Протокол инактивации коронавируса SARS-CoV-2 с помощью обработки ультразвуком

Hielscher VialTweeter – уникальное ультразвуковое устройство для подготовки нескольких образцов, используемое для инактивации коронавируса SARS-COV-2. VialTweeter позволяет одновременно подготавливать до 10 флаконов с образцами и поэтому является идеальным устройством для массовой обработки образцов.

Инактивация коронавируса SARS-CoV-2 с помощью VialTweeter

После удаления фиксатора монослои трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), затем клетки соскребали в 1mL MEM/5% FBS и обрабатывали ультразвуком (3 × 10 секунд обработки, 10 секунд паузы при мощности и амплитуде 100%) с помощью ультразвукового процессора Hielscher UP200St с VialTweeter в качестве насадки. Супернатанты осветляли центрифугированием при 3000 × g в течение 10 минут. Полный протокол инактивации коронавируса SARS-CoV-2 по Welch et al. (2020) приведен ниже:

Клетки и вирус

Клетки Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) культивировали в модифицированной минимальной поддерживающей среде Игла (MEM) с добавлением 10% (v/v) фетальной телячьей сыворотки (FCS). Использовали вирус SARS-CoV-2 штамма hCOV-19/England/2/2020, выделенный PHE из первой группы пациентов в Великобритании 29/01/2020. Этот вирус был получен на пассаже 1 и использован для исследований инактивации на пассаже 2 или 3.
Сведения о реагентах и химических веществах, использованных для инактивации SARS-CoV-2, а также об устранении цитотоксичности реагентов приведены в научном отчете Welch et al. (2020).

Инактивация вируса детергентами – протокол инактивации коронавируса SARS-CoV-2 по Welch et al. 2020

Инактивация SARS-CoV-2


Для коммерческих продуктов вирусные препараты (жидкость культуры тканей с титрами от 1 × 10⁶ до 1 × 10⁸ PFU/ml) обрабатывали реагентами в трех повторностях при концентрациях и времени контакта, рекомендованных в инструкциях производителя по применению, если такие инструкции имелись, либо при концентрациях и времени контакта, специально запрошенных испытательными лабораториями. Если производитель указывал диапазон концентраций, испытывали самое низкое соотношение продукта и образца (то есть самую низкую рекомендованную концентрацию испытываемого продукта). Реагенты для пробирок, предназначенных для транспортировки образцов, испытывали при соотношении одного объема жидкости культуры тканей к десяти объемам реагента, если производитель не указывал объемное соотношение жидкости образца и реагента. Детергенты, фиксаторы и растворители испытывали при указанных концентрациях в течение указанного времени. Все этапы инактивации проводили при комнатной температуре (18 – 25°C). Для испытания других типов образцов вирус добавляли в указанную матрицу образца в соотношении 1:9, затем обрабатывали испытываемыми реагентами, как описано выше. Все эксперименты включали контрольные образцы в трех повторностях, подвергнутые имитационной обработке с использованием эквивалентного объема PBS вместо испытываемого реагента. Сразу после необходимого времени контакта 1mL обработанного образца пропускали через соответствующим образом выбранную фильтрационную матрицу. Удаление реагентов для испытания инактивации проводили в центрифужных колонках большего размера, используя колонки для удаления детергентов Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), либо заполняя пустые центрифужные колонки Pierce вместимостью 10mL (Thermo Fisher) материалами SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR или Sephadex LH-20 до получения 4mL упакованных гранул/смолы. Для очистки с помощью фильтров Amicon образцы 2 × 500μl очищали на двух центрифужных фильтрах по ранее описанному методу, затем объединяли. Для удаления формальдегида и формальдегида с глутаральдегидом использовали один фильтр с объемом образца 1× 500μl; после обработки образец ресуспендировали в 500μl PBS и добавляли к 400ul MEM/5% FBS. Для инактивации инфицированных монослоев использовали культуральные флаконы площадью 12,5 cm² с клетками Vero E6 (2,5 × 10⁶ клеток/флакон в 2,5mL MEM/5% FBS), которые заражали при MOI 0,001 и инкубировали при 37°C/5% CO₂ в течение 24 часов. Супернатант удаляли, а клетки фиксировали с помощью 5mL формальдегида либо формальдегида и глутаральдегида при комнатной температуре в течение 15 или 60 минут. Фиксатор удаляли, а монослои трижды промывали PBS, затем клетки соскребали в 1mL MEM/5% FBS и обрабатывали ультразвуком (3 × 10 секунд обработки, 10 секунд паузы при мощности и амплитуде 100%) с помощью UP200St с насадкой VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Супернатанты осветляли центрифугированием при 3000 × g в течение 10 минут.


Сведения о реагенте, использованном для инактивации коронавируса SARS-CoV-2 с помощью ультразвукового устройства VialTweeter согласно протоколу Welch et al. 2020

Полный протокол, включающий использование Hielscher VialTweeter, можно найти здесь:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Современные ультразвуковые дезинтеграторы и устройства для разрушения клеток

Ультразвуковое устройство VialTweeter для одновременной обработки нескольких образцов – лишь одно из многочисленных ультразвуковых решений для подготовки образцов в биологических, биохимических и клинических лабораториях. Hielscher Ultrasonics предлагает идеальный ультразвуковой дезинтегратор для вашей задачи, например лизиса клеток, экстракции из клеток, гомогенизации тканей, солюбилизации лизата, растворения, дегазации образцов и т. д.
Сообщите нам, сколько образцов вам необходимо обрабатывать в час и в день, предпочитаете ли вы прямую или непрямую обработку ультразвуком и какова цель ультразвуковой обработки образцов. Мы порекомендуем вам наиболее подходящее ультразвуковое устройство для вашей повседневной работы!
Цифровые ультразвуковые процессоры Hielscher Ultrasonics оснащены интеллектуальным программным обеспечением, автоматической записью данных, простыми средствами предварительной настройки контроля температуры, продолжительности обработки ультразвуком и циклического/импульсного режима, а также подсветкой образцов и дистанционным управлением через браузер. Мы стремимся сделать наши ультразвуковые устройства максимально интеллектуальными, чтобы ваши исследования и повседневная работа были как можно более удобными и успешными.
Нажмите здесь, чтобы узнать о других применениях, включая протоколы ультразвуковой подготовки образцов с помощью VialTweeter!