Ультразвуковая подготовка образцов C. Elegans

C. elegans, червь-нематода, является широко используемым модельным организмом в биологии. Подготовка образцов перед анализом требует лизиса, экстракции белков и липидов, а также фрагментации РНК, которые можно надежно выполнять посредством обработки ультразвуком. Ультразвуковые устройства для разрушения клеток – надежные, технически совершенные и простые в использовании приборы для быстрой подготовки образцов C. elegans.

Ультразвуковая подготовка образцов C. elegans

Caenorhabditis elegans – круглые черви, широко используемые в исследовательских лабораториях для изучения геномики, биологии развития и заболеваний. Многие гены в геноме C. elegans имеют функциональные аналоги у человека. Поэтому эта нематода является чрезвычайно полезной моделью заболеваний человека. Другие преимущества, обусловливающие широкое использование C. elegans, включают простое и недорогое культивирование на чашках с бактериями (например, E. coli), прозрачность, удобство работы, а также возможность замораживания и длительного хранения червей.
Анализ белков и липидов – стандартные лабораторные процедуры, а ультразвуковая подготовка образцов является общепринятым методом лизиса нематод C. elegans на любой стадии развития (т. е. эмбрионов, личинок L1–L4 и взрослых особей). Поскольку C. elegans также используют в качестве системы экспрессии белков для сверхэкспрессии целевых белков, необходим надежный, воспроизводимый метод лизиса и экстракции белков, обеспечивающий высокий выход белка. Ультразвуковые системы для разрушения клеток и экстракции доступны в виде зондовых гомогенизаторов и ультразвуковых устройств для обработки нескольких образцов. Для удобной подготовки образцов любого объема и в любом количестве Hielscher Ultrasonics предлагает идеальное ультразвуковое устройство для разрушения клеток, подходящее для вашей лабораторной процедуры.

Протоколы ультразвукового разрушения и лизиса C. Elegans

Ультразвуковую гомогенизацию и лизис C. elegans с последующей экстракцией белков и липидов можно выполнять по различным методикам с использованием разных буферов для гомогенизации и лизиса и т. д. Общим для всех протоколов лизиса является необходимость постоянно держать образцы на льду, чтобы предотвратить деградацию белков. Ниже представлены несколько надежных и быстрых протоколов ультразвукового лизиса и экстракции для подготовки высококачественных образцов C. elegans, содержащих белки или липиды.

Преимущества ультразвукового лизиса C. elegans

• надежность
• воспроизводимость
• точный контроль температуры
• надежный контроль процесса
• щадящий метод
• простота применения
• безопасность

Ультразвуковая экстракция белков из образцов C. elegans

Ультразвуковой лизис червей C. elegans и экстракцию белков можно выполнять по различным протоколам. Ниже представлены несколько надежных и быстрых протоколов лизиса, обеспечивающих воспроизводимые результаты экстракции белков.

Быстрое приготовление цитозольного экстракта из червей C. elegans посредством обработки ультразвуком

Следующий протокол позволяет приготовить лизаты C. elegans менее чем за 30 минут.
Сбор C. elegans
Перенесите нужных червей C. elegans в пробирку объемом 1,5ml с фосфатно-солевым буфером (PBS) или смойте их с чашки с помощью 1,5ml PBS. Центрифугируйте в течение 1min при 2000rpm для получения осадка. Постоянно держите образцы на льду.
Затем дважды промойте червей PBS.
После этого дважды промойте червей ddH₂O.
Ресуспендируйте червей как минимум в 500ul буфера для гомогенизации (HB). Теперь образцы червей готовы к ультразвуковому лизису.
Для повышения качества белкового экстракта можно уменьшить бактериальное загрязнение, промывая червей по 5min в PBS и стерильной сверхчистой воде (ddH₂O) или выполнив флотацию в сахарозе. Постоянно держите образцы червей на льду.

