Лизис клеток BL21 методом ультразвука
Клетки BL21 – это штамм кишечной палочки, который широко используется в исследовательских лабораториях, биотехнологиях и промышленном производстве благодаря своей способности экспрессировать белки с высокой эффективностью. Ультразвуковое разрушение клеток, лизис и экстракция белка являются распространенным методом выделения и сбора целевых белков из клеточной внутренней части клеток BL21. Ультразвуковое исследование полностью разрушает клетку и высвобождает все захваченные белки, делая доступным 100% белка.
Клетки BL21 для экспрессии белка
Клетка BL21 представляет собой химически компетентный штамм бактерий E. coli, пригодный для трансформации и высокого уровня экспрессии белка с использованием системы индукции Т7-РНК-полимеразы-IPTG. Клетки BL21 обеспечивают высокоэффективную экспрессию белка любого гена, который находится под контролем промотора Т7. Штамм кишечной палочки BL21(DE3) представляет собой штамм белка на основе РНК-полимеразы Т7 в сочетании с векторами экспрессии на основе промотора Т7 и широко применяется в лабораториях и промышленности для производства рекомбинантных белков. В BL21(DE3) экспрессия гена, кодирующего рекомбинантный белок, транскрибируется хромосомно кодируемой Т7 РНК-полимеразой (T7 RNAP), которая транскрибируется в восемь раз быстрее, чем обычная РНК E. coli. Это делает штамм BL21(DE3) высокоэффективным и превращает его в одну из наиболее предпочтительных клеточных систем экспрессии белка.
Протокол ультразвукового лизиса и экстракции белка из клеток BL21
Клеточный лизис клеток BL21 в основном выполняется с помощью ультразвука в сочетании с лауроилсаркозинатом натрия (также известным как саркосил) в качестве буфера для лизиса. Преимущества ультразвукового разрушения клеток и экстракции белка заключаются в надежности, воспроизводимости, а также в простой, безопасной и быстрой эксплуатации ультразвуковых аппаратов. В приведенном ниже протоколе приведены пошаговые инструкции по ультразвуковому лизису клеток BL21:
- Для удаления белков-шаперонов бактериальные гранулы BL21 ресуспендировали в 50 мл ледяного буфера Sodium Tris-EDTA (STE) (состоящего из 10 мМ Tris-HCL, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl с добавлением 100 мМ PMSF).
- Добавляют 500 мкл лизоцима (10 мг/мл) и инкубируют клетки на льду в течение 15 минут.
- После этого добавляют 500 мкл DTT и 7 мл саркозила (10% (w/v) из состава буфера STE).
- Очень важно, чтобы все буферы для очистки были холодными и постоянно держали образцы на льду. Все этапы очистки по возможности следует проводить в холодном помещении.
- Для ультразвукового лизиса и экстракции белка образцы подвергаются ультразвуковой обработке в Ультразвуковой аппарат VialTweeter MultiSample в течение 4 x 30 секунд при 100% амплитуде с интервалом 2 минуты между каждым ультразвуковым обработкой. В качестве альтернативы, ультразвуковой гомогенизатор зондового типа с микронаконечником, например, УП200Хт с S26d2 (3 x 30 сек, пауза 2 мин. между ультразвуковыми циклами, амплитуда 80%).
- Для дальнейших этапов очистки образцы необходимо держать на льду или хранить при температуре -80°C до дальнейшей обработки.
Ультразвуковой дезинтегратор UP200St с микронаконечником S26d2 для лизиса и экстракции белка
Ультразвуковой лизис с точным контролем температуры
Точный и надежный контроль температуры имеет решающее значение при работе с биологическими образцами. Высокие температуры инициируют термически индуцированную деградацию белка в образцах.
Как и при всех методах механической пробоподготовки, при ультразвуковой обработке выделяется тепло. Тем не менее, температуру образцов можно хорошо контролировать при использовании VialTweeter. Мы представляем вам различные варианты мониторинга и контроля температуры ваших образцов во время их подготовки к анализу с помощью VialTweeter и VialPress.
