Ультразвуковая подготовка образцов для ИФА анализов

Такие анализы, как ИФА, широко используются для диагностики in vitro, обнаружения белков, связанных с заболеванием, и контроля качества (например, мониторинг пищевых аллергенов). Ультразвуковая пробоподготовка — это быстрый, надежный и воспроизводимый метод лизиса клеток и изоляции внутриклеточных белков, ДНК, РНК и органелл. Hielscher Ultrasonics предлагает различные ультразвуковые решения для удобной подготовки отдельных образцов, нескольких флаконов, а также для микротитровых планшетов и 96-луночных планшетов.

ЭЛИЗА – Иммуноферментный анализ

ИФА расшифровывается как иммуноферментный анализ и является широко используемым методом биохимического анализа категории лиганд-связывающих анализов. В ИФА жидкий образец добавляется к неподвижной твердой фазе с особыми связующими свойствами. Как правило, неподвижная твердая фаза наносится в качестве покрытия на планшет лунки или планшет ИФА. Затем различные жидкие реагенты последовательно добавляют, инкубируют и промывают, так что в конечном итоге происходит оптическое изменение (например, развитие цвета продуктом ферментативной реакции) в конечной жидкости в лунке. Оптическое изменение позволяет измерять количество анализируемого вещества с помощью так называемого количественного “чтение». Для количественного считывания используется спектрофотометр, флуориметр или люминометр, который обнаруживает и измеряет интенсивность проходящего света. На чувствительность детектирования влияет усиление сигнала в ходе аналитических реакций. Поскольку ферментативные реакции хорошо изучены и процессы амплификации надежны, для создания сигнала используются ферменты. Ферменты связаны с детектирующими реагентами в фиксированных пропорциях, что обеспечивает точное количественное определение, что также объясняет название «иммуноферментный анализ».
Поскольку анализ ИФА выполняется в микротитровых планшетах / 96-луночных планшетах, он известен как метод анализа на основе планшетов и используется, например, в клинической диагностике in vitro, исследованиях, разработке лекарств и т. д. для обнаружения и количественного определения антител, пептидов, белков и гормонов.
Метод ИФА часто используется в качестве диагностического инструмента в медицине, биотехнологиях, патологии растений, а также является важным показателем контроля качества во многих отраслях промышленности.

Ультразвуковая подготовка образцов перед ИФА

Перед проведением ИФА-анализа образцы требуют этапов подготовки, таких как лизис клеток и экстракция внутриклеточных белков, ДНК, РНК и т.д. Преимуществом ультразвукового лизиса клеток и выделения белков является его высокая эффективность, надежность и воспроизводимость. Все эти факторы важны для получения качественной диагностики и результатов исследований

Протокол ультразвукового лизиса клеток перед ИФА

• Для клеточных культур: Перед ультразвуковым лизисом клеток центрифугируйте клетки в течение 5 минут при давлении 270 x g в микроцентрифуге. Удаляют надосадочную жидкость путем аспирации и ресуспендируют клетки в 30 – 100 мкл буфера RIPA. Затем инкубируйте клеточную гранулу на льду в течение 30 минут.
• Теперь образец клетки готов к ультразвуковому лизису:
  Используйте ультразвуковой аппарат зондового типа (например, УП200Хт с зондом S26d2) или ультразвуковое устройство для обработки нескольких образцов (например, VialTweeter для одновременной ультразвука до 10 флаконов или UIP400MPT для микротитровых планшетов / 96-луночных планшетов) в зависимости от количества образцов, которые вам необходимо подготовить.
  Для ультразвуковой обработки одного образца с помощью зонда поместите элементы в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
• Предварительно установите продолжительность ультразвукового исследования, общую потребляемую энергию, режим цикла и/или пределы температуры в цифровом меню ультразвукового аппарата. Это обеспечивает высокую надежность ультразвуковой обработки и повторяемость.
• Вставьте сонотрод и включите ультразвуковой прибор. Осторожно проведите микронаконечник ультразвукового зонда по образцу, чтобы равномерно обработать образец ультразвуком.
  Для большинства клеток ультразвуковой лизис будет завершен после 2-4 циклов ультразвуковой обработки продолжительностью 10 секунд.
• После ультразвуковой обработки извлеките сонотрод из образца. Образцы следует инкубировать на льду в течение 5 минут. Затем центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 20 минут, чтобы измельчить мусор. Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку. Маркируйте аналиты и храните при температуре -20°C.
• Ультразвуковой сонотрод можно очистить, тщательно протерев его спиртом или ультразвуком в стакане, наполненном спиртом, например, 70% этанолом. Все ультразвуковые датчики, изготовленные из титана, являются автоклавируемыми.

