Лизис клеток BL21 с помощью обработки ультразвуком

Клетки BL21 представляют собой штамм E. coli, широко используемый в исследовательских лабораториях, биотехнологии и промышленном производстве благодаря способности высокоэффективно экспрессировать белки. Ультразвуковое разрушение клеток, лизис и экстракция белков – распространённый метод выделения и сбора целевых белков из внутреннего содержимого клеток BL21. Обработка ультразвуком полностью разрушает клетку и высвобождает все заключённые в ней белки, делая доступными 100% белка.

Клетки BL21 для экспрессии белков

BL21 – химически компетентный бактериальный штамм E. coli, подходящий для трансформации и экспрессии белков на высоком уровне с использованием системы индукции T7 РНК-полимераза–IPTG. Клетки BL21 обеспечивают высокоэффективную экспрессию белка любого гена, находящегося под контролем промотора T7. Штамм E. coli BL21(DE3) представляет собой штамм для производства белков на основе РНК-полимеразы T7, используемый в сочетании с экспрессионными векторами на основе промотора T7, и широко применяется в лабораториях и промышленности для производства рекомбинантных белков. В BL21(DE3) экспрессия гена, кодирующего рекомбинантный белок, транскрибируется РНК-полимеразой T7 (T7 RNAP), кодируемой в хромосоме, которая осуществляет транскрипцию в восемь раз быстрее обычной РНК-полимеразы E. coli. Это делает штамм BL21(DE3) высокоэффективным и превращает его в одну из наиболее предпочтительных клеточных систем экспрессии белков.

Протокол ультразвукового лизиса и экстракции белков из клеток BL21

Лизис клеток BL21 чаще всего проводят с помощью обработки ультразвуком в сочетании с лауроилсаркозинатом натрия (также известным как саркозил) в качестве лизирующего буфера. Преимущества ультразвукового разрушения клеток и экстракции белков заключаются в надёжности, воспроизводимости, а также в простоте, безопасности и быстроте работы ультразвуковых устройств. Приведённый ниже протокол содержит пошаговые указания по ультразвуковому лизису клеток BL21:

• Для удаления белков-шаперонов бактериальные осадки BL21 ресуспендировали в 50 ml охлаждённого на льду буфера Sodium Tris-EDTA (STE) (состоящего из 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl с добавлением 100 mM PMSF).
• Затем добавляют 500 ul лизоцима (10 mg/ ml) и инкубируют клетки на льду в течение 15 min.
• После этого добавляют 500 ul DTT и 7 ml саркозила (10% (w/v), приготовленного в буфере STE).
• Необходимо поддерживать все буферы для очистки охлаждёнными на льду и постоянно держать образцы на льду. По возможности все этапы очистки следует проводить в холодной комнате.



• Для ультразвукового лизиса и экстракции белков образцы подвергают обработке ультразвуком с помощью многопробного ультразвукового устройства VialTweeter в течение 4 x 30 sec при амплитуде 100% с интервалом 2 min между обработками ультразвуком. В качестве альтернативы можно использовать ультразвуковой гомогенизатор зондового типа с микронаконечником, например UP200Ht с S26d2 (3 x 30 sec, пауза 2 min. между ультразвуковыми циклами, амплитуда 80%).
• Для последующих этапов очистки образцы необходимо держать на льду или, в качестве альтернативы, хранить при -80°C до дальнейшей обработки.

Ультразвуковой лизис при точном контроле температуры

Точный и надёжный контроль температуры имеет решающее значение при работе с биологическими образцами. Высокие температуры вызывают термическую деградацию белков в образцах.
Как и все механические методы пробоподготовки, обработка ультразвуком выделяет тепло. Однако при использовании VialTweeter температуру образцов можно хорошо контролировать. Мы предлагаем различные способы мониторинга и регулирования температуры образцов при их подготовке к анализу с помощью VialTweeter и VialPress.

1. Мониторинг температуры образца: ультразвуковой процессор UP200St, приводящий в действие VialTweeter, оснащён интеллектуальным программным обеспечением и подключаемым датчиком температуры. Подключите датчик температуры к UP200St и поместите наконечник датчика температуры в одну из пробирок с образцами. С помощью цифрового цветного сенсорного дисплея в меню UP200St можно задать определённый диапазон температур для обработки образца ультразвуком. Ультразвуковое устройство автоматически остановится при достижении максимальной температуры и приостановит работу, пока температура образца не снизится до нижнего значения заданной температуры ∆. Затем обработка ультразвуком автоматически возобновится. Эта интеллектуальная функция предотвращает деградацию, вызванную нагревом.
2. Блок VialTweeter можно предварительно охладить. Поместите блок VialTweeter (только сонотрод без преобразователя!) в холодильник или морозильную камеру: предварительное охлаждение титанового блока помогает отсрочить повышение температуры образца. По возможности сам образец также можно предварительно охладить.
3. Используйте сухой лёд для охлаждения во время обработки ультразвуком. Заполните неглубокий поддон сухим льдом и поместите VialTweeter на лёд, чтобы тепло могло быстро рассеиваться.

Клиенты по всему миру используют VialTweeter и VialPress для ежедневной пробоподготовки в биологических, биохимических, медицинских и клинических лабораториях. Интеллектуальное программное обеспечение и система контроля температуры процессора UP200St обеспечивают надёжный контроль температуры и предотвращают деградацию образцов, вызванную нагревом. Ультразвуковая пробоподготовка с помощью VialTweeter и VialPress обеспечивает высоконадёжные и воспроизводимые результаты!
 

Найдите оптимальный ультразвуковой разрушитель клеток для вашей задачи лизиса

Hielscher Ultrasonics – производитель с многолетним опытом выпуска высокопроизводительных ультразвуковых разрушителей клеток и гомогенизаторов для лабораторий, настольных систем и систем промышленного масштаба. Объём вашей культуры бактериальных клеток, цель исследования или производства и объём клеток, подлежащих обработке за час или день, – важнейшие факторы при выборе подходящего ультразвукового разрушителя клеток для вашей задачи.
Hielscher Ultrasonics предлагает различные решения для одновременной обработки ультразвуком нескольких образцов (до 10 пробирок с помощью VialTweeter) и массовой обработки образцов (например, микротитрационных планшетов / планшетов ELISA с помощью UIP400MTP), а также оборудование от классических лабораторных ультразвуковых устройств зондового типа с различными уровнями мощности от 50 до 400 ватт до полностью промышленных ультразвуковых процессоров мощностью до 16 000 ватт на устройство для коммерческого разрушения клеток и экстракции белков на крупных производствах. Все ультразвуковые устройства Hielscher рассчитаны на работу в режиме 24/7/365 при полной нагрузке. Прочность и надёжность – основные характеристики наших ультразвуковых устройств.
Все цифровые ультразвуковые гомогенизаторы оснащены интеллектуальным программным обеспечением, цветным сенсорным дисплеем и автоматическим протоколированием данных, что делает ультразвуковое устройство удобным рабочим инструментом в лабораториях и на производстве.
Сообщите нам, какие клетки, в каком объёме, с какой частотой и с какой целью вам необходимо обрабатывать в ваших биологических образцах. Мы порекомендуем вам наиболее подходящий ультразвуковой разрушитель клеток с учётом требований вашего процесса.

Приведённая ниже таблица даёт представление о приблизительной производительности обработки наших ультразвуковых систем: от компактных ручных гомогенизаторов и многопробных ультразвуковых устройств до промышленных ультразвуковых процессоров для коммерческого применения:

Литература / Источники

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.