- Контроль температуры образца: ультразвуковой процессор UP200St, который приводит в действие твитер VialTweeter, оснащен интеллектуальным программным обеспечением и подключаемым датчиком температуры. Подключите датчик температуры к UP200St и вставьте наконечник датчика температуры в одну из пробирок для образцов. С помощью цветного цифрового сенсорного дисплея вы можете установить в меню UP200St определенный температурный диапазон для обработки образца ультразвуком. Ультразвуковой аппарат автоматически останавливается при достижении максимальной температуры и приостанавливается до тех пор, пока температура образца не снизится до нижнего значения заданного температурного ∆. Затем ультразвуковая обработка начинается автоматически снова. Эта интеллектуальная функция предотвращает деградацию, вызванную нагреванием.
- Блок VialTweeter может быть предварительно охлажден. Поместите блок VialTweeter (только сонотрод без преобразователя!) в холодильник или морозильную камеру, чтобы предварительно охладить титановый блок помогает отсрочить повышение температуры в образце. Если есть возможность, сам образец также можно предварительно охладить.
- Используйте сухой лед для охлаждения во время ультразвуковой обработки. Используйте неглубокий поднос, наполненный сухим льдом, и поместите VialTweeter на лед, чтобы тепло могло быстро рассеяться.
Клиенты по всему миру используют VialTweeter и VialPress для ежедневной подготовки образцов в биологических, биохимических, медицинских и клинических лабораториях. Благодаря интеллектуальному программному обеспечению и контролю температуры процессора UP200St температура надежно контролируется и предотвращается деградация образца, вызванная нагревом. Ультразвуковая подготовка образцов с помощью VialTweeter и VialPress обеспечивает высокую надежность и воспроизводимость результатов!
Найдите оптимальный ультразвуковой разрушитель для вашего приложения для лизиса
Hielscher Ultrasonics является многолетним опытным производителем высокопроизводительных ультразвуковых разрушителей клеток и гомогенизаторов для лабораторий, настольных и промышленных систем. Размер бактериальной клеточной культуры, цель исследований или производства, а также объем обрабатываемых клеток в час или день являются важными факторами для выбора подходящего ультразвукового клеточного разрушителя для вашего применения.
Hielscher Ultrasonics предлагает различные решения для одновременной ультразвуковой обработки нескольких образцов (до 10 флаконов с помощью VialTweeter) и массовых образцов (т.е. микротитровальных планшетов? планшетов ELISA с UIP400MTP), а также классические лабораторные ультразвуковые аппараты зондового типа с различными уровнями мощности от 50 до 400 Вт до полностью промышленных ультразвуковых процессоров мощностью до 16 000 Вт на единицу для коммерческого разрушения клеток и экстракции белка в крупном производстве. Все ультразвуковые аппараты Hielscher рассчитаны на работу в режиме 24/7/365 при полной нагрузке. Прочность и надежность являются основными характеристиками наших ультразвуковых аппаратов.
Все цифровые ультразвуковые гомогенизаторы оснащены интеллектуальным программным обеспечением, цветным сенсорным дисплеем и автоматическим протоколированием данных, что делает ультразвуковой аппарат удобным инструментом для работы в лабораториях и производственных помещениях.
Сообщите нам, какие клетки, какой объем, с какой частотой и с какой мишенью вы должны обрабатывать свои биологические образцы. Мы порекомендуем вам наиболее подходящий ультразвуковой дезинтегратор в соответствии с вашими технологическими требованиями.
В таблице ниже приведена приблизительная производительность наших ультразвуковых систем от компактных ручных гомогенизаторов и ультразвуковиков MultiSample до промышленных ультразвуковых процессоров для коммерческого применения:
| Объем партии | Расход | Рекомендуемые устройства |
|---|---|---|
| 96-луночные? микротитровальные планшеты | н.а. | UIP400MTP |
| 10 флаконов объемом от 0,5 до 1,5 мл | н.а. | VialTweeter на UP200St |
| 0от 01 до 250 мл | От 5 до 100 мл/мин | UP50H |
| 0от 01 до 500 мл | От 10 до 200 мл/мин | УП100Ч |
| от 10 до 2000 мл | от 20 до 400 мл/мин | УП200Хт, УП400Ст |
| 0.1 до 20 л | 0от 0,2 до 4 л/мин | УИП2000HDT |
| От 10 до 100 л | От 2 до 10 л/мин | УИП4000HDT |
| н.а. | От 10 до 100 л/мин | UIP16000 |
| н.а. | больше | Кластер UIP16000 |
Свяжитесь с нами!? Спросите нас!
