткани разделяют на четыре основных типа: соединительную, мышечную, нервную и эпителиальную. Растительные ткани подразделяют на следующие три тканевые системы: эпидермис, основную ткань и проводящую ткань.
Образцы тканей можно подготовить из частей животных или растений, например костей, мышц, листьев и т. д.
Биологические жидкости организма
Кровь, сыворотка, плазма, спинномозговая жидкость, слюна и синовиальная жидкость – биологические жидкости организма, являющиеся богатым источником диагностически значимой информации. Поэтому важна тщательно разработанная подготовка образцов биологических жидкостей к анализу. Первая трудность связана с широким динамическим диапазоном содержания компонентов, присутствующих в биологических жидкостях.
Определение концентрации белка
Метод Брэдфорда, метод Лоури и метод с бицинхониновой кислотой (BCA) – распространённые методы определения концентрации белков. Бычий сывороточный альбумин (BSA) – один из наиболее часто используемых белковых стандартов.
Лизирующий буфер
Лизирующий буфер необходимо выбирать с учётом клеточного материала или ткани (культура тканей, растение, бактерии, грибы и т. д.), а также того, входят ли клетки в какую-либо структуру, и типа этой структуры. Широкий ассортимент лизирующих буферов для экстракции белков, мембран и органелл включает составы с одним или несколькими детергентами. Детергент обычно выбирают экспериментально методом проб и ошибок или – если имеется – в соответствии с существующим протоколом экстракции белков. Детергент должен быть совместим с исходной тканью и белками. Как правило, выбирают наиболее мягкий детергент, эффективный для конкретной ткани / белка, чтобы сохранить максимальную функциональность экстракта. Кроме того, при экстракции мембран и органелл мягкий детергент сохраняет целостность мембраны. Обычно используемые в лизирующих буферах детергенты преимущественно неионные или цвиттер-ионные, например CHAPS, дезоксихолат, Triton™ X-100, NP40 и Tween 20.
Например, такие ткани, как мозг, печень, кишечник, почка, селезёнка и т. д., можно просто обработать буфером RIPA – однако следует добавить ингибиторы протеаз и DTT (например, для гель-электрофореза).
Лизирующий буфер для ткани скелетных мышц (охлаждённый на льду): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) глицерина, 1 mM EDTA, 1 mM дитиотреитола с добавлением смеси ингибиторов протеаз и фосфатаз
Таблица распространённых буферов и их диапазонов pH. Как правило, эти буферы обычно используют в концентрациях 20–50 mM.
| Буфер | Диапазон pH |
|---|---|
| Лимонная кислота – NaOH | 2,2 — 6,5 |
| Цитрат натрия – лимонная кислота | 3,0 — 6,2 |
| Ацетат натрия – уксусная кислота | 3,6 — 5,6 |
| Натриевая соль какодиловой кислоты – HCl | 5,0 — 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 — 6,8 |
| Дигидрофосфат натрия – гидрофосфат динатрия | 5,8 — 8,0 |
| Имидазол – HCl | 6,2 — 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 — 7,8 |
| Гидрохлорид триэтаноламина – NaOH | 6,8 — 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 — 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 — 8,2 |
| Трицин – NaOH | 7,6 — 8,6 |
| Тетраборат натрия – борная кислота | 7,6 — 9,2 |
| Бицин – NaOH | 7,7 — 8,9 |
| Глицин – NaOH | 8,6 — 10,6 |
У большинства буферов pH зависит от температуры. Это особенно характерно для буферов Tris. pKa изменяется от 8,06 при 25°C до 8,85 при 0°C.
(pH и pKa буфера: pH измеряет концентрацию ионов водорода в водном растворе. pKa (= константа диссоциации кислоты) – связанный, но более специфичный показатель, помогающий предсказать, как молекула будет вести себя при определённом значении pH.)
TRIzol
TRIzol – химический раствор, используемый для экстракции РНК/ДНК/белка при экстракции с применением тиоцианата гуанидиния, фенола и хлороформа. Применение экстракции TRIzol с использованием ультразвука обеспечивает высокий выход ДНК, РНК и белков из одного и того же образца и тем самым превосходит другие методы экстракции.
Литература/Источники
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.