Ультразвуковой лизис для вестерн-блоттинга

• Вестерн-блоттинг – это аналитическая процедура для обнаружения специфических белков в образце тканевого гомогената или клеточного экстракта.
• Для проведения вестерн-блоттинга или измерения активности ферментов во многих анализах требуется доступ к веществам и структурам (например, белкам, ДНК, субклеточным фрагментам), находящимся внутри клетки.
• Обработка ультразвуком – надежный и простой в применении метод контролируемого разрушения клеток и лизиса.

Ультразвуковое разрушение клеток

Извлечение белков из тканей и культивируемых клеток – первый этап многих биологических, биохимических и аналитических методов (PAGE, вестерн-блоттинг, ELISA, масс-спектрометрия и т. д.) или очистки белков. Для получения высокого выхода белка клеточный материал и ткани необходимо эффективно разрушить/лизировать. Будь то растительные клетки или животные ткани, обработка ультразвуком позволяет легко и быстро приготовить клеточный лизат.

Преимущества обработки ультразвуком

• быстрота и эффективность
• простота работы
• высокий выход белка
• воспроизводимость/повторяемость
• точный контроль
• масштабируемость

Протокол иммунопреципитации для вестерн-иммуноблоттинга

A. Реагенты

Для приготовления растворов используйте очищенную воду, например Milli-Q.

• 1X фосфатно-солевой буфер (PBS)
• 1X буфер для лизиса клеток: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM пирофосфата натрия, 1 mM β-глицерофосфата, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml лейпептина
  Важно: добавьте 1 mM PMSF непосредственно перед использованием.
• 15 μl белка A+15 μl белка G достаточно для иммунопреципитации (IP), однако это может зависеть от используемого первичного антитела и объема образца. Вы также можете использовать предварительно смешанную агарозу с белками A/G (например, белок A для аффинного выделения IgG кролика и белок G для аффинного выделения IgG мыши)
• 3X буфер для образцов с SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 при 25°C), 6% масс./об. SDS, 30% глицерина, 150 mM DTT, 0,03% масс./об. бромфенолового синего

B. Приготовление клеточных лизатов

• Соберите клетки. Для сбора клеток в неденатурирующих условиях удалите питательную среду и однократно промойте клетки ледяным PBS.
• Удалите PBS, добавьте в каждую чашку (10 cm) 0,5 ml ледяного 1X буфера для лизиса клеток и инкубируйте чашки на льду в течение 5 минут.
• Соскоблите клетки с чашек и перенесите их в микроцентрифужные пробирки. Держите на льду.
• Обработайте ультразвуком дважды по 10 секунд в ледяном буфере для иммунопреципитации (буфер IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 и смесь ингибиторов протеаз). Для обработки ультразвуком VialTweeter или зондовые ультразвуковые аппараты, такие как UP100H или UP200Ht , подходят лучше всего.
• Центрифугируйте лизаты при 15 000 g в течение 10 минут при 4°C.
• Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку. (При необходимости лизат можно хранить при –80°C.)
• Добавьте первичное антитело к надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость с первичным антителом инкубируют в течение 1 h при 4°C при легком перемешивании. Первичное антитело обычно добавляют в концентрации, в 10 раз превышающей используемую для вестерн-блоттинга. (Можно начать с 1μg на 100μL.)
• Затем надосадочную жидкость дополнительно инкубируют со смесью равных количеств агарозы с белком A (Invitrogen) и агарозы с белком G еще в течение 1 h.
• Трижды промойте осадок агарозы буфером IP. Затем извлеките связанные белки с помощью буфера для нанесения образцов на SDS-PAGE, нагревая при 95°C в течение 5 минут.

C. Иммунопреципитация

• Возьмите 200 μl клеточного лизата и добавьте первичное антитело. Инкубируйте при мягком покачивании в течение ночи при 4°C.
• Добавьте агарозные гранулы с белком A или G (20 μl 50% суспензии гранул). Инкубируйте при мягком покачивании в течение 1–3 часов при 4°C.
• Центрифугируйте в микроцентрифуге в течение 30 секунд при 4°C. Пять раз промойте осадок 500 µl 1X буфера для лизиса клеток. Во время промывок держите на льду.
• Ресуспендируйте осадок в 20 μl 3X буфера для образцов с SDS. Перемешайте на вортексе, затем центрифугируйте в микроцентрифуге в течение 30 секунд.
• Нагревайте образец до 95–100°C в течение 2–5 минут и центрифугируйте в микроцентрифуге в течение 1 минуты при 14 000 X g.
• Нанесите образец (15–30 μl) на гель для SDS-PAGE (12–15%).
• Проанализируйте образец методом вестерн-блоттинга.

Вестерн-блот-анализ с ультразвуковым аппаратом UP50H

Следующий протокол с использованием зондового ультразвукового аппарата UP50H применялся в исследовании Kriebisch et al. (2011):
Общий белок выделяли из клеток MC3T3-E1, обработанных 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) или растворителем-носителем. Клетки лизировали буфером, содержащим 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) и 0,5% дезоксихолата натрия (Merck). Клеточный лизат обрабатывали ультразвуком в течение 2 × 10 s при настройке цикла 1 и амплитуде 80 с помощью ультразвукового процессора UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Тельтов, Германия). Затем материал центрифугировали в течение 10 min при 14 000 rpm, а надосадочную жидкость использовали для вестерн-блоттинга. Двадцать пять μg белка кипятили в буфере для образцов с восстановителем (Invitrogen), затем разделяли методом SDS-PAGE с использованием 4–12% полиакриламидных гелей (Invitrogen) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (GE health care). Мембрану блокировали в течение 1 h раствором TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), содержащим 1% казеина (Sigma-Aldrich) и 1% Tris (1 M). После блокирования мембрану инкубировали при легком перемешивании в течение ночи при 4°C с первичным антителом (кроличье антитело против CBS человека, 1/500, разработанное в лаборатории проф. R. Banerjee, Анн-Арбор, Мичиган, США). Инкубацию со вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HPR) (Dako), проводили в течение 1 h при комнатной температуре. Все блоты проявляли методом усиленной хемилюминесценции (Perkin Elmer).
 

Нажмите здесь, чтобы узнать больше о передовых методах ультразвукового лизиса клеток и экстракции, приготовлении лизатов и рекомендациях по улучшению процесса!
 
Таблица ниже дает представление о приблизительной производительности наших лабораторных ультразвуковых аппаратов:

Литература / Ссылки

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.