Ультразвуковой лизис для вестерн-блоттинга

• Вестерн-блоттинг — это аналитическая процедура для обнаружения специфических белков в образце тканевого гомогената или клеточного экстракта.
• Чтобы провести вестерн-блоттинг или измерить активность ферментов, многие анализы требуют доступа к материалам (например, белкам, ДНК, субклеточным фрагментам), захваченным клеткой.
• Ультразвуковая обработка является надежным и простым в обращении методом контролируемого разрушения и лизиса клеток.

Ультразвуковое разрушение клеток

Экстракция белка из тканей и культивируемых клеток является первым шагом для многих биологических, биохимических и аналитических методов (PAGE, вестерн-блоттинг, ИФА, масс-спектрометрия и т.д.) или очистки белков. Для получения высокого выхода белка клеточный материал и ткань должны быть эффективно разрушены/лизированы. Будь то растительные клетки или ткани животного происхождения, ультразвуковая обработка — это метод простого и быстрого приготовления лизата клеток.

Преимущества ультразвуковой обработки

• Быстрый & Эффективный
• Простое управление
• высокий выход белка
• воспроизводимый/воспроизводимый
• точно управляемый
• масштабируемый

Протокол иммунопреципитации для западного иммуноблоттинга

А. Реактивы

Для приготовления растворов используйте очищенную воду, такую как Milli-Q.

• 1X Фосфатно-солевой буфер (PBS)
• 1X Буфер для лизиса клеток: 20 мМ Трис (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1% Тритон X-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ β-глицерофосфат, 1 мМ Na3VO4, 1 мкг/мл лойпептин
  Важно: Добавьте 1 мМ PMSF непосредственно перед использованием.
• 15 мкл белка A+15 мкл белка G достаточно для IP, но это может зависеть от вашего основного антитела и объема образца. Вы также можете использовать предварительно смешанный белок A/G agarose (например, белок A для снижения IgG у кроликов и протеин G для мышей IgG)
• 3X SDS буфер для проб: 187,5 мМ Tris-HCl (pH 6,8 при 25°C), 6% мас./v, 30% глицерина, 150 мМ DTT, 0,03% w/v бромфенолового синего

Б. Получение клеточных лизатов

• Соберите клетки с прахом. Чтобы получить клетки в условиях, не содержащих денатурацию, удалите среду и промывайте клетки один раз с помощью ледяного PBS.
• Удалите PBS и добавьте 0,5 мл ледяного буфера для лизиса 1X клеток на каждую пластину (10 см) и инкубируйте пластины на льду в течение 5 минут.
• Соскребите ячейки с планшетов и переложите в микроцентрифужные пробирки. Держите на льду.
• Дважды обрабатывайте ультразвуком в течение 10 секунд в ледяном иммунопреципитирующем буфере (IP-буфер: 50 мМ Tris-HCl [pH 7,4], 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,1% NP-40 и смесь ингибиторов протеазы). Для ультразвуковой обработки VialTweeter или зондовый ультразвуковой аппарат, такой как УП100Ч или УП200Хт являются наиболее подходящими.
• Центрифугируйте лизаты при 15 000 г в течение 10 минут при 4°C.
• Переложите надосадочную жидкость в новую трубку. (При необходимости лизат можно хранить при температуре –80°C.)
• Добавьте первичное антитело к надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость с первичным антителом инкубируют в течение 1 ч при 4°С при легком перемешивании. Первичное антитело обычно добавляют в количестве, в 10 раз превышающем концентрированное, используемое для вестерн-блоттинга. (Вы можете начать с 1 г на 100 л.)
• Затем надосадочную жидкость инкубируют со смесью равных количеств белка А-агарозы (Invitrogen) и протеина G агарозы в течение еще 1 ч.
• Промойте агарозные гранулы три раза с IP-буфером. После этого извлеките связанные белки с помощью загрузочного буфера SDS-PAGE путем нагревания при температуре 95°C в течение 5 минут.

В. Иммунопреципитация

• Возьмите 200 мкл клеточного лизата и добавьте первичное антитело. Инкубировать с легким покачиванием в течение ночи при температуре 4°C.
• Добавьте белок А или G в агарозные гранулы (20 мкл 50% суспензии из гранул). Инкубировать с легким покачиванием в течение 1–3 часов при температуре 4°C.
• Микроцентрифуга в течение 30 секунд при 4°C. Промойте гранулу пять раз 500 мкл 1X буфера для лизиса клеток. Держите на льду во время стирки.
• Повторно суспендируйте гранулу с помощью буфера для образца 20 мкл 3X SDS. Вортекс, затем микроцентрифуга в течение 30 секунд.
• Нагрейте образец до 95–100 °C в течение 2–5 минут и нагрейте микроцентрифугой в течение 1 минуты при 14 000 X g.
• Загрузите образец (15–30 μл) в гель SDS-PAGE (12–15%).
• Проанализируйте образец методом вестерн-блоттинга.

Анализ вестерн-блоттинга с помощью ультразвукового аппарата UP50H

В исследовании Kriebisch et al. (2011) был использован следующий протокол с использованием ультразвукового аппарата зондового типа UP50H:
Общий белок выделяли из клеток MC3T3-E1, обработанных 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) или транспортное средство. Клетки лизировали буфером, содержащим 50 мМ Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 мМ NaCl (Fisher Scientific); 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) и 0,5% дезоксихолата натрия (Merck). Лизат клеток обрабатывали ультразвуком в течение 2 × 10 с в цикле 1 и амплитуде 80 с Ультразвуковой процессор UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Германия). После этого материал центрифугировали в течение 10 минут при 14 000 об/мин, и надосадочную жидкость использовали для вестерн-блоттинга. Двадцать пять г белка кипятили в буфере для образца и восстановителе (Invitrogen), а затем разделяли с помощью SDS-PAGE с использованием 4–12% полиакриламидных гелей (Invitrogen) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (GE health care). Мембрану блокировали на 1 ч TBS (10 мМ Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), содержащим 1% казеина (Sigma-Aldrich) и 1% Tris (1 M). После блокирования мембрану инкубировали с легким перемешиванием в течение ночи при 4°С с первичным антителом (кролик античеловеческий CBS 1/500, разработанный в лаборатории профессора Р. Банерджи, Анн-Арбор, Мичиган, США). Инкубацию с пероксидазой хрена (HPR)-конъюгированным вторичным антителом (Dako) проводили в течение 1 ч при комнатной температуре. Все блоттинги были разработаны методом усиленной хемилюминесценции (Перкин Элмер).
 

Нажмите здесь, чтобы узнать больше о передовых методах ультразвукового лизиса и экстракции клеток, приготовлении лизата и рекомендациях по улучшению процесса!
 
В таблице ниже приведена приблизительная производительность обработки наших лабораторных ультразвуковых аппаратов:

Литература / Литература