Протокол ультразвукового лизиса C. elegans

• Заранее подготовьте ультразвуковое устройство, чтобы ультразвуковой гомогенизатор был готов к использованию (зонд установлен, программа обработки ультразвуком предварительно настроена). 

Если ваше ультразвуковое устройство установлено на штативе, разместите ледяную баню с пробирками с образцами под ультразвуковым зондом и введите ультразвуковой зонд в пробирку объемом 1,5ml.

• Для лизиса C. elegans с помощью UP200St или UP200Ht обработку ультразвуком следует выполнять с использованием микронаконечника (например, зонда S26d2 диаметром 2mm; см. изображение слева) при амплитуде 40% в течение 1sec с паузами по 30sec. Для лизиса C. elegans идеально подходят 5 циклов обработки ультразвуком длительностью по 1 секунде с паузами по 30sec. Если вы выполняете лизис впервые, после каждого импульса можно проверять ход лизиса в небольших аликвотах образца с помощью микроскопа.
• Лизис успешно завершен, когда черви разрушены. Чрезмерная обработка ультразвуком приводит к разрушению ядер, что становится заметно, когда образец становится вязким или пенится. Чтобы предотвратить деградацию образца, при необходимости используйте больше импульсов. Для получения высококачественных белковых экстрактов не увеличивайте продолжительность каждого цикла ультразвукового импульса.
• Осветлите клеточный лизат, центрифугируя подвергнутых ультразвуковому лизису червей при 14 000rpm в течение 10min при 4ºC.
• Затем перенесите супернатант в новую пробирку и подготовьте его к иммунопреципитации или другим анализам.

Примечание о буфере для гомогенизации: приготовьте буфер для гомогенизации для приведенного выше протокола ультразвукового лизиса следующим образом:

Высокопроизводительный лизис C. elegans в 96-луночных планшетах с помощью ультразвукового устройства UIP400MTP для обработки планшетов

Лизис C. elegans (взрослые нематоды)
UIP400MTP: амплитуда 80%, 20 циклов (каждый цикл обработки ультразвуком: 30 sec включено, 30 sec выключено)
Буфер для лизиса:

• Вариант 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Вариант 2) для коиммунопреципитации (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (коктейль ингибиторов протеиназ Complete)

Высокопроизводительная фрагментация ДНК
ДНК C. elegans (взрослых нематод) 200–300bp: ультразвуковое устройство UIP400MTP для обработки планшетов – установите амплитуду 80%, 30 импульсов – каждый по 30sec включено, 30sec выключено

Ультразвуковое устройство UIP400MTP для высокопроизводительной подготовки образцов в планшетах равномерно обрабатывает ультразвуком образцы в многолуночных, микротитрационных и 96-луночных планшетах

Ультразвуковой лизис C. elegans для количественных анализов с аффинной очисткой

Свежие эмбрионы C. elegans (∼2 миллиона на повторность) собирали в трех биологических повторностях путем обработки молодых гермафродитов, несущих яйца, отбеливателем и обрабатывали ультразвуком на льду (цикл: 0,5 s, амплитуда: 40–45%, 5 импульсов за сеанс, 5 сеансов, интервал между сеансами: 30 s; ультразвуковой процессор UP200S с микронаконечником S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) в буфере для лизиса (общий объем: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% глицерина, смесь ингибиторов протеаз, 0,1% заменителя Nonidet P-40). После обработки ультразвуком добавляли заменитель Nonidet P-40 до 1% и инкубировали лизаты при вращении с переворачиванием при 4°C в течение 30 min, после чего центрифугировали при 20 000 × g в течение 20 min при 4°C. Затем осветленный лизат аспирировали, не нарушая верхний липидный слой, и делили пополам, добавляя одну половину к агарозным гранулам с антителами к GFP, а другую – к блокированным контрольным гранулам (40–50 μl). После вращения с переворачиванием при 4°C в течение 60–90 min гранулы однократно промывали буфером для лизиса, содержащим 0,1% заменителя Nonidet P-40, а затем дважды промывали либо буфером I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), либо буфером II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), либо обоими буферами. Для пулл-даунов GFP:MBK-2 проводили два отдельных эксперимента с разными условиями промывки. Белки элюировали путем орбитального встряхивания в 50 μl раствора 6 m мочевины/2 M тиомочевины при комнатной температуре. В экспериментах с пулл-дауном MBK-1::GFP белки элюировали дважды путем встряхивания в 50μl раствора 8 m хлорида гуанидиния при 90°C с последующим осаждением этанолом. Затем элюированные образцы белков подвергали расщеплению в растворе.
(см. Chen et al., 2016)

