Ультразвуковая подготовка образцов C. elegans

C. elegans, червь-нематода, является широко используемым модельным организмом в биологии. Подготовка образца перед анализом требует лизиса, экстракции белков и липидов, а также фрагментации РНК, которая может быть надежно выполнена с помощью ультразвуковой обработки. Ультразвуковые клеточные разрушители являются надежными, сложными и простыми в использовании устройствами для быстрой подготовки образцов C. elegans.

Ультразвуковая подготовка образцов C. elegans

C. elegans — это круглые черви, которые широко используются в исследовательских лабораториях для изучения геномики, биологии развития и болезней. Многие гены в геноме C. elegans имеют функциональные аналоги у человека. Таким образом, червь-нематода является чрезвычайно полезной моделью для борьбы с болезнями человека. Другими преимуществами широкого использования C. elegans являются его простое и дешевое выращивание на пластинах, содержащих бактерии (например, кишечную палочку), его прозрачность, удобство в обращении, а также возможность замораживать и хранить червей в течение более длительного периода.
Анализ белков и липидов является обычной процедурой в лабораториях, а ультразвуковая пробоподготовка является признанным методом лизиса нематод C. elegans на всех стадиях развития (т.е. эмбрионов, личинок L1-L4, взрослых особей). Поскольку C. elegans также используется в качестве системы экспрессии белков для сверхэкспрессии целевых белков, требуется надежный, воспроизводимый метод лизиса и экстракции белка, который дает высокие выходы белка. Ультразвуковые системы разрушения и экстракции клеток доступны в виде гомогенизаторов зондового типа и ультразвуковых аппаратов с несколькими образцами. Обеспечивая удобную подготовку образцов и количество образцов любого размера, Hielscher Ultrasonics предлагает идеальный ультразвуковой клеточный разрушитель для вашей лабораторной процедуры.

Протоколы ультразвукового исследования для разрушения и лизиса C. elegans

Ультразвуковая гомогенизация и лизис C. elegans и последующая экстракция белков и липидов могут быть выполнены с использованием различных методик с использованием различных буферов для гомогенизации и лизиса и т.д. Все протоколы лизиса имеют общую черту: образцы должны постоянно находиться на льду, чтобы предотвратить деградацию белка. Ниже мы представляем вам несколько надежных и быстрых протоколов ультразвукового лизиса и экстракции для получения высококачественных образцов C. elegans, содержащих белок или липиды.

Преимущества ультразвукового лизиса C. elegans

• Достоверный
• воспроизводимый
• Точное регулирование температуры
• Надежное управление технологическим процессом
• щадящий метод
• Легко наносится
• Безопасный

Ультразвуковая экстракция белка из образцов C. elegans

Ультразвуковой лизис и экстракция белка червей C. elegans могут быть выполнены с использованием различных протоколов. Ниже мы представляем вам несколько надежных и быстрых протоколов лизиса для воспроизводимых результатов экстракции белка.

Быстрая подготовка цитозольного экстракта червей C. elegans методом ультразвука

С помощью следующего протокола вы можете получить лизаты C. elegans менее чем за 30 минут.
Коллекция C. elegans
Соберите нужных червей C. elegans в тюбик с фосфатным солевым буфером объемом 1,5 мл или промойте их с тарелки 1,5 мл PBS. Центрифуга в течение 1 минуты при 2000 об/мин до гранул. Постоянно держите образцы на льду.
Затем дважды промойте червей PBS.
После этого дважды промойте червей с ddH₂O.
Ресуспендируйте червей в не менее 500 мкл гомогенизационного буфера (HB). Теперь образцы червей готовы к ультразвуковому лизису.
Для повышения качества белкового экстракта вы можете уменьшить бактериальное загрязнение, промывая червей в течение 5 минут каждого в PBS и стерильной, сверхчистой воде (ddH₂О) или провести флоатацию сахарозы. Держите образцы червей постоянно на льду.

Протокол ультразвукового исследования C. elegans Lysis

• Убедитесь, что вы заранее подготовили ультразвуковой аппарат, чтобы ультразвуковой гомогенизатор был готов к использованию (датчик установлен, программа ультразвуковой обработки предварительно настроена).

