Протокол инактивации коронавируса SARS-CoV-2 с помощью ультразвука

Hielscher VialTweeter — это уникальная ультразвуковая установка для подготовки нескольких образцов, которая используется для инактивации коронавируса SARS-COV-2. VialTweeter позволяет одновременно готовить до 10 флаконов с образцами и, таким образом, является идеальным устройством для массовой обработки образцов.

Инактивация коронавируса SARS-CoV-2 с помощью VialTweeter

После удаления фиксатора монослои трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) перед соскоблением клеток до 1 мл MEM/5% FBS и обрабатывали ультразвуком (3 × 10 секунд при включении, 10 секундах выключения при 100% мощности и амплитуде) с помощью ультразвукового процессора Hielscher UP200St с VialTweeter прикрепление. Надосадочную жидкость осветляли центрифугированием при 3000 × г в течение 10 минут. 

Читайте полный протокол инактивации коронавируса SARS-CoV-2 от Welch et al. (2020) ниже:

Клетки и вирусы

Элементы Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) культивировали в модифицированной минимально необходимой среде (MEM) Eagle с добавлением 10% (v/v) эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). В качестве вируса использовался штамм SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, выделенный PHE из первого кластера пациентов в Великобритании 29/01/2020. Этот вирус был получен в пассаже 1 и использован для исследований инактивации в пассаже 2 или 3.
О реагентах и химических веществах, используемых для инактивации SARS-CoV-2, а также для устранения цитотоксичности реагентов, см. научный отчет Welch et al. (2020).

Инактивация вирусов детергентными средствами – Протокол инактивации коронавируса SARS-CoV-2 от Welch et al. 2020

Инактивация SARS-CoV-2

Для коммерческих продуктов препараты вирусов (жидкость для культивирования тканей, титры в диапазоне от 1 × 10⁶ до 1 × 10⁸ БОЕ/мл) обрабатывали в трех экземплярах реагентами в концентрациях и при времени контакта, рекомендованных в инструкциях производителя по применению, если таковые имеются, или в концентрациях и во времени, специально запрошенных испытательными лабораториями. В тех случаях, когда производитель указывал диапазон концентраций, испытывалось наименьшее соотношение продукта к образцу (т.е. самая низкая рекомендуемая концентрация испытуемого продукта). Реагенты для транспортировки образцов испытывали с использованием соотношения одного объема жидкости для тканевых культур к десяти объемам реагента, если производителем не было указано объемное соотношение жидкости образца к реагенту. Моющие средства, фиксаторы и растворители испытывались в указанных концентрациях в указанные сроки. Все этапы инактивации выполняли при комнатной температуре окружающей среды (18 – 25°С). Для тестирования альтернативных типов образцов вирус вносили в указанную матрицу образца в соотношении 1:9, а затем обрабатывали тест-реагентами, как описано выше. Все эксперименты включали тройной контроль, имитационные обработанные образцы с эквивалентным объемом PBS вместо исследуемого реагента. Сразу после необходимого времени контакта 1 мл обработанного образца обрабатывали с использованием соответствующим образом подобранной фильтрующей матрицы. Удаление реагентов для испытаний на инактивацию проводилось в более крупном формате спин-колонки с использованием спин-колонок Pierce 4 мл для удаления моющих средств (Thermo Fisher) или путем заполнения пустых центрифужных колонок емкостью 10 мл Pierce (Thermo Fisher) биогранулами SM2, Sephacryl S-400HR или Sephadex LH-20 для получения упакованных гранул/смолы объемом 4 мл. Для очистки с использованием фильтров Amicon 2 × 500 мкл образцы очищали с помощью двух центробежных фильтров ранее описанным методом, а затем объединяли вместе. Для формальдегида и формальдегида с удалением глутаральдегида использовали один фильтр объемом образца 1× 500 мкл, ресуспендированный после обработки в 500 мкл PBS и добавленный к 400 мкл MEM/5% FBS. Для инактивации инфицированных однослойные, 12,5 см² колбы с ячейками Vero E6 (2,5 × 10⁶ клетки/колба в 2,5 мл MEM/5% FBS) были инфицированы при MOI 0,001 и инкубировались при 37°C/5% CO₂ в течение 24 часов. Надосадочную жидкость удаляли, а клетки фиксировали с помощью 5 мл формальдегида или формальдегида и глутаральдегида при комнатной температуре в течение 15 или 60 минут. Фиксатор был удален, и монослои были трижды промыты PBS, прежде чем соскоблить ячейки до 1 мл MEM/5% FBS и обработаны ультразвуком (3 × 10 секунд включено, 10 секунд выключено при 100% мощности и амплитуде) с использованием UP200St с насадкой VialTweeter (ультразвуковая технология Hielscher). Надосадочную жидкость осветляли центрифугированием при 3000 × г в течение 10 минут.

Подробная информация о реагенте, используемом для инактивации коронавируса SARS-CoV-2 с помощью ультразвукового VialTweeter по протоколу Welch et al. 2020

Полный протокол, включая использование Hielscher VialTweeter, можно найти здесь:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Сложные ультразвуковые димембраноры и клеточные разрушители

Ультразвуковой аппарат VialTweeter с несколькими образцами — это лишь одно из многих ультразвуковых решений для подготовки образцов в биологических, биохимических и клинических лабораториях. Hielscher Ultrasonics предлагает идеальный ультразвуковой дисмембранор для ваших применений, например, для лизиса клеток, экстракции клеток, гомогенизации тканей, солюбилизации лизата, растворения, дегазации образцов и т. д.
Сообщите нам, сколько образцов вам необходимо обрабатывать в час и день, предпочитаете ли вы прямую или непрямую ультразвук и какова цель ультразвуковой обработки образцов. Мы порекомендуем Вам наиболее подходящий ультразвуковой аппарат для Вашей повседневной работы!
Цифровые ультразвуковые процессоры Hielscher Ultrasonics оснащены интеллектуальным программным обеспечением, автоматической записью данных, простыми опциями предварительной настройки для контроля температуры, продолжительности ультразвука, циклического/импульсного режима, а также подсветкой образца и дистанционным управлением через браузер. Мы стремимся сделать наши ультразвуковые приборы максимально умными, чтобы ваши исследования и рабочая рутина стали максимально удобными и успешными.
Нажмите здесь, чтобы найти больше приложений, включая протоколы ультразвуковой подготовки образцов с помощью VialTweeter!