Ультразвуковая экстракция белка из тканей и клеточных культур
- Экстракция белка является важным этапом пробоподготовки в протеомике.
- Белки могут быть извлечены из растительных и животных тканей, дрожжей и микроорганизмов.
- Ультразвуковая обработка является надежным и эффективным методом экстракции белка, обеспечивающим высокий выход белка за короткое время экстракции.
Экстракция белка из тканей и клеток
Экстракция белка из тканей и культивируемых клеток является важным этапом подготовки образцов, который выполняется с помощью многих биохимических и аналитических методов, таких как ИФА, ПЕЙДЖ, вестерн-блоттинг, масс-спектрометрия или очистка белка. Ультразвуковое разрушение клеток, лизис и экстракция являются точно контролируемым, нетермическим методом для обеспечения высокого выхода белков.

Экстракция белка из клеток с помощью ультразвуковой щуп УП200Ст
- Быстрый
- высокая урожайность,
- Высокоэффективный
- Точный контроль параметров
- воспроизводимые результаты
- Линейная масштабируемость
Общие инструкции по ультразвуковому лизису и экстракции белка
- Контроль температуры: Чтобы обеспечить высокий выход белка без термической денатурации, необходимо контролировать температуру во время экстракции. Современные ультразвуковые гомогенизаторы Hielscher – также называется ультразвуковым дезинтегратором или ультразвуковиком – точно управляемы. Они поставляются со вставным датчиком температуры. В настройках ультразвукового гомогенизатора можно задать максимальную температуру. При достижении этого максимума ультразвуковой аппарат автоматически останавливается до тех пор, пока образец не остынет.
- Буфер: Выбор подходящего буфера и правильного объема буфера варьируется от ткани к ткани и должен быть определен методом проб и ошибок.
- Изоляция / очистка: Белковые лизаты могут содержать избыток биомолекул, таких как ДНК или углеводы, которые могут быть удалены путем осаждения белка (дезоксихолат-трихлоруксусная кислота) или буферного обмена.
Читтапало и Нумхорм (2009) сообщили в своем исследовании, что выход белка увеличивается с помощью ультразвуковой обработки и что процесс ультразвуковой гомогенизации и лизиса тканей может значительно улучшить существующие процессы экстракции – Создание новых возможностей для коммерческой добычи.

Ультразвуковой чашечный рожок для одновременной, высокоэффективной подготовки образцов из нескольких образцов в одинаковых условиях для выделения белка и фрагментации ДНК.
Экстракция белка из тканей животных
Для получения ткани цельного размера (например, почек, сердца, легких, мышц и т.д.) ткань следует расчленять на очень мелкие кусочки с помощью чистых инструментов, предпочтительно на льду, и как можно быстрее, чтобы предотвратить деградацию протеазами (например, буфер для лизиса, такой как RIPA, или буфер для гипотонического лизиса, содержащий коктейль из протеазы и ингибитора фосфатазы). После препарирования образец погружают в жидкий азот для мгновенной заморозки. Образец можно хранить при температуре -80°C для последующего использования или держать на льду для немедленной гомогенизации. Непосредственно перед ультразвуковой экстракцией в пробирку с образцом быстро вводится ледяной лизисный буфер (с ингибиторами протеазы DTT, лойпептином и апротинином) (на ~10 мг ткани рекомендуется около ~600 мкл буфера). На пробирку с образцом рекомендуется примерно 20-60 мг ткани.
Ультразвуковая гомогенизация, лизис и экстракция выполняются с помощью ультразвукового гомогенизатора, такого как UP100H или UP200Ht, оснащенного сонотродом с микронаконечником. Продолжительность ультразвуковой обработки составляет 60-90 сек. при ультразвуковом цикле 15 сек. ультразвуковой обработки и 10 сек. времени покоя. Образец следует все время держать во льду.
После ультразвуковой гомогенизации / экстракции лизат центрифугируется при плотности 27 000 г в течение примерно 20 минут. После этого собирают надосадочную жидкость, так что концентрацию белка можно определить с помощью анализа белка, такого как анализ белка Пирса BCA.
Экстракция белка из сыворотки крови
Для получения однородной смеси сыворотки и фосфатного буфера образец сначала подвергается вортексу перед ультразвуковым лизисом клеток. Для ультразвукового лизиса образец обрабатывают ультразвуком с помощью ультразвукового лабораторного гомогенизатора, такого как UP100H, в течение 8 циклов с амплитудой 20% амплитуды, для циклов каждые 5 секунд включения и 15 секунд выключения. Экстракция белка осуществляется путем циклического ультразвукового исследования (режим пульсации) и помещения образца на лед таким образом, чтобы избежать перегрева и термической деградации образца. Поскольку сыворотка содержит большое количество высокомолекулярных белков (таких как альбумин, α1-антитрипсин, трансферрин, гаптоглобулин, иммуноглобулин G и иммуноглобулин А), которые препятствуют разделению низкомолекулярных белков во время ИЭФ, рекомендуется истощать их из сыворотки с помощью истощенной колонки.
Экстракция белка из растительных тканей
Свежие, мягкие растительные ткани, например, мох и т. д., можно легко разрушить, просто поместив измельченный материал образца в буфер для лизиса для ультразвуковой обработки. Жесткие, лигенистые растительные ткани, такие как семена, еловые иголки и т.д., должны быть измельчены в сухом виде. Некоторые твердые древесные растительные материалы должны быть заморожены и измельчены в жидком азоте перед экстракцией с помощью ультразвука. Для суспензий растительных культур в основном достаточно ультразвуковой обработки в течение 30-150 секунд в буфере для лизиса. Более твердые материалы, такие как тыквенные семечки, требуют более интенсивной ультразвука, как описано ниже.
Протокол ультразвуковой экстракции альбумина из тыквенных семечек
Для ультразвуковой экстракции белка альбумина из порошка семян тыквы тонкого помола в стеклянный стакан объемом 250 мл добавляют 10 г обезжиренного порошка семян тыквы и 100 мл деионизированной воды в качестве растворителя. Экстракция белка состоит из двух этапов: Во-первых, образец обрабатывается ультразвуком ультразвуковой аппарат зондового типа UP400St (400 Вт, 24 кГц), оснащенный сонотродом S24d7. Стеклянный стакан помещается в ванну с холодной водой во время ультразвуковой гомогенизации. Вставной датчик температуры и настройки контроля температуры ультразвукового аппарата UP400St гарантируют, что температура образца всегда будет ниже 30°C. Благодаря точному контролю температуры во время ультразвуковой обработки предотвращается денатурация альбумина. Во-вторых, экстракцию проводили с помощью смесителя при скорости 200 об/мин и при 30°С. После этого стакан перекладывается в термостатический встряхиватель. Глобулин удаляется с помощью диализа дистиллированной водой. После удаления глобулина белковый экстракт может быть отобран для определения альбуминового профиля и впоследствии скорректирован до pI=3,0 с использованием 0,1 М HCl для коагуляции альбумина. Твердая фаза отделяется центрифугированием при 5000 g, 20°C и повторно растворяется в деионизированной воде. Коагуляцию альбумина проводят дважды для увеличения соотношения белка в концентрате альбумина.
Ультразвуковая экстракция щелочного белка для получения белкового концентрата из рисовых отрубей показала, что ультразвуковая обработка приводит к более высокому выходу белка при значительно более коротком времени экстракции – по сравнению с обычными методами экстракции.
Протокол пробоподготовки функционального фермента iNOS
Для получения полнофункционального фермента iNOS (например, для скрининга лекарственных препаратов) рекомендуется использовать следующий протокол: клеточную суспензию следует поместить на лед и обработать ультразвуком с помощью UP100H с амплитудой 10 мкм в циклическом режиме 5 секунд ультразвуковой обработки и 25 секунд покоя на льду. Процедуру следует повторить примерно 3 раза. Время отдыха между циклами ультразвуковой обработки снижает повышение температуры и, следовательно, снижает риск денатурации.
ультразвуковая солюбилизация белков
Ультразвуковая обработка может ускорить процесс солюбилизации белка, который обычно занимает несколько часов. Чтобы не перегревать образец и не допускать деградации белков и модификаций в растворах, содержащих мочевину, ультразвуковые всплески не должны длиться дольше нескольких секунд.

Ультразвуковой аппарат UP200Ht с микронаконечником 2 мм S26d2 для ультразвуковой обработки небольших образцов.
Ультразвуковое оборудование для экстракции белка
Hielscher Ultrasonics предлагает широкий ассортимент ультразвуковых гомогенизаторов для дезинтеграции клеток, тканей, бактерий, микроорганизмов, дрожжей и спор.
Лабораторные ультразвуковые аппараты Hielscher отличаются высокой мощностью и простотой в эксплуатации. Созданные для работы в режиме 24/7, они спроектированы как надежные и эффективные лабораторные и настольные устройства. Для всех устройств можно точно контролировать выходную энергию и амплитуду. Широкий ассортимент аксессуаров открывает дополнительные возможности для настройки. Цифровые ультразвуковые аппараты, такие как VialTweeter, UP200Ht, UP200St и UP400St, имеют встроенный контроль температуры и встроенную SD-карту для автоматической записи данных.
Для непрямой, без перекрестного загрязнения и одновременной ультразвуковой обработки нескольких образцов мы предлагаем VialTweeter или ультразвуковой CupHorn.
В таблице ниже представлен обзор наших ультразвуковых аппаратов для подготовки образцов, разрушения клеток и экстракции. Нажмите на тип устройства, чтобы получить более подробную информацию о каждом ультразвуковом гомогенизаторе. Наш хорошо обученный и многолетний технический персонал будет рад помочь Вам выбрать наиболее подходящий ультразвуковой аппарат для Вашей пробоподготовки!
Объем партии | Расход | Рекомендуемые устройства |
---|---|---|
до 10 флаконов или туб | н.а. | VialTweeter |
Многолуночные / микротитровальные планшеты | н.а. | UIP400MTP |
Несколько трубок / сосудов | н.а. | горн |
от 1 до 500 мл | От 10 до 200 мл/мин | УП100Ч |
От 10 до 1000 мл | от 20 до 200 мл/мин | УП200Хт, УП200Ст |
от 10 до 2000 мл | от 20 до 400 мл/мин | УП400Ст |
В зависимости от области применения, материала и объема образца мы порекомендуем вам наиболее подходящую конфигурацию для подготовки образцов. Свяжитесь с нами сегодня!
Свяжитесь с нами! / Спросите нас!

Цифровые ультразвуковые аппараты Hielscher оснащены браузерным пультом дистанционного управления и автоматическим протоколированием данных на встроенной SD-карте.

VialTweeter для непрямой ультразвуковой обработки.
Факты, которые стоит знать
Протеомика
Протеомика — это область исследований, которая изучает белки и протеом. Белки выполняют широкий спектр жизненно важных функций в организме. Протеом — это весь набор белков, экспрессируемых геномом, клеткой, тканью или организмом в определенный момент времени. Протеом изменяется со временем и в зависимости от конкретных требований или стрессов, которым подвергается клетка или организм. В частности, это набор экспрессированных белков в определенном типе клеток или организмов, в данное время, при определенных условиях. Этот термин представляет собой смесь белков и генома. Протеомика — это изучение протеома.
белок
Белки – это большие биомолекулы, так называемые макромолекулы – которые состоят из одной или нескольких длинных цепочек аминокислотных остатков. Белки присутствуют во всех организмах как растительного, так и животного происхождения и имеют решающее значение для большинства биологических функций. Поскольку белки содержат много биологической информации, их извлекают в аналитических целях, например, для протеомных исследований. Наиболее важной функцией, выполняемой белками, являются катализ метаболических реакций, репликация ДНК, реакция на раздражители и транспортировка молекул из одного места в другое. Белки отличаются друг от друга прежде всего последовательностью аминокислот, которая диктуется нуклеотидной последовательностью их генов и обычно приводит к сворачиванию белка в определенную трехмерную структуру, определяющую его активность. Белки бывают – кроме пептидов – Один из ключевых компонентов продуктов питания. Таким образом, протеомика является мощным инструментом в науке о продуктах питания для оптимизации процессов, безопасности пищевых продуктов и оценки питательных веществ.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction Это преаналитическая процедура для разделения и предварительного концетратирования аналитов. В сочетании с ультразвуковой обработкой можно интенсифицировать извлечение точки помутнения, что делает процесс более эффективным, быстрым и экологически чистым. При ультразвуковой обработке выделение точки помутнения является значительно более эффективным методом подготовки аналита. Узнайте больше о ультразвуковом извлечении точки помутнения!Гель-электрофорез
Гель-электрофорез является основным методом разделения и анализа макромолекул, таких как ДНК, РНК и белки, а также их фрагментов, на основе их размера и заряда. Он используется в клинической химии для разделения белков по заряду и/или размеру (IEF agarose, по существу не зависит от размера), а в биохимии, молекулярной биологии и протеомике — для разделения смешанной популяции фрагментов ДНК и РНК по длине, для оценки размера фрагментов ДНК и РНК или для разделения белков по заряду.
клеточные культуры
Клеточная культура – это контролируемый процесс выращивания, при котором клетки культивируются в контролируемых условиях. Условия культивирования клеток различаются для каждого типа клеток. Как правило, среда для клеточной культуры состоит из подходящего сосуда (например, чашки Петри) с субстратом или средой, которая поставляет необходимые питательные вещества (аминокислоты, углеводы, витамины, минералы), факторы роста, гормоны и газы (CO2, О2), а также регулирует физико-химическую среду (буфер pH, осмотическое давление, температуру). Большинство клеток нуждаются в поверхностном или искусственном субстрате, в то время как другие клеточные культуры могут культивироваться свободно плавающими в культуральной среде (суспензионная культура, клеточная суспензия).
Массовые культуры клеточных линий животных используются в промышленном производстве вирусных вакцин и других биотехнологических продуктов. Стволовые клетки человека культивируются для увеличения количества клеток и дифференцировки клеток в различные типы соматических клеток с целью трансплантации.
Образцы тканей
Термин «ткань» описывает клеточный промежуточный продукт, в котором клеточный материал находится на организационном уровне между клетками и целым органом. В ткани собираются похожие клетки, из того же происхождения, которые вместе выполняют определенную функцию. За счет функциональной группировки множественных тканей формируются сложные структуры органов.
Образцы ткани отбираются для исследований в области биологии, гистологии/гистопатологии, паразитологии, биохимии, иммуногистохимии, а также для культивирования и извлечения ДНК. Его можно различать между животными (подразделение: ткань млекопитающих) и растительными тканями. Ткани животных подразделяются на четыре основных типа: соединительную, мышечную, нервную и эпителиальную ткань. Растительная ткань подразделяется на следующие три тканевые системы: эпидермис, основная ткань и сосудистая ткань.
Образцы тканей могут быть получены из частей животных или растений, например, костей, мышц, листьев и т. д.
Жидкости для организма
Кровь, сыворотка, плазма, спинномозговая жидкость, слюна и синовиальная жидкость – это жидкости организма, которые являются отличным источником диагностически значимой информации. Поэтому важна сложная подготовка образцов биологических жидкостей к анализу. Первая сложность связана с широким динамическим диапазоном компонентов, присутствующих в жидкостях организма.
Определение концентрации белка
Анализ Брэдфорда, анализ Лоури и анализ бицинхониновой кислоты (БЦА) являются распространенными анализами для определения концентрации белков. Бычий сывороточный альбумин (БСА) является одним из наиболее часто используемых стандартов белка.
Буфер для лизиса
Буфер для лизиса должен быть выбран в зависимости от клеточного материала или ткани (культура ткани, растение, бактерии, грибы и т. д.), а также от наличия клеток в структуре и типе структуры. Широкий спектр буферов для лизиса для экстракции белков, мембран и органелл содержит один или несколько детергентов. Моющее средство обычно выбирается методом проб и ошибок или – при наличии – в соответствии с существующим протоколом экстракции белка. Моющее средство должно быть совместимо с тканевым источником и белками. В целом, самое мягкое моющее средство, которое работает для конкретной ткани / белка, выбирается для того, чтобы сохранить максимальную функциональность экстракта. Кроме того, в случае удаления мембран и органелл, мягкое моющее средство сохраняет мембрану неповрежденной. Обычно используемые детергенты в буферах для лизиса в основном неионогенные или цвиттерионные, например, CHAPS, дезоксихолат, Triton™ X-100, NP40 и Tween 20.
Например, такие ткани, как мозг, печень, кишечник, почки, селезенка и т.д., могут быть просто буферизированы с помощью RIPA – тем не менее, следует включать ингибиторы протеазы и DTT (например, для гель-электрофореза).
Буфер для лизиса скелетной мышечной ткани (ледяной): 20 мМ Трис (pH 7,8), 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1 % Тритон X-100, 10 % глицерин, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол с добавлением протеазы и коктейля ингибиторов фосфатазы
Таблица распространенных буферов и их диапазон pH. Как правило, эти буферы используются в концентрациях 20-50 мМ.
буфер | Диапазон pH |
---|---|
Лимонная кислота – НаОХ | 2.2 – 6.5 |
Цитрат натрия – Лимонная кислота | 3.0 – 6.2 |
Ацетат натрия – уксусная кислота | 3.6 – 5.6 |
Натриевая соль какодиловой кислоты – Список совместимого оборудования | 5.0 – 7.4 |
МЧС – НаОХ | 5.6 – 6.8 |
Дигидрофосфат натрия – динатрия гидрофосфат | 5.8 – 8.0 |
имидазол – Список совместимого оборудования | 6.2 – 7.8 |
ШВАБРЫ – КО | 6.6 – 7.8 |
Триэтаноламингидрохлорид – НаОХ | 6.8 – 8.8 |
Трис – Список совместимого оборудования | 7.0 – 9.0 |
ХЕПЕС – НаОХ | 7.2 – 8.2 |
Трицин – НаОХ | 7.6 – 8.6 |
Тетраборат натрия – борная кислота | 7.6 – 9.2 |
Бицин – НаОХ | 7.7 – 8.9 |
глицин – НаОХ | 8.6 – 10.6 |
Большинство буферов имеют pH-зависимость от температуры. Особенно это касается буферов Tris. pKa изменяется от 8,06 при 25°C до 8,85 при 0°C.
(pH и pKa буфера: pH измеряет концентрацию ионов водорода в водном растворе. pKa (= константа диссоциации кислоты) является связанной, но более конкретной мерой, поскольку она помогает предсказать, как молекула будет действовать при определенном значении pH.)
ТРИЗОЛ
ТРИЗОЛ — это химический раствор, используемый для экстракции РНК/ДНК/белка во время экстракции тиоцианатом-фенол-хлороформа гуанидиния. Использование ультразвуковой экстракции тризолом приводит к получению высоких выходов ДНК, РНК и белков из одного и того же образца и тем самым превосходит другие методы экстракции.
Литература/Литература
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.