Ультразвуковая подготовка образцов для анализа ELISA

Такие методы анализа, как ELISA, широко применяются для диагностики in vitro, выявления белков, связанных с заболеваниями, и контроля качества (например, мониторинга пищевых аллергенов). Ультразвуковая подготовка образцов – это быстрый, надёжный и воспроизводимый метод лизиса клеток и выделения внутриклеточных белков, ДНК, РНК и органелл. Hielscher Ultrasonics предлагает различные ультразвуковые решения для удобной подготовки отдельных образцов, нескольких флаконов, а также микротитровальных и 96-луночных планшетов.

ELISA – иммуноферментный анализ

ELISA означает иммуноферментный анализ и представляет собой широко используемый метод биохимического анализа, относящийся к категории методов анализа связывания лигандов. При проведении ELISA жидкий образец наносят на неподвижную твёрдую фазу с особыми связывающими свойствами. Обычно неподвижную твёрдую фазу наносят в виде покрытия на поверхность луночного планшета или планшета для ELISA. Затем последовательно добавляют различные жидкие реагенты, проводят инкубацию и промывку, так что в конечном итоге в жидкости, оставшейся в лунке, возникает оптическое изменение (например, окрашивание за счёт продукта ферментативной реакции). Это оптическое изменение позволяет измерить количество определяемого вещества путём так называемого количественного «считывания». Для количественного считывания используют спектрофотометр, флуориметр или люминометр, позволяющий обнаружить и измерить интенсивность прошедшего света. На чувствительность обнаружения влияет усиление сигнала в ходе аналитических реакций. Поскольку ферментативные реакции хорошо изучены и представляют собой надёжные процессы усиления, для формирования сигнала используют ферменты. Ферменты связывают с реагентами для обнаружения в фиксированных пропорциях, что позволяет проводить точное количественное определение и объясняет название «иммуноферментный анализ».
Поскольку анализ ELISA проводят в микротитровальных / 96-луночных планшетах, он относится к планшетным методам анализа и используется, например, в клинической диагностике in vitro, исследованиях, разработке лекарственных препаратов и т. д. для обнаружения и количественного определения антител, пептидов, белков и гормонов.
Метод ELISA часто используется как диагностический инструмент в медицине, биотехнологии и фитопатологии, а также является важным методом контроля качества во многих отраслях промышленности.

Ультразвуковая подготовка образцов перед ELISA

Перед проведением анализа ELISA образцы необходимо подготовить, выполнив такие этапы, как лизис клеток и экстракция внутриклеточных белков, ДНК, РНК и т. д. Преимущество ультразвукового лизиса клеток и выделения белков заключается в высокой эффективности, надёжности и воспроизводимости. Все эти факторы важны для получения высококачественных результатов диагностики и исследований

Протокол ультразвукового лизиса клеток перед ELISA

• Для клеточных культур: Перед ультразвуковым лизисом клеток центрифугируйте клетки в течение 5 мин при 270 x g в микроцентрифуге. Удалите супернатант аспирацией и ресуспендируйте клетки в 30 – 100 μL буфера RIPA. Затем инкубируйте клеточный осадок на льду в течение 30 мин.
• Теперь образец клеток готов к ультразвуковому лизису:
  Используйте ультразвуковой аппарат зондового типа (например, UP200Ht с зондом S26d2) или ультразвуковое устройство для обработки нескольких образцов (например, VialTweeter для одновременной обработки ультразвуком до 10 флаконов или UIP400MPT для микротитровальных / 96-луночных планшетов) в зависимости от количества образцов, которые необходимо подготовить.
  Для обработки ультразвуком отдельного образца с помощью зонда поместите клетки в микроцентрифужные пробирки объёмом 1,5 mL.
• Заранее задайте продолжительность обработки ультразвуком, общее количество вводимой энергии, циклический режим и/или температурные пределы в цифровом меню ультразвукового аппарата. Это обеспечивает высокую надёжность обработки ультразвуком и повторяемость.
• Введите сонотрод в образец и включите ультразвуковое устройство. Осторожно перемещайте микронаконечник ультразвукового зонда внутри образца, чтобы равномерно обработать его ультразвуком.
  Для большинства клеток ультразвуковой лизис завершается после 2–4 циклов обработки ультразвуком по 10 с.
• После обработки ультразвуком извлеките сонотрод из образца. Образцы следует инкубировать на льду в течение 5 мин. Затем центрифугируйте при 10 000 x g в течение 20 мин, чтобы осадить клеточные остатки. Перенесите супернатанты в новую микроцентрифужную пробирку. Промаркируйте анализируемые образцы и храните при -20°C.
• Ультразвуковой сонотрод можно очистить, тщательно протерев его спиртом или обработав ультразвуком в стакане, наполненном спиртом, например 70% этанолом. Все ультразвуковые зонды, изготовленные из титана, допускают автоклавирование.

• Промойте ткань ледяным PBS (0,01M, pH=7,4), чтобы тщательно удалить избыток гемолизированной крови.
• Взвесьте ткань (почки, сердца, лёгкого, селезёнки и т. д.) и измельчите её на небольшие кусочки, которые затем гомогенизируют в PBS. Необходимый объём PBS зависит от массы ткани. Как правило, на 1g ткани требуется примерно 9mL PBS. Рекомендуется добавить в PBS ингибитор протеаз. (В качестве альтернативы можно использовать RIPA или гипотонический буфер для лизиса, содержащий смесь ингибиторов протеаз и фосфатаз.)
• В зависимости от размера ткани для её предварительной обработки может быть полезна кратковременная обработка на вортексе (примерно 1–2 мин импульсами по 15 с).
• Установите микронаконечник, например S26d2, на ультразвуковой аппарат. Поместите пробирку с образцом ткани в ледяную баню.
• Обрабатывайте образец ультразвуком с помощью ультразвукового аппарата, например UP200St (амплитуда 80%), в течение 1 мин в импульсном режиме (15 с работы, 15 с паузы). Держите образец в ледяной бане.
• Затем гомогенаты центрифугируют для получения определённых фракций (цитозольной, ядерной, митохондриальной или лизосомальной) с целью обогащения белком для анализа. После центрифугирования образца в течение 5 минут при 5000×g отбирают супернатант.

Надёжный контроль температуры во время обработки ультразвуком

Температура – важнейший фактор, влияющий на процесс, который особенно важен при обработке биологических образцов, например для предотвращения термического разрушения белков. Как и все механические методы подготовки образцов, обработка ультразвуком сопровождается выделением тепла. Однако при использовании устройств Hielscher Ultrasonics температуру образцов можно эффективно контролировать. Мы предлагаем различные варианты мониторинга и регулирования температуры образцов во время их подготовки перед анализом с помощью ультразвукового аппарата зондового типа или VialTweeter.

1. Мониторинг температуры образца: все цифровые ультразвуковые процессоры Hielscher оснащены интеллектуальным программным обеспечением и подключаемым датчиком температуры. Подключите датчик температуры к ультразвуковому устройству (например, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, ультразвуковому аппарату для многолуночных планшетов UIP400MTP) и поместите наконечник датчика температуры в одну из пробирок с образцами. С помощью цифрового цветного сенсорного дисплея в меню ультразвукового процессора можно задать определённый температурный диапазон для обработки образцов ультразвуком. Ультразвуковой аппарат автоматически остановится при достижении максимальной температуры и будет оставаться в режиме паузы, пока температура образца не снизится до нижнего значения заданного температурного диапазона ∆. Затем обработка ультразвуком автоматически возобновится. Эта интеллектуальная функция предотвращает разрушение под воздействием тепла.
2. В ультразвуковом устройстве для обработки нескольких образцов VialTweeter титановый блок, удерживающий пробирки с образцами, можно предварительно охладить. Поместите блок VialTweeter (только сонотрод без преобразователя!) в холодильник или морозильную камеру: предварительное охлаждение титанового блока помогает отсрочить повышение температуры образца. По возможности сам образец также можно предварительно охладить.
3. Используйте ледяную баню или сухой лёд для охлаждения во время обработки ультразвуком. На время обработки ультразвуком поместите пробирку или пробирки с образцами в ледяную баню. Для VialTweeter используйте неглубокий лоток, наполненный сухим льдом, и установите VialTweeter на сухой лёд, чтобы тепло могло быстро отводиться.

Клиенты по всему миру используют ультразвуковые аппараты зондового типа Hielscher, а также устройства для обработки ультразвуком нескольких образцов VialTweeter и UIP400MTP в своей повседневной работе по подготовке образцов в биологических, биохимических, медицинских и клинических лабораториях. Интеллектуальное программное обеспечение и система регулирования температуры процессоров Hielscher обеспечивают надёжный контроль температуры и предотвращают разрушение образцов под воздействием тепла. Ультразвуковая подготовка образцов с помощью ультразвуковых решений Hielscher обеспечивает высокую надёжность и воспроизводимость результатов!
Узнайте больше о высокопроизводительной обработке ультразвуком с помощью ультразвукового аппарата для многолуночных планшетов UIP400MTP при проведении анализов!