UIP400MTP пластинчатый ультразвуковой аппарат для разрушения ячеек с высокой пропускной способностью в 96-луночных планшетах
ультразвуковой аппарат УП200Хт с микронаконечником 2 мм S26d2 для ультразвуковой обработки небольших образцов
Узнайте больше о том, как вы можете использовать свой ультразвуковой гомогенизатор тканей для эффективного и надежного приготовления буферных растворов!
Факты, которые стоит знать
Бактерии кишечной палочки
Escherichia coli – это тип бактерий, который не образует спор, грамотрицательный и характеризуется формой прямого стержня. Бактерии E.coli присутствуют в окружающей среде, продуктах питания и кишечнике человека и животных. E. coli обычно подвижна с помощью перитрихозных жгутиков, но есть и неподвижные типы. E.coli являются так называемыми факультативно анаэробными хемоорганотрофными организмами, а значит, способны как к дыхательному, так и к ферментативному метаболизму. Большинство видов кишечной палочки являются доброкачественными и выполняют полезные функции в организме, например, подавляют рост вредных видов бактерий, синтезируют витамины и т.д.
Клетки бактерий Escherichia coli так называемого В-типа представляют собой особую категорию штаммов E.coli, которые широко используются в исследованиях для изучения таких механизмов, как чувствительность бактериофагов или системы рестрикции-модификации. Кроме того, бактерии E.coli ценятся как надежная рабочая лошадка для экспрессии белков в биотехнологических и медико-биологических лабораториях. Например, кишечная палочка используется для синтеза таких соединений, как белки и олигосахариды в промышленных масштабах. Благодаря таким специфическим особенностям, как дефицит протеазы, низкая продукция ацетата при высоком уровне глюкозы и повышенная проницаемость, В-клетки E. coli являются наиболее часто используемыми клетками-хозяевами для производства генетически модифицированных белков.
Рекомбинантный белок
Рекомбинантные белки (rProt) приобретают важное значение во многих отраслях, в том числе в химическом производстве, фармацевтике, косметике, медицине человека и животных, сельском хозяйстве, пищевой промышленности, а также в промышленности по переработке отходов.
Производство рекомбинантного белка требует использования системы экспрессии. В качестве экспрессирующих клеточных систем для получения рекомбинантной ДНК могут быть использованы как прокариотические, так и эукариотические клетки. В то время как бактериальные клетки наиболее широко используются для экспрессии белка из-за таких факторов, как низкая стоимость, легкость масштабирования и простые условия среды, млекопитающие, дрожжи, водоросли, насекомые и бесклеточные системы являются признанными альтернативами. Тип белка, функциональная активность, а также требуемый выход экспрессируемого белка влияют на выбор клеточной системы, используемой для экспрессии белка.
Для того, чтобы экспрессировать рекомбинантный белок, конкретная клетка должна быть трансфицирована вектором ДНК, содержащим матрицу рекомбинантной ДНК. Затем клетки, трансфицированные с помощью матрицы, культивируются. Как следствие клеточного механизма, клетки транскрибируют и транслируют интересующий их белок, тем самым производя целевой белок.
Поскольку экспрессируемые белки попадают в клеточный матрикс, клетка должна быть лизирована (разрушена и разрушена) для высвобождения белков. На последующей стадии очистки белок отделяют и очищают.
Первым рекомбинантным белком, используемым в лечении, был рекомбинантный человеческий инсулин в 1982 году. Сегодня во всем мире производится более 170 видов рекомбинантного белка для лечения. Обычно используемые рекомбинантные белки, используемые в медицине, включают, например, рекомбинантные гормоны, интерфероны, интерлейкины, факторы роста, факторы некроза опухолей, факторы свертывания крови, тромболитические препараты и ферменты для лечения основных заболеваний, таких как диабет, карликовость, инфаркт миокарда, застойная сердечная недостаточность, церебральный апоплексия, рассеянный склероз, нейтропения, тромбоцитопения, анемия, гепатит, ревматоидный артрит, астма, болезнь Крона и терапия рака. (ср. Фук В. Фам, в книге «Омиксные технологии и биоинженерия», 2018)
Литература? Литература
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Ультразвуковой аппарат VialTweeter для одновременной ультразвуковой обработки 10 образцов, например, для разрушения клеток BL21
Высокопроизводительный ультразвук! Ассортимент продукции Hielscher охватывает весь спектр от компактных лабораторных ультразвуковых аппаратов и настольных установок до полностью промышленных ультразвуковых систем.