Ультразвуковая гомогенизация и лизис червей

Для процедуры лизиса C.elegans и экстракции белков для каждого образца собирали 30 000 нематод соответствующей стадии и промывали ледяным S-basal, концентрировали центрифугированием при 1500 rpm в течение 2 min., шесть раз промывали ледяным S-basal для удаления остаточных бактерий, а затем хранили на льду до использования. Для экстракции белков после последней промывки S-basal взрослым червям, несущим яйца, давали сформировать плотный осадок. Затем осадки червей ресуспендировали в 1 ml ледяного буфера для экстракции [20 mM фосфата калия, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, ингибиторы протеаз (Sigma P2714)] и немедленно обрабатывали.
∼30 000 взрослых червей, несущих яйца (что соответствует ∼100 mg влажной массы), обрабатывали ультразвуком на льду с помощью зондового ультразвукового устройства (например, UP50H с микронаконечником MS2) при амплитуде 40% в течение 10 циклов по 3 sec включено, 30 sec выключено, в 1 ml ледяного буфера для экстракции. (см. Baskharan et al. 2012)

Ультразвуковая экстракция липидов из C. elegans

В липидомике, разделе метаболомики, характеризуют и анализируют совокупность липидов биологических систем. C. elegans широко используют в липидомике для изучения взаимодействия метаболических липидов и их влияния на здоровье и продолжительность жизни.
Ультразвуковой лизис и экстракцию используют для высвобождения липидов, таких как сфинголипиды, из эмбрионов, личинок и взрослых червей C. elegans. Обработку ультразвуком используют для приготовления гомогенатов червей и последующей экстракции липидов из образца.
Протокол ультразвуковой экстракции липидов из C. elegans
Разморозьте осадок C. elegans на льду и ресуспендируйте в 0,5 ml сверхчистой воды. Обработайте ультразвуком образцы C. elegans в пробирках объемом 1,5mL, постоянно держа образцы на льду.
Обработку ультразвуком можно выполнять с помощью зондового ультразвукового устройства, такого как UP200Ht, ультразвукового устройства для подготовки образцов VialTweeter (одновременная обработка ультразвуком 10 образцов) или UIP400MTP (для обработки ультразвуком многолуночных планшетов, например 96-луночных). Для ультразвукового лизиса с помощью UP200Ht используйте микронаконечник S26d2. Предварительно задайте циклический режим ультразвуковой обработки в цифровом меню. Установите амплитуду 10% и циклический режим обработки ультразвуком: 20 циклов с импульсами по 2 sec и паузой 30 sec. между ультразвуковыми импульсами.
Перенесите супернатанты в стеклянные пробирки с завинчивающимися крышками. Выполните экстракцию по Фолчу, добавив в каждую стеклянную пробирку 1 ml сверхчистой воды, а затем 6 ml смеси хлороформа/метанола (соотношение = 2:1).
Перемешайте каждую стеклянную пробирку на вортексе 4 раза по 30 sec. Центрифугируйте пробирки при 1 258 x g в течение 15 min (Eppendorf, 5810 R) для дополнительного улучшения разделения фаз. Перенесите нижнюю гидрофобную фракцию в чистую стеклянную пробирку с помощью стеклянной пипетки Пастера. Высушите нижнюю гидрофобную фракцию в потоке азота в азотном испарителе. Храните высушенный осадок в морозильной камере при -80 °C до использования. 


Ультразвуковое приготовление лизатов червей

Лизат червей: червей стадии L4 собирали и трижды промывали буфером M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl и 0,87 mM MgSO₄) для удаления всех бактерий. После удаления максимально возможного количества буфера M9 червей ресуспендировали в буфере для лизиса: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-глицерофосфата, 0,1% (об./об.) Triton X-100, 50 mM фторида натрия, 1 mM ортованадата натрия, 5 mM пирофосфата натрия, 0,2 mM фенилметилсульфонилфторида и ингибитор протеаз. Червей трижды замораживали в жидком азоте и размораживали при 37°C, затем обрабатывали ультразвуком на сухом льду с помощью ультразвукового устройства VialTweeter для одновременной подготовки 10 пробирок с образцами. Обработку ультразвуком выполняли при амплитуде 50% в течение 10 циклов по 2 sec. с паузами 30 sec между ультразвуковыми импульсами. Затем образцы центрифугировали при 12 000 rpm при 4°C в течение 15 min. Супернатант собирали и хранили при -70°C. Аликвоту использовали для количественного определения белка методом Брэдфорда.
Определение общего глутатиона, GSH и GSSG: для количественного определения глутатиона приготовление лизатов и измерение выполняли в один день. Личинок L4, получавших глюкозу, и контрольных личинок собирали и трижды промывали буфером M9. После удаления максимально возможного количества буфера M9 червей ресуспендировали в ледяной метафосфорной кислоте (5% мас./об.), затем обрабатывали ультразвуком на льду с помощью ультразвукового устройства VialTweeter при амплитуде 50% в течение десяти циклов обработки ультразвуком по 2 sec. с паузой 30 sec. между циклами. Затем центрифугировали при 12 000 rpm при 4 ̊C в течение 15 min.
(см. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Подготовка образцов C. elegans перед иммунопреципитацией и вестерн-блоттингом

Вкратце, для получения эмбриональных экстрактов личинок C. elegans стадии L1 выращивали до взрослой стадии в крупномасштабных жидких культурах на среде S. Эмбрионы собирали стандартным методом обработки отбеливателем и суспендировали в буфере для лизиса (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% глицерина, 0,05% NP-40, 1􏰅 коктейля ингибиторов протеаз и 1􏰅 коктейля ингибиторов фосфатаз I и II), быстро замораживали в жидком азоте и лизировали путем ультразвукового разрушения клеток с помощью ультразвукового устройства с микронаконечником, такого как UP200Ht с S26d2, используя 10 импульсов за 10 s при амплитуде 30%. Если необходимо подготовить большее количество образцов, рекомендуются ультразвуковое устройство VialTweeter или ультразвуковое устройство UIP400MTP для обработки нескольких образцов в луночных планшетах. После обработки ультразвуком экстракты предварительно осветляли центрифугированием при 30 000g в течение 20 min при 4°C. Предварительно осветленный экстракт (300µg общего белка) инкубировали с 40µ􏰂g аффинно очищенных антител anti-CDC-25.1 (данное исследование), ковалентно связанных с агарозой с белком A, либо в качестве контроля использовали аналогичное количество кроличьего иммуноглобулина (Ig)G, ковалентно связанного с агарозой с белком A, в общем объеме 200µl буфера для лизиса, содержащего 1% NP-40, добавление которого снижало неспецифическое связывание белков с матрицей. Образцы вращали в течение 1 h при 4°C, гранулы трижды промывали буфером для лизиса и элюировали с помощью 30µl глицина/HCl и 200 mM NaCl, pH 2,2. После иммунопреципитации элюаты разводили в 30µ􏰂l буфера для образцов с SDS, нагревали до 95°C в течение 4 min и обычно наносили 3% общего количества исходного материала и 30% элюатов на SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом с антителами anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) или anti-􏰁β-actin (1:2000). Если экстракты не подвергали иммунопреципитации, такое же количество общего белка из этих экстрактов ресуспендировали в буфере для образцов с SDS, нагревали до 95°C, а затем непосредственно наносили на SDS-PAGE и анализировали методом вестерн-блоттинга. (см. Segref et al. 2020)