Если ультразвуковое исследование установлено на стойке, поместите ледяную ванну с пробирками для образцов под ультразвуковой зонд и вставьте ультразвуковой зонд в пробирку объемом 1,5 мл.

• Для лизиса C. elegans с помощью UP200St или UP200HT ультразвуковое исследование следует проводить с помощью микронаконечника (например, 2-миллиметрового зонда S26d2; см. рисунок слева) с амплитудой 40% в течение 1 секунды с 30-секундными паузами между ними. 5 циклов ультразвуковой обработки по 1 секунде с 30-секундными паузами идеально подходят для лизиса C. elegans. Если вы проводите лизис впервые, вы можете проверить прогрессию лизиса в небольших аликвотах образца после каждого импульса с помощью микроскопа.
• Лизис завершается успешно, когда действие червей нарушено. Чрезмерная ультразвуковая обработка приводит к разрушению ядер и становится заметной, когда образец становится вязким или пенится. Чтобы предотвратить ухудшение качества образца, при необходимости используйте больше импульсов. Не стоит увеличивать время каждого ультразвукового импульсного цикла для получения высококачественных белковых экстрактов.
• Очистите лизат клеток путем центрифугирования червей, подвергшихся ультразвуковому лизированию, со скоростью 14 000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4ºC.
• Затем переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и подготовьтесь к иммунопреципитации или другим анализам.

Примечание для гомогенизационного буфера: Подготовьте гомогенизационный буфер для протокола ультразвукового лизиса, описанного выше, следующим образом:

Высокопроизводительный лизис C. elegans в 96-луночных планшетах с использованием ультразвукового аппарата UIP400MTP Plate Sononicator

C. elegans Lysis (взрослые нематоды)
UIP400MTP амплитуда 80%, 20 циклов (каждый цикл ультразвука: 30 сек ВКЛ, 30 сек ВЫКЛ)
Буфер для лизиса:

• Вариант 1) 4% SDS, 0,1 М Трис/HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА
• Вариант 2) для ко-иммунопреципитации (co-IP): 10 мМ Tris HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 0,5 % NP-40 (полный коктейль ингибиторов протеиназы)

Высокопроизводительная фрагментация ДНК
C. elegans (взрослые нематоды) ДНК 200-300.н.: UIP400MTP пластинчатый ультразвуковой аппарат – набор амплитуды 80%, 30 импульсов – каждые 30 секунд включено, 30 секунд выключено

UIP400MTP Plate Sonicator для высокопроизводительной пробоподготовки равномерно обрабатывает образцы ультразвуком в многолуночных, микротитровальных планшетах и 96-луночных планшетах

Ультразвуковой лизис C. elegans для количественного анализа аффинной очистки

Эмбрионы C. elegans (∼2 миллиона на реплику) были свежесобраны в биологической тройке путем обесцвечивания молодых гравидных гермафродитов и обработаны ультразвуком на льду (цикл: 0,5 с, амплитуда: 40–45%, 5 ударов/сеанс, 5 сеансов, интервал между сеансами: 30 с; Ультразвуковой процессор UP200S с микронаконечником S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) в лизисном буфере (общий объем: ∼600 μl; 50 мм Tris-HCl, pH 7,4, 100 мм KCl, 1 мм MgCl2, 1 мм EGTA, 1 мм DTT, 10% глицерин, смесь ингибиторов протеазы, 0,1% заменитель Nonidet P-40). После ультразвуковой обработки в заменитель Nonidet P-40 добавляли до 1% и лизаты инкубировали при вращении головы над хвостом при 4°C в течение 30 мин с последующим центрифугированием при 20 000 × g в течение 20 мин при 4°C. Очищенный лизат затем отсасывали, не нарушая верхний липидный слой, и расщепляли пополам либо на анти-GFP агарозные шарики, либо на заблокированные контрольные шарики (40–50 мкл). После вращения головы над хвостом при 4°C в течение 60–90 мин бусины промывали один раз лизисным буфером, содержащим 0,1% заменителя Nonidet P-40, после чего дважды промывали либо в буфере I (25 мм Tris-HCl, pH 7,4, 300 мм NaCl, 1 мм MgCl2), либо в буфере II (1 мм Tris-HCl, pH 7,4, 150 мм NaCl, 1 мм MgCl2) или и то, и другое. Для вытяжных установок GFP:MBK-2 были проведены два отдельных эксперимента с использованием различных условий промывки. Белки элюировали путем орбитального встряхивания в 50 мкл 6 м мочевины/2 М тиомочевины при комнатной температуре. Для экспериментов MBK-1::GFP по снижению белкам дважды элюировали путем встряхивания в 50 мкл 8 м хлорида гуанидиния при 90°C с последующим осаждением этанола. Затем образцы элочищенного белка расщепляли в растворе.
(ср. Chen et al., 2016)

Ультразвуковая гомогенизация и лизис червя

Для процедуры лизиса C.elegans и экстракции белка 30 000 немотод соответствующей стадии собирали на образец и промывали в ледяном S-базале, концентрировали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 2 минут, шесть раз промывали ледяным S-базалом для удаления остаточных бактерий, а затем хранили на льду до готовности к использованию. Для экстракции белка взрослым червям позволяли сформировать компактную гранулу после последней S-базальной промывки. Затем гранулы червей ресуспендировали в 1 мл ледяного экстракционного буфера [20 мМ фосфата калия, pH 7,4, 2 мМ ЭДТА, 1% Triton-X-100, ингибиторы протеазы (Sigma P2714)] и немедленно обрабатывали.
∼30 000 взрослых червей (что соответствует ∼100 мг живого веса) обрабатывали ультразвуком на льду с помощью ультразвукового аппарата зондового типа (например, UP50H с микронаконечником MS2) с амплитудой 40% в течение 10 циклов по 3 сек вкл, 30 сек с выключением, в 1 мл ледяного экстракционного буфера. (ср. Baskharan et al. 2012)

Ультразвуковая экстракция липидов из C. elegans

В липидомике, разделе метаболомики, характеризуется и анализируется липидный комплемент биологических систем. C. elegans широко используются в липидомике для изучения взаимодействия метаболических липидов и их влияния на здоровье и продолжительность жизни.
Ультразвуковой лизис и экстракция используются для высвобождения липидов, таких как сфинголипиды, из эмбрионов, личинок и взрослых червей C. elegans. Ультразвуковое исследование используется для получения гомогенатов червей и последующего извлечения липидов из образца.
Протокол ультразвуковой экстракции липидов из C. elegans
Разморозьте гранулы C. elegans на льду и снова суспензируйте 0,5 мл ультраводы. 
Ультразвуком нанесите образцы C. elegans в пробирки объемом 1,5 мл, постоянно держа образцы на льду.
Ультразвуковая обработка может быть выполнена с помощью зонда-ультразвукового датчика, такого как УП200Хт, узел ультразвуковой подготовки образцов VialTweeter (одновременная ультразвук 10 сэмплов) или UIP400MTP (для ультразвуковой обработки многолуночных планшетов, таких как 96-луночные планшеты). Для ультразвукового лизиса с помощью UP200Ht используйте микронаконечник S26d2. Предварительно установите режим ультразвукового цикла в цифровом меню. Установите амплитуду 10% и режим цикла ультразвуковой обработки 2 сек импульсов по 20 циклов с паузой 30 сек. между каждым всплеском ультразвуковой пульсации.
Перенесите надосадочную жидкость в стеклянные пробирки с помощью завинчивающейся крышки. 
Выполните экстракцию по Фольчу, добавив 1 мл ультраводы в каждую стеклянную трубку, а затем добавив 6 мл смеси хлороформа/метанола (соотношение = 2:1) в каждую стеклянную трубку.
Сделайте вихревой массаж каждой стеклянной трубки в течение 30 секунд 4 раза. 
Центрифугируйте пробирки при давлении 1 258 x g в течение 15 минут (Eppendorf, 5810 R) для дальнейшего улучшения разделения фаз. 
Перенесите низшую гидрофобную фракцию в чистую стеклянную пробирку с помощью стеклянной пипетки Пастера. 
Нижнюю гидрофобную фракцию высушить под потоком азота в азотном испарителе. 
Храните высушенные гранулы в морозильной камере при температуре -80 °C до использования.

Ультразвуковое приготовление лизатов червей

Лизат червей: червей стадии L4 собирали и трижды промывали буфером M9 (42,26 мМ Na₂HPO₄, 22.04 мМ КН₂Заказ на поставку₄, 85,56 мМ NaCl и 0,87 мМ MgSO₄), чтобы удалить все бактерии. После удаления как можно большего количества буфера М9 червей ресуспендировали в буфере для лизиса: 50 мМ HEPES, 50 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 5 мМ фосфата β-глицерина, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 мМ фторида натрия, 1 мМ ортованадата натрия, 5 мМ пирофосфата натрия, 0,2 мМ фенилметансульфонилфторида и ингибитора протеазы. Червей замораживали в жидком азоте и размораживали при 37°С в течение трех раз, затем червей обрабатывали ультразвуком на сухом льду с помощью ультразвуковой установки VialTweeter для одновременной подготовки 10 пробирок с образцами. Ультразвуковая обработка проводилась с амплитудой 50% в течение 10 циклов по 2 сек с паузой 30 сек между всплесками ультразвука. После этого образцы центрифугировали при 12000 об/мин при 4°C в течение 15 мин. Надосадочную жидкость собирали и хранили при температуре -70°С. Аликвоту использовали для количественного определения белка методом Брэдфорда.
Определение общего глутатиона, GSH и GSSG: для количественного определения глутатиона лизаты и определение проводили в один и тот же день. Личинок L4, получавших глюкозу и контрольных, собирали и промывали буфером M9 три раза. После удаления как можно большего количества буфера M9 червей ресуспендировали в ледяной метафосфорной кислоте (5% по объему), затем червей обрабатывали ультразвуком во льду с помощью ультразвукового VialTweeter с амплитудой 50% в течение десяти циклов ультразвуковой обработки по 2 секунды с паузой в 30 секунд между каждым циклом. После этого центрифугируется при 12000 об/мин при 4 ̊C в течение 15 мин.
(см. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Подготовка образцов C. elegans перед иммунопреципитацией и вестерн-блоттингом

Короче говоря, для получения эмбриональных экстрактов личинки L1 C. elegans выращивали в крупномасштабных жидких культурах S-среды до взрослого возраста. Эмбрионы собирали стандартным методом отбеливания и суспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис, pH 7,5, 100 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ MgCl2, 8,7% глицерина, 0,05% NP-40, 1 Коктейль ингибиторов протеазы и 1 Коктейль ингибиторов фосфатазы I и II), быстро замораживали в жидком азоте и лизировали путем ультразвукового разрушения клеток с использованием ультразвукового аппарата с микронаконечником, такого как УП200Хт с S26d2 для 10 импульсов в течение 10 с с амплитудой 30%. Если необходимо подготовить большее количество образцов, то ультразвуковое исследование VialTweeter или MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP для луночных планшетов. После обработки ультразвуком экстракты предварительно очищали центрифугированием при 30 000 г в течение 20 минут при 4°C. Предварительно очищенный экстракт (300 мкг общего белка) инкубировали с 40 мкл аффинити-очищенного антитела против CDC-25.1 (данное исследование), сшитого с белком А-агарозой, или в качестве контроля использовали аналогичное количество кроличьего иммуноглобулина (Ig)G, сшитого с белком А-агарозой, в общем объеме 200 мкл лизисного буфера, содержащего 1% NP-40, включение которого снижало неспецифическое связывание белков с матриксом. Образцы вращали в течение 1 ч при 4°C, гранулы трижды промывали лизисным буфером и элюировали 30 мкл глицина/HCl и 200 мМ NaCl, pH 2,2. После иммунопреципитации элюаты разводили в 30 мкл буфера для образцов SDS, нагревали до 95°C в течение 4 мин и, как правило, 3% от общего количества на входе и 30% для элюатов наносили на SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом с антителами против CDC-25.1 (1:400), анти-LIN-23 (1:750), анти-убиквитином (1:1000), анти-GSK3��� (1:500) или антителами против анти β-CDC-25.1 (1:2000). В тех случаях, когда экстракты не подвергались иммунопреципитации, то же количество общего белка, полученного из этих экстрактов, ресуспендировали в буфере для образцов SDS, нагревали до 95°C, а затем непосредственно наносили на SDS-PAGE и анализировали с помощью вестерн-блоттинга. (ср. Segref et al. 2020)

Ультразвуковой лизис с точным контролем температуры

Точный и надежный контроль температуры имеет решающее значение при работе с биологическими образцами. Высокие температуры инициируют термически индуцированную деградацию белка в образцах.
Как и при всех методах механической пробоподготовки, при ультразвуковой обработке выделяется тепло. Тем не менее, температуру образцов можно хорошо контролировать при использовании VialTweeter. Мы представляем вам различные варианты мониторинга и контроля температуры ваших образцов во время их подготовки к анализу с помощью VialTweeter и VialPress.

1. Контроль температуры образца: ультразвуковой процессор UP200St, который приводит в действие твитер VialTweeter, оснащен интеллектуальным программным обеспечением и подключаемым датчиком температуры. Подключите датчик температуры к UP200St и вставьте наконечник датчика температуры в одну из пробирок для образцов. С помощью цветного цифрового сенсорного дисплея вы можете установить в меню UP200St определенный температурный диапазон для обработки образца ультразвуком. Ультразвуковой аппарат автоматически останавливается при достижении максимальной температуры и приостанавливается до тех пор, пока температура образца не снизится до нижнего значения заданного температурного ∆. Затем ультразвуковая обработка начинается автоматически снова. Эта интеллектуальная функция предотвращает деградацию, вызванную нагреванием.
2. Блок VialTweeter может быть предварительно охлажден. Поместите блок VialTweeter (только сонотрод без преобразователя!) в холодильник или морозильную камеру, чтобы предварительно охладить титановый блок помогает отсрочить повышение температуры в образце. Если есть возможность, сам образец также можно предварительно охладить.
3. Используйте сухой лед для охлаждения во время ультразвуковой обработки. Используйте неглубокий поднос, наполненный сухим льдом, и поместите VialTweeter на сухой лед, чтобы тепло могло быстро рассеяться.

Найдите оптимальный ультразвуковой клеточный разрушитель для вашего приложения для лизиса

Hielscher Ultrasonics является многолетним опытным производителем высокопроизводительных ультразвуковых разрушителей клеток и гомогенизаторов для лабораторий, настольных и промышленных систем. Размер бактериальной клеточной культуры, цель исследований или производства, а также объем обрабатываемых клеток в час или день являются важными факторами для выбора подходящего ультразвукового клеточного разрушителя для вашего применения.
Hielscher Ultrasonics предлагает различные решения для одновременной ультразвуковой обработки нескольких образцов (до 10 флаконов) и массовых образцов (т.е. микротитровальные планшеты / 96-луночные планшеты), классические лабораторные ультразвуковые аппараты зондового типа с различными уровнями мощности от 50 до 400 Вт до полностью промышленных ультразвуковых процессоров мощностью до 16 000 Вт на единицу для промышленного разрушения клеток и экстракции белка в крупном производстве. Все ультразвуковые аппараты Hielscher рассчитаны на работу в режиме 24/7/365 при полной нагрузке. Прочность и надежность являются основными характеристиками наших ультразвуковых аппаратов.
Все цифровые ультразвуковые гомогенизаторы оснащены интеллектуальным программным обеспечением, цветным сенсорным дисплеем и автоматическим протоколированием данных, что делает ультразвуковой аппарат удобным инструментом для работы в лабораториях и производственных помещениях.
Сообщите нам, какие клетки, какой объем, с какой частотой и с какой мишенью вы должны обрабатывать свои биологические образцы. Мы порекомендуем вам наиболее подходящий ультразвуковой дезинтегратор в соответствии с вашими технологическими требованиями.

В таблице ниже приведена приблизительная производительность наших ультразвуковых систем от компактных ручных гомогенизаторов и ультразвуковиков MultiSample до промышленных ультразвуковых процессоров для коммерческого применения: