Ультразвуковой лизис для Вестерн-блоттинга

• Вестерн-блот является аналитическая процедура для определения специфических белков в образце гомогената ткани или клеточного экстракта.
• Для того, чтобы запустить Вестерн-блоты или для измерения активности фермента, многие анализы требуют доступа к материалам (например, белки, ДНК, субклеточные фрагментов), захваченные в клетке.
• Озвучивание является надежным и простым в обращении метод для контролируемого разрушения клеток и лизиса.

Ультразвуковая Сотовый Срыв

экстракции белка из тканей и культивируемых клеток является первым шагом для многих биологических, биохимических и аналитических методов (PAGE, Вестерн-блоттинга, ELISA, масс-спектрометрии и т.д.) или очистки белков. Для того, чтобы получить высокий выход белка, клеточный материал и ткани должны быть эффективно разрушены / лизису. Если растительной клетки или ткани животных Озвучивание является способ получения вашей Клеточный лизат легко и быстро.

Преимущества ультразвука

• Быстро & эффективное
• простое управление
• высокий выход белка
• воспроизводимый / повторяемый
• точно контролируемый
• масштабируемый

Иммунопреципитация Протокол Для Западного иммуноблоттинга

А. Реагенты

Для приготовления растворов, используют очищенную воду, такие как Milli-Q.

• 1X фосфатно-солевой буферный (PBS),
• 1X буфера для лизиса клеток: 20 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 2,5 пирофосфата мМ натрия, 1 мМ β-глицерофосфат, 1 мМ Na3VO4, 1 мкг / мл лейпептина
  Важно: Добавить 1 мМ PMSF непосредственно перед использованием.
• 15 мкл белка А + 15 мкл белка G является достаточным для IP, но это может зависеть от основного антитела, и объем образца. Кроме того, можно использовать предварительно смешанный белок A / G агарозы (например, белок А для кролика IgG тянуть вниз и белка G для мыши IgG тянуть вниз)
• 3X SDS Образец Буфер: 187,5 мМ Трис-HCl (рН 6,8 при 25 ° С), 6% вес / объем SDS, 30% глицерина, 150 мМ DTT, 0,03% вес / об бромфенола синего

B. Получение клеточных лизатов

• Урожай клетки. Для сбора клеток в неденатурирующих условиях, удалить носитель и промыть клетки один раз охлажденным льдом PBS.
• Удалить PBS и добавляют 0,5 мл охлажденного льдом 1X буфера для лизиса клеток к каждой пластине (10 см) и инкубировать пластины на льду в течение 5 минут.
• Выскоблите клетки из чашек и передать в микроцентрифужные пробирки. Держите на льду.
• Гомогенат дважды в течение 10 секунд в охлажденного льдом буфера иммунопреципитации (IP-буфер: 50 мМ Трис-HCl [рН 7,4], 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,1% NP-40, и смесь ингибиторов протеазы). Для обработки ультразвуком VialTweeter или с зондом, ультразвуковой дезинтегратор, например, как UP100H или Uf200 ः т являются наиболее подходящими.
• Центрифуга лизатов при 15000 г в течение 10 минут при 4 ° С.
• Передача супернатант в новую пробирку. (При необходимости, лизат можно хранить при температуре -80 ° С.)
• Добавьте первичное антитело к надосадочной жидкости. Супернатант с первичным антителом инкубируют в течение 1 ч при 4 ° С при легком перемешивании. Первичные антитела, как правило, добавляют в количестве 10x более концентрированной, чем используется для Вестерн-блоттинга. (Вы можете начать с 1 мкг на 100 мкл.)
• Супернатант затем инкубировали дополнительно со смесью равных количеств белка А-агарозы (Invitrogen) и белка G агарозы в течение еще 1 ч.
• Промыть агарозы гранулы, три раза буфером IP. После этого извлечь связанные белки с SDS-PAGE буфера загрузки путем нагревания при 95 ° С в течение 5 минут.

C. иммунопреципитация

• Взять 200 мкл клеточного лизата и добавляют первичное антитело. Инкубируйте с нежным качалки в течение ночи при 4 ° С.
• Добавьте либо белок А или G агарозном бисером (20 мкл 50% -ной суспензии шарик). Инкубируйте с нежным качалки в течение 1-3 часов при 4 ° С.
• Микроцентрифуга в течение 30 секунд при температуре 4 ° С. Промывочный гранулы пять раз с 500 мкл 1X буфера для лизиса клеток. Держите на льду во время мытья.
• Ресуспендируют осадок с 20 мкл буфера для образцов SDS 3X. Вихрь, затем микроцентрифуге в течение 30 секунд.
• Нагрев образца до 95-100 ° С в течение 2-5 минут и микроцентрифуга в течение 1 мин при 14000 х г.
• Загрузить образец (15-30 мкл) на SDS-PAGE геле (12-15%).
• Анализ образца методом Вестерн-блоттинга.

Вестерн-блот-анализ с использованием ультразвукового дезинтегратора UP50H

Следующий протокол был использован в исследовании Kriebisch и соавт. (2011):
Общий белок был выделен из МС3Т3-Е1 ​​клеток, обработанных 1,25 (OH)₂D₃ (10^-8 М) или транспортное средство. Клетки лизируют с использованием буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 8 (Sigma-Aldrich); 150 мМ NaCl, (Fisher Scientific); 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL СА-630 (Sigma-Aldrich) и 0,5% дезоксихолат натрия (Merck). Клеточный лизат обрабатывают ультразвуком в течение 2 × 10 с при цикле 1 и амплитудой 80 с UP50H Ультразвуковой процессор (Hielscher, Ultrasound Technology, Тельтов, Германия). После этого материал центрифугировали в течение 10 мин при 14000 об / мин и супернатант использовали для Вестерн-блоттинга. Двадцать пять мкг белка кипятили в буфере для образцов и восстановителе (Invitrogen) и затем разделяли SDS-PAGE с использованием 4-12% полиакриламидных гелей (Invitrogen) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (GE health care). Мембрану блокировали в течение 1 ч с TBS (10 мМ Трис-HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl), содержащим 1% казеина (Sigma-Aldrich) и 1% Tris (1 М). После блокирования мембрану инкубировали с небольшим перемешиванием в течение ночи при 4 ° С с первичным антителом (кроличьим античеловеческим CBS 1/500, разработанным в лаборатории профессора Р. Банерджи, Энн-Арбор, штат Мичиган, США). Инкубацию с пероксидазой хрена (HPR) -конъюгированным вторичным антителом (Dako) проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. Все блоты были разработаны благодаря усиленной хемилюминесценции (Perkin Elmer).

Литература / Ссылки