Ультразвуковой лизис при точном контроле температуры

Точный и надежный контроль температуры имеет решающее значение при работе с биологическими образцами. Высокие температуры вызывают термическую деградацию белков в образцах.
Как и все механические методы подготовки образцов, обработка ультразвуком сопровождается выделением тепла. Однако при использовании VialTweeter температуру образцов можно хорошо контролировать. Мы представляем различные способы мониторинга и контроля температуры ваших образцов во время их подготовки к анализу с помощью VialTweeter и VialPress.

1. Мониторинг температуры образца: ультразвуковой процессор UP200St, приводящий в действие VialTweeter, оснащен интеллектуальным программным обеспечением и подключаемым датчиком температуры. Подключите датчик температуры к UP200St и поместите наконечник датчика температуры в одну из пробирок с образцами. С помощью цифрового цветного сенсорного дисплея в меню UP200St можно задать определенный диапазон температур для обработки образца ультразвуком. Ультразвуковое устройство автоматически остановится при достижении максимальной температуры и будет оставаться на паузе, пока температура образца не снизится до нижнего значения заданного температурного диапазона ∆. Затем обработка ультразвуком автоматически возобновится. Эта интеллектуальная функция предотвращает деградацию, вызванную нагревом.
2. Блок VialTweeter можно предварительно охладить. Поместите блок VialTweeter (только сонотрод без преобразователя!) в холодильник или морозильную камеру: предварительное охлаждение титанового блока помогает отсрочить повышение температуры образца. По возможности сам образец также можно предварительно охладить.
3. Используйте сухой лед для охлаждения во время обработки ультразвуком. Заполните неглубокий поддон сухим льдом и поместите VialTweeter на сухой лед, чтобы обеспечить быстрый отвод тепла.

Подберите оптимальное ультразвуковое устройство для разрушения клеток для вашей задачи лизиса

Hielscher Ultrasonics – производитель с многолетним опытом изготовления высокопроизводительных ультразвуковых устройств для разрушения клеток и гомогенизаторов для лабораторных, настольных и промышленных систем. Размер вашей бактериальной клеточной культуры, цели исследований или производства и объем клеток, подлежащих обработке за час или день, являются важнейшими факторами при выборе подходящего ультразвукового устройства для разрушения клеток для вашей задачи.
Hielscher Ultrasonics предлагает различные решения для одновременной обработки ультразвуком нескольких образцов (до 10 пробирок), а также массовой обработки образцов (т. е. микротитрационных планшетов / 96-луночных планшетов), классические зондовые лабораторные ультразвуковые устройства различной мощности от 50 до 400 ватт и полностью промышленные ультразвуковые процессоры мощностью до 16 000 ватт на устройство для коммерческого разрушения клеток и экстракции белков на крупных производствах. Все ультразвуковые устройства Hielscher рассчитаны на работу в режиме 24/7/365 при полной нагрузке. Прочность и надежность – основные характеристики наших ультразвуковых устройств.
Все цифровые ультразвуковые гомогенизаторы оснащены интеллектуальным программным обеспечением, цветным сенсорным дисплеем и автоматическим протоколированием данных, что делает ультразвуковое устройство удобным рабочим инструментом в лабораториях и на производстве.
Сообщите нам, какие клетки, в каком объеме, с какой периодичностью и с какой целью вам необходимо обрабатывать в ваших биологических образцах. Мы порекомендуем наиболее подходящее ультразвуковое устройство для разрушения клеток с учетом требований вашего процесса.

Таблица ниже дает представление о приблизительной производительности наших ультразвуковых систем: от компактных ручных гомогенизаторов и ультразвуковых устройств для обработки нескольких образцов до промышленных ультразвуковых процессоров для коммерческого применения: