Ультразвуковая экстракция белка из тканей и клеточных культур
- Выделение белка является важной стадией подготовки проб в протеомике.
- Белки можно экстрагировать из растительной и животной ткани, дрожжей и микроорганизмов.
- Ультразвук - это надежный эффективный метод экстракции белка, обеспечивающий высокие выходы белка в течение короткого времени экстракции.
Экстракция белка из тканей и клеток
Извлечение белка из тканей и культивируемых клеток является важным этапом подготовки образца, который выполняется во время многих биохимических и аналитических методов, таких как ИФА, ПЕЙДЖ, вестерн-блоттинг, масс-спектрометрия или очистка белка. Ультразвуковое разрушение клеток, лизис и экстракция - это точно контролируемый, нетепловой метод для обеспечения высоких выходов белков.
Извлечение белка из клеток с помощью ультразвуковой зонд UP200St
- быстрый
- высокие урожаи
- высокоэффективный
- Точный контроль параметров
- воспроизводимые результаты
- линейная масштабируемость
Общие инструкции по ультразвуковому лизису и экстракции белка
- Контроль температуры: Для обеспечения высокого выхода белка без термической денатурации необходимо контролировать температуру во время экстракции. Современные ультразвуковые гомогенизаторы Hielscher – также называемый ультразвуковым дезинтегратором или ультразвуковым генератором – точно контролируются. Они оснащены встроенным температурным датчиком. В настройках ультразвукового гомогенизатора можно установить максимальную температуру. Когда достигается эта максимальная температура, ультразвуковой аппарат автоматически останавливается до тех пор, пока образец не остынет.
- Буфер: Выбор подходящего буфера и правильного объема буфера изменяется от ткани к ткани и должен быть определен путем пробного и пробного тестирования.
- Изоляция / очистка: Лизаты протеинов могут содержать избыток биомолекул, таких как ДНК или углеводы, которые могут быть удалены осаждением белка (дезоксихолат-трихлоруксусная кислота) или буферным обменом.
Chittapalo и Noomhorm (2009) сообщили в своем исследовании, что выход белка увеличивается с использованием ультразвуковой обработки и что процесс гомогенизации и лизиса ультразвуковой ткани может значительно улучшить существующие процессы экстракции. – что позволяет использовать новые возможности для коммерческого использования.
Ультразвуковой CupHorn для одновременной, высокоэффективной подготовки нескольких образцов в одинаковых условиях для выделения белка и фрагментации ДНК.
Выделение белка из ткани животных
Для приготовления цельной ткани (например, почек, сердца, легких, мышц и т. Д.) Ткань должна быть расчленена на очень мелкие кусочки чистыми инструментами, предпочтительно на льду, и как можно быстрее, чтобы предотвратить деградацию протеазами (например, лизисный буфер, такой как RIPA или буфер гипотонического лизиса, содержащий коктейль ингибитора протеазы и фосфатазы). После вскрытия образец погружают в жидкий азот для замораживания замораживания. Образец можно хранить при -80 ° C для последующего использования или быть готовым на льду для немедленной гомогенизации. Непосредственно перед ультразвуковой экстракцией в пробирку быстро добавляют ледяной буфер для лизиса (с ингибиторами протеазы DTT, лейпептин и апротинин) (на 10 мг ткани рекомендуется около 600 мкл буфера). Прибл. В каждой пробирке рекомендуется 20-60 мг ткани.
Ультразвуковая гомогенизация, лизис и экстракция выполняются с помощью ультразвукового гомогенизатора, такого как UP100H или UP200Ht, оснащенного сонотродом с микрокончиком. Продолжительность ультразвуковой обработки составляет 60-90 сек. при режиме ультразвукового цикла 15 сек. ультразвуковой обработки и 10 сек. времени покоя. Образец следует все время держать во льду.
После ультразвуковой гомогенизации / экстракции лизат центрифугируют при 27000 г прибл. 20 мин. Затем собирают супернатант, так что концентрацию белка можно определить с помощью анализа белка, такого как анализ белка BCA Pierce.
Выделение белка из сыворотки крови
Для получения однородной смеси сыворотки и фосфатного буфера образец сначала вихряют перед ультразвуковым лизисом клеток. Для ультразвукового лизиса образец обрабатывают ультразвуком с помощью ультразвукового лабораторного гомогенизатора, такого как UP100H, в течение 8 циклов с амплитудой 20%, для циклов каждые 5 секунд включения и 15 секунд выключения. Экстракция белка осуществляется путем циклического обработки ультразвуком (режим пульсации) и размещения образца на льду, чтобы избежать перегрева и термической деградации образца. Поскольку сыворотка содержит большое количество высокомолекулярных белков (таких как альбумин, α1-антитрипсин, трансферрин, гаптоглобулин, иммуноглобулин G и иммуноглобулин А), которые препятствуют разделению низкомолекулярных белков во время IEF, рекомендуется истощать их из сыворотки с помощью обедненной колонки.
Выделение белка из растительной ткани
Свежую, мягкую растительную ткань, например мха и т. Д., Можно легко разрушить простым размещением измельченного образца в буфере для лизиса для обработки ультразвуком. Жесткие, коренные растительные ткани, такие как семена, пихтовые иглы и т. Д., Должны быть высушены. Некоторые твердые древесные растительные материалы должны быть заморожены и измельчены в жидком азоте до экстракции ультразвуком. Для суспензий для культивирования растительных клеток в большинстве случаев достаточно ультразвуковой обработки в течение 30-150 секунд в буфере для лизиса. Более жесткий материал, такой как семена тыквы, требует более интенсивной обработки ультразвуком, как описано ниже.
Протокол ультразвуковой экстракции альбумина из семян тыквы
Для ультразвуковой белковой экстракции альбумина из мелко измельченного порошка семян тыквы в стеклянный стакан объемом 250 мл добавляют 10 г обезжиренного порошка семян тыквы и 100 мл деионизированной воды в качестве растворителя. Экстракция белка состоит из двух этапов: во-первых, образец обрабатывается ультразвуком ультразвуковой аппарат зондового типа UP400St (400 Вт, 24 кГц), оснащенный сонотродом S24d7. Стеклянный стакан помещают в баню с холодной водой во время ультразвуковой гомогенизации. Подключаемый датчик температуры и настройки контроля температуры ультразвукового аппарата UP400St гарантируют, что температура образца всегда поддерживается ниже 30 °C. Благодаря точному контролю температуры во время обработки ультразвуком можно избежать денатурации альбумина. Во-вторых, экстракция производилась с помощью смесителя со скоростью 200 об/мин и при 30°C. После этого стакан переносится в термостатический шейкер. Глобулин удаляется с помощью диализа дистиллированной водой. После удаления глобулина белковый экстракт может быть отобран для определения профиля альбумина и впоследствии отрегулирован до pI = 3,0 с использованием 0,1 М HCl для коагуляции альбумина. Твердая фаза отделяется центрифугированием при 5000 г, 20 ° C и повторно растворяется в деионизированной воде. Коагуляцию альбумина проводят дважды, чтобы увеличить соотношение белка в концентрате альбумина.
Ультразвуковая экстракция щелочного белка для получения белкового концентрата из рисовых отрубей показывает, что ультразвуковая обработка приводит к более высокому выходу белка в значительно более короткое время экстракции – по сравнению с обычными методами извлечения.
Протокол подготовки проб для функционального фермента iNOS
Для получения полнофункционального фермента iNOS (например, для скрининга лекарств) рекомендуется следующий протокол: Клеточная суспензия должна быть помещена на лед и обработана ультразвуком с помощью UP100H на амплитуде 10 мкм в режиме цикла 5 сек. ультразвуком и 25 сек. покоя на льду. Процедуру следует повторить примерно 3 раза. Время покоя между циклами обработки ультразвуком уменьшает повышение температуры и, следовательно, снижает риск денатурации.
Ультразвуковая солюбилизация белка
Ультразвук может ускорить процесс солюбилизации белка, который обычно требует нескольких часов. Чтобы не перегревать образец и предотвратить разрушение белка и модификации растворов, содержащих мочевину, ультразвуковые всплески не должны длиться дольше нескольких секунд.
Ультразвуковой аппарат UP200Ht с 2 мм микроконечным наконечником S26d2 для обработки ультразвуком небольших образцов.
Ультразвуковое оборудование для экстракции белков
Hielscher Ultrasonics предлагает широкий спектр ультразвуковых гомогенизаторов для дезинтеграции клеток, тканей, бактерий, микроорганизмов, дрожжей и спор.
Лабораторные ультразвуковые аппараты Hielscher являются мощными и простыми в эксплуатации. Созданные для работы в режиме 24/7, они спроектированы как надежные и эффективные лабораторные и настольные устройства. Для всех устройств можно точно контролировать выходную энергию и амплитуду. Широкий ассортимент аксессуаров открывает дополнительные возможности настройки. Цифровые ультразвуковые аппараты, такие как VialTweeter, UP200Ht, UP200St и UP400St, имеют встроенный контроль температуры и встроенную SD-карту для автоматической записи данных.
Для косвенной, без перекрестного загрязнения и одновременной обработки ультразвуком нескольких образцов мы предлагаем VialTweeter или ультразвуковой CupHorn.
В приведенной ниже таблице представлен обзор наших ультразвуковых аппаратов для пробоподготовки, разрушения клеток и экстракции. Нажмите на тип устройства, чтобы получить дополнительную информацию о каждом ультразвуковом гомогенизаторе. Наш хорошо обученный и многолетний технический персонал будет рад помочь вам выбрать наиболее подходящий ультразвуковой аппарат для вашей пробоподготовки!
| Объем партии | Скорость потока | Рекомендуемые устройства |
|---|---|---|
| до 10 флаконов или туб | не доступно | VialTweeter |
| многоскважинные / микротитрные пластины | не доступно | UIP400MTP |
| несколько труб / сосудов | не доступно | Кухорн |
| От 1 до 500 мл | От 10 до 200 мл / мин | UP100H |
| от 10 до 1000 мл | от 20 до 200 мл/мин | Uf200 ः т, UP200St |
| От 10 до 2000 мл | От 20 до 400 мл / мин | UP400St |
В зависимости от вашего приложения, материала и объема образца мы рекомендуем вам наиболее подходящую настройку для вашего образца. Свяжитесь с нами сегодня!
Свяжитесь с нами! / Спросите нас!
Цифровые ультразвуковые аппараты Hielscher оснащены пультом дистанционного управления браузером и автоматическим протоколированием передачи данных на встроенной SD-карте.
VialTweeter для косвенной обработки ультразвуком.
Полезные сведения
протеомики
Proteomics - это область исследований, в которой исследуются белки и протеом. Белки полностью заполняют множество жизненно важных функций внутри организмов. Протеом представляет собой весь набор белков, выражаемых геномом, клеткой, тканью или организмом в определенное время. Протеом изменяется со временем и различными требованиями или стрессами, которые подвергаются клетке или организму. Более конкретно, это набор выраженных белков в данном типе клетки или организма в определенный момент времени в определенных условиях. Этот термин представляет собой смесь белков и генома. Протеомика - это исследование протеома.
белка
Белки представляют собой большие биомолекулы, так называемые макромолекулы – которые состоят из одной или нескольких длинных цепей аминокислотных остатков. Белки присутствуют во всех организмах как растительного, так и животного происхождения, и они имеют решающее значение для большинства биологических функций. Поскольку белки содержат много биологической информации, они извлекаются для аналитической цели, например, для протеомических исследований. Наиболее важная функция, выполняемая белками, включает катализ метаболических реакций, репликацию ДНК, реакцию на стимулы и перенос молекул из одного места в другое. Белки отличаются друг от друга в первую очередь в их последовательности аминокислот, которая продиктована нуклеотидной последовательностью их генов и которая обычно приводит к сгибанию белка в специфическую трехмерную структуру, которая определяет его активность. Белки – кроме пептидов – один из ключевых компонентов пищи. Поэтому протеомика является мощным инструментом в пищевой науке для оптимизации процессов, безопасности пищевых продуктов и оценки питания.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction является преаналитической процедурой разделения и предварительного консетирования аналитов. В сочетании с ультразвуком извлечение облачной точки может быть усилено, что делает процесс более эффективным, быстрым и экологически чистым. При ультразвуковой обработке извлечение точки помутнения является значительно более эффективным методом получения аналита. Узнайте больше об ультразвуковом извлечении облачных точек!Электрофорез в геле
Гель-электрофорез является основным методом разделения и анализа макромолекул, таких как ДНК, РНК и белков, а также их фрагментов в зависимости от их размера и заряда. Он используется в клинической химии для отделения белков зарядом и / или размером (агароза IEF, по существу независимая от размера) и в биохимии, молекулярной биологии и протеомике для отделения смешанной популяции ДНК и фрагментов РНК по длине, для оценки размера ДНК и фрагменты РНК или разделить белки зарядом.
Клеточные культуры
Клеточная культура является контролируемым процессом выращивания, при котором клетки культивируются в контролируемых условиях. Условия клеточной культуры изменяются для каждого типа клеток. В общем, среда клеточной культуры состоит из подходящего сосуда (например, чашки Петри) с субстратом или средой, которая обеспечивает необходимые питательные вещества (аминокислоты, углеводы, витамины, минералы), факторы роста, гормоны и газы (CO2, The2), и регулирует физико-химическую среду (буфер рН, осмотическое давление, температуру). Большинство клеток нуждаются в поверхностном или искусственном субстрате, в то время как другие культуры клеток могут культивироваться свободно плавающим в культуральной среде (суспензионная культура, клеточная суспензия).
Массовые культуры линий клеток животных используются в промышленном производстве вирусных вакцин и других биотехнологических продуктов. Человеческие стволовые клетки культивируют, чтобы расширить количество клеток и дифференцировать клетки в различные типы соматических клеток для целей трансплантации.
Образцы тканей
Термин «ткань» описывает клеточный промежуточный продукт, где материал клетки находится на уровне организации между клетками и полным органом. В ткани собираются аналогичные клетки из того же источника, которые вместе выполняют определенную функцию. По функциональной группировке множественных тканей образуются сложные структуры органов.
Ткань отбирают для исследований в области биологии, гистологии / гистопатологии, паразитологии, биохимии, иммуногистохимии, а также для культивирования и экстракции ДНК. Его можно различить между животными (подразделение: ткань млекопитающих) и растительной тканью. Ткани животных сгруппированы в четыре основных типа соединительной, мышечной, нервной и эпителиальной ткани. Ткань растения подразделяют на следующие три тканевые системы: эпидермис, ткань почвы и сосудистую ткань.
Образцы тканей могут быть получены из частей животных или растений, например, кости, мышцы, листья и т. Д.
Телесные жидкости
Кровь, сыворотка, плазма, цереброспинальная жидкость, слюна и синовиальная жидкость являются жидкостями организма, которые предлагают отличный источник диагностически релевантной информации. Поэтому важна сложная подготовка образцов жидкости для анализа организма. Первая трудность связана с широким динамическим диапазоном компонентов, присутствующих в жидкостях организма.
Определение концентрации белка
Анализ Брэдфорда, анализ Лоури и анализ бицинхониновой кислоты (BCA) являются общими анализами для определения концентрации белков. Бычий сывороточный альбумин (BSA) является одним из наиболее часто используемых белковых стандартов.
Буфер для лизиса
Буфер для лизиса следует выбирать в соответствии с материалом клетки или тканью (культура ткани, растение, бактерии, грибы и т. Д.) И являются ли клетки в структуре и типе структуры. Широкий спектр буферов для лизиса для экстракции белков, мембран и органелл составлен с одним или несколькими моющими средствами. Моющее средство обычно выбирают с помощью пробных ошибок и – если доступно – согласно существующему протоколу экстракции белка. Моющее средство должно быть совместимо с источником ткани и белками. В общем, самое мягкое моющее средство, которое работает для конкретной ткани / белка, выбирается для поддержания максимальной функциональности экстракта. Кроме того, при экстракции мембран и органелл мягкое моющее средство сохраняет целостность мембраны. Обычно используемые моющие средства в буферах для лизиса в основном неионные или цвиттерионные, например CHAPS, дезоксихолат, Triton ™ X-100, NP40 и Tween 20.
Например, ткани, такие как мозг, печень, кишечник, почка, селезенка и т. Д., Могут быть просто забуферированы с помощью RIPA – однако должны быть включены ингибиторы протеазы и DTT (например, для гель-электрофореза).
Буфер для лизиса для ткани скелетных мышц (ледяной): 20 мМ Трис (рН 7,8), 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (мас. / Об.) Глицерина, 1 мМ ЭДТА , 1 мМ дитиотреитола, дополненного коктейлем ингибитора протеазы и фосфатазы
Таблица общих буферов и их диапазон рН. Обычно эти буферы обычно используют при концентрациях 20-50 мМ.
| буфер | Диапазон pH |
|---|---|
| Лимонная кислота – NaOH, | 2,2 – 6,5 |
| Цитрат натрия – Лимонная кислота | 3.0 – 6,2 |
| Ацетат натрия – уксусная кислота | 3,6 – 5,6 |
| Натриевая соль какодиловой кислоты – Hcl | 5.0 – 7,4 |
| МОИ – NaOH, | 5,6 – 6,8 |
| Дигидрофосфат натрия – динатрийгидрофосфат | 5,8 – 8,0 |
| имидазол – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| МОПС – Ко | 6,6 – 7,8 |
| Триэтаноламин гидрохлорид – NaOH, | 6,8 – 8,8 |
| Трис – Hcl | 7,0 – 9,0 |
| ГЕПЕС – NaOH, | 7,2 – 8,2 |
| Трицин – NaOH, | 7,6 – 8,6 |
| Тетраборат натрия – борная кислота | 7,6 – 9,2 |
| бицин – NaOH, | 7,7 – 8,9 |
| Глицин – NaOH, | 8,6 – 10,6 |
Большинство буферов показывают зависимость рН от температуры. Это особенно верно для буферов Tris. PKa изменяется от 8,06 при 25 ° C до 8,85 при 0 ° C.
(pH и pKa буфера: pH измеряет концентрацию ионов водорода в водном растворе. pKa (= константа диссоциации кислоты) является связанной, но более конкретной мерой, поскольку она помогает предсказать, как молекула будет действовать при определенном рН).
ТРИзол
TRIzol - это химический раствор, используемый для извлечения РНК / ДНК / белка во время экстракции тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния. Использование экстракции TRIzol с помощью ультразвука приводит к высоким выходам ДНК, РНК и белка из одного и того же образца и, следовательно, к другим способам экстракции.
Литература / Ссылки
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.