Ультразвуковой лизис для вестерн-блоттинга
- Вестерн-блоттинг — это аналитическая процедура для обнаружения специфических белков в образце тканевого гомогената или клеточного экстракта.
- Чтобы провести вестерн-блоттинг или измерить активность ферментов, многие анализы требуют доступа к материалам (например, белкам, ДНК, субклеточным фрагментам), захваченным клеткой.
- Ультразвуковая обработка является надежным и простым в обращении методом контролируемого разрушения и лизиса клеток.
Ультразвуковое разрушение клеток
Экстракция белка из тканей и культивируемых клеток является первым шагом для многих биологических, биохимических и аналитических методов (PAGE, вестерн-блоттинг, ИФА, масс-спектрометрия и т.д.) или очистки белков. Для получения высокого выхода белка клеточный материал и ткань должны быть эффективно разрушены/лизированы. Будь то растительные клетки или ткани животного происхождения, ультразвуковая обработка — это метод простого и быстрого приготовления лизата клеток.
Преимущества ультразвуковой обработки
- Быстрый & Эффективный
- Простое управление
- высокий выход белка
- воспроизводимый/воспроизводимый
- точно управляемый
- масштабируемый

Ультразвуковой аппарат VialTweeter для ультразвуковой подготовки образцов, такой как разрушение клеток и выделение белков
Протокол иммунопреципитации для западного иммуноблоттинга
А. Реактивы
Для приготовления растворов используйте очищенную воду, такую как Milli-Q.
- 1X Фосфатно-солевой буфер (PBS)
- 1X Буфер для лизиса клеток: 20 мМ Трис (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1% Тритон X-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ β-глицерофосфат, 1 мМ Na3VO4, 1 мкг/мл лойпептин
Важно: Добавьте 1 мМ PMSF непосредственно перед использованием. - 15 мкл белка A+15 мкл белка G достаточно для IP, но это может зависеть от вашего основного антитела и объема образца. Вы также можете использовать предварительно смешанный белок A/G agarose (например, белок A для снижения IgG у кроликов и протеин G для мышей IgG)
- 3X SDS буфер для проб: 187,5 мМ Tris-HCl (pH 6,8 при 25°C), 6% мас./v, 30% глицерина, 150 мМ DTT, 0,03% w/v бромфенолового синего
Б. Получение клеточных лизатов
- Соберите клетки с прахом. Чтобы получить клетки в условиях, не содержащих денатурацию, удалите среду и промывайте клетки один раз с помощью ледяного PBS.
- Удалите PBS и добавьте 0,5 мл ледяного буфера для лизиса 1X клеток на каждую пластину (10 см) и инкубируйте пластины на льду в течение 5 минут.
- Соскребите ячейки с планшетов и переложите в микроцентрифужные пробирки. Держите на льду.
- Дважды обрабатывайте ультразвуком в течение 10 секунд в ледяном иммунопреципитирующем буфере (IP-буфер: 50 мМ Tris-HCl [pH 7,4], 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,1% NP-40 и смесь ингибиторов протеазы). Для ультразвуковой обработки VialTweeter или зондовый ультразвуковой аппарат, такой как УП100Ч или УП200Хт являются наиболее подходящими.
- Центрифугируйте лизаты при 15 000 г в течение 10 минут при 4°C.
- Переложите надосадочную жидкость в новую трубку. (При необходимости лизат можно хранить при температуре –80°C.)
- Добавьте первичное антитело к надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость с первичным антителом инкубируют в течение 1 ч при 4°С при легком перемешивании. Первичное антитело обычно добавляют в количестве, в 10 раз превышающем концентрированное, используемое для вестерн-блоттинга. (Вы можете начать с 1 г на 100 л.)
- Затем надосадочную жидкость инкубируют со смесью равных количеств белка А-агарозы (Invitrogen) и протеина G агарозы в течение еще 1 ч.
- Промойте агарозные гранулы три раза с IP-буфером. После этого извлеките связанные белки с помощью загрузочного буфера SDS-PAGE путем нагревания при температуре 95°C в течение 5 минут.
В. Иммунопреципитация
- Возьмите 200 мкл клеточного лизата и добавьте первичное антитело. Инкубировать с легким покачиванием в течение ночи при температуре 4°C.
- Добавьте белок А или G в агарозные гранулы (20 мкл 50% суспензии из гранул). Инкубировать с легким покачиванием в течение 1–3 часов при температуре 4°C.
- Микроцентрифуга в течение 30 секунд при 4°C. Промойте гранулу пять раз 500 мкл 1X буфера для лизиса клеток. Держите на льду во время стирки.
- Повторно суспендируйте гранулу с помощью буфера для образца 20 мкл 3X SDS. Вортекс, затем микроцентрифуга в течение 30 секунд.
- Нагрейте образец до 95–100 °C в течение 2–5 минут и нагрейте микроцентрифугой в течение 1 минуты при 14 000 X g.
- Загрузите образец (15–30 μл) в гель SDS-PAGE (12–15%).
- Проанализируйте образец методом вестерн-блоттинга.
Анализ вестерн-блоттинга с помощью ультразвукового аппарата UP50H
В исследовании Kriebisch et al. (2011) был использован следующий протокол с использованием ультразвукового аппарата зондового типа UP50H:
Общий белок выделяли из клеток MC3T3-E1, обработанных 1,25(OH)2D3 (10−8 M) или транспортное средство. Клетки лизировали буфером, содержащим 50 мМ Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 мМ NaCl (Fisher Scientific); 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) и 0,5% дезоксихолата натрия (Merck). Лизат клеток обрабатывали ультразвуком в течение 2 × 10 с в цикле 1 и амплитуде 80 с Ультразвуковой процессор UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Германия). После этого материал центрифугировали в течение 10 минут при 14 000 об/мин, и надосадочную жидкость использовали для вестерн-блоттинга. Двадцать пять г белка кипятили в буфере для образца и восстановителе (Invitrogen), а затем разделяли с помощью SDS-PAGE с использованием 4–12% полиакриламидных гелей (Invitrogen) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (GE health care). Мембрану блокировали на 1 ч TBS (10 мМ Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), содержащим 1% казеина (Sigma-Aldrich) и 1% Tris (1 M). После блокирования мембрану инкубировали с легким перемешиванием в течение ночи при 4°С с первичным антителом (кролик античеловеческий CBS 1/500, разработанный в лаборатории профессора Р. Банерджи, Анн-Арбор, Мичиган, США). Инкубацию с пероксидазой хрена (HPR)-конъюгированным вторичным антителом (Dako) проводили в течение 1 ч при комнатной температуре. Все блоттинги были разработаны методом усиленной хемилюминесценции (Перкин Элмер).
Нажмите здесь, чтобы узнать больше о передовых методах ультразвукового лизиса и экстракции клеток, приготовлении лизата и рекомендациях по улучшению процесса!
В таблице ниже приведена приблизительная производительность обработки наших лабораторных ультразвуковых аппаратов:
Рекомендуемые устройства | Объем партии | Расход |
---|---|---|
UIP400MTP 96-луночный ультразвуковой аппарат | Многолуночные / микротитровальные планшеты | н.а. |
Ультразвуковой чашечный рожок | CupHorn для флаконов или стакана | н.а. |
ГДмини2 | Ультразвуковой микропоточный реактор | н.а. |
VialTweeter | 0от 0,5 до 1,5 мл | н.а. |
УП100Ч | от 1 до 500 мл | От 10 до 200 мл/мин |
УП200Хт, УП200Ст | От 10 до 1000 мл | от 20 до 200 мл/мин |
УП400Ст | от 10 до 2000 мл | от 20 до 400 мл/мин |
Ультразвуковая встряхиватель для сит | н.а. | н.а. |
Свяжитесь с нами! / Спросите нас!

UIP400MTP пластинчатый ультразвуковой аппарат для высокопроизводительной ультразвуковой обработки 96-луночных планшетов
О вестерн-блоттинге
Блоттинг — это аналитический процесс, при котором ДНК, РНК и белки переносятся на носитель, чтобы их можно было разделить.
Южный блот используется для обнаружения ДНК, Северный блот — для РНК, а Вестерн-блот — для белков.
Вестерн-блоттинг также называют белковым иммуноблоттингом, потому что антитело используется для специфического обнаружения его антигена. Вестерн-блоттинг является одним из наиболее важных методов анализа для обнаружения конкретных белков в образце. При вестерн-блоттинге белки иммобилизуются на мембранах для их обнаружения с помощью моноклональных или поликлональных антител.
С помощью электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) нативные белки разделяются по трехмерной структуре или денатурированные белки по длине полипептида. Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозу или PVDF), где они окрашиваются антителами, специфичными к белку-мишени. Этап гель-электрофореза включается в вестерн-блоттинг для решения вопроса о перекрестной реактивности антител.
После этого разделенные белки наносят на матрицу (в основном на мембрану из нитроцеллюлозы или PVDF), где они окрашиваются антителами. Антитела функционируют как зонд и подбираются специально к белку-мишени. Анализ локализации и интенсивности специфической реакции позволяет выявить детали экспрессии белков-мишеней в данном образце. Вестерн-блоттинг может обнаружить целевой белок, который составляет всего 1 нг благодаря высокому разрешению гель-электрофореза и высокой специфичности и высокой чувствительности иммуноанализа. Метод вестерн-блоттинга используется в молекулярной биологии, биохимии, иммуногенетике и других областях молекулярных исследований.
Другие связанные с этим методы включают анализ методом дот-блоттинга, иммуногистохимию и иммуноцитохимию, где антитела используются для обнаружения белков в тканях и клетках с помощью иммуноокрашивания, а также иммуноферментный анализ (ИФА).
Литература / Литература
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

Ультразвуковой аппарат VialTweeter для одновременной пробоподготовки нескольких флаконов