• Промойте ткань ледяным PBS (0,01M, pH=7,4) для тщательного удаления избытка гемолизной крови.
• Взвесьте ткани (почки, сердце, легкие, селезенку и т. д.) и размачивайте их на мелкие кусочки, которые гомогенизируются в PBS. Требуемый объем PBS связан с весом ткани. Как правило, для 1 г ткани требуется около 9 мл PBS. Рекомендуется добавить в PBS некоторое количество ингибитора протеазы. (В качестве альтернативы можно использовать RIPA или буфер для гипотонического лизиса, содержащий протеазу и коктейль ингибиторов фосфатазы.)
• В зависимости от размера ткани для предварительной обработки тканей может быть полезно короткое вихревое лечение (около 1-2 мин. в 15-секундных импульсах).
• Установите микронаконечник, например, S26d2, на ультразвуковой аппарат. Поместите пробирку с образцом салфетки в ледяную ванну.
• Ультразвуковой обработкой образца с помощью ультразвукового аппарата, например, UP200St (амплитуда 80%) в течение 1 минуты в импульсном режиме (15 секунд включено, пауза 15 секунд). Держите образец в ледяной бане.
• Затем гомогенаты центрифугируются для получения специфических пулов (цитозольных, ядерных, митохондриальных или лизосомных) с целью обогащения белка для анализа. Путем центрифугирования образца в течение 5 минут при 5000×g извлекается надосадочная жидкость.

Надежный контроль температуры во время ультразвуковой обработки

Температура является решающим фактором, влияющим на процесс, который особенно важен для обработки биологических образцов, например, для предотвращения термической деградации белков. Как и при всех методах механической пробоподготовки, при ультразвуковой обработке выделяется тепло. Тем не менее, температуру образцов можно хорошо контролировать при использовании ультразвуковых аппаратов Hielscher. Мы представляем вам различные варианты мониторинга и контроля температуры ваших образцов во время их подготовки с помощью ультразвукового датчика или предварительного анализа VialTweeter.

1. Контроль температуры образца: Все цифровые ультразвуковые процессоры Hielscher оснащены интеллектуальным программным обеспечением и подключаемым датчиком температуры. Подключите датчик температуры к ультразвуковому прибору (например, УП200Хт, УП200Ст, VialTweeter, Многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP) и вставьте наконечник датчика температуры в одну из пробирок для образца. С помощью цветного цифрового сенсорного дисплея вы можете установить в меню ультразвукового процессора определенный температурный диапазон для обработки образца ультразвуком. Ультразвуковой аппарат автоматически останавливается при достижении максимальной температуры и приостанавливается до тех пор, пока температура образца не снизится до нижнего значения заданного температурного ∆. Затем ультразвуковая обработка начинается автоматически снова. Эта интеллектуальная функция предотвращает деградацию, вызванную нагреванием.
2. Что касается ультразвукового многовыборочного блока VialTweeter, титановый блок, который удерживает пробирки с образцами, может быть предварительно охлажден. Поместите блок VialTweeter (только сонотрод без преобразователя!) в холодильник или морозильную камеру, чтобы предварительно охладить титановый блок помогает отсрочить повышение температуры в образце. Если есть возможность, сам образец также можно предварительно охладить.
3. Используйте ледяную ванну или сухой лед для охлаждения во время ультразвуковой обработки. Поместите пробирку (пробирки) с образцами во время ультразвуковой обработки в ледяную ванну. Для VialTweeter используйте неглубокий лоток, наполненный сухим льдом, и поместите VialTweeter на сухой лед, чтобы тепло могло быстро рассеяться.

Клиенты по всему миру используют ультразвуковые аппараты зондового типа Hielscher, а также многовыборные ультразвуковые установки VialTweeter и UIP400MTP для ежедневной подготовки образцов в биологических, биохимических, медицинских и клинических лабораториях. Благодаря интеллектуальному программному обеспечению и контролю температуры процессоров Hielscher температура надежно контролируется и предотвращается деградация образца, вызванная нагревом. Ультразвуковая пробоподготовка с помощью ультразвуковых решений Hielscher обеспечивает высокую надежность и воспроизводимость!
Узнайте больше о высокопроизводительной ультразвуковой обработке с использованием многолуночного планшетного ультразвукового аппарата UIP400MTP для анализов!