Ультразвуковой лизис биоинженерных клеток в промышленном производстве

Биоинженерные виды бактерий, такие как E. coli, а также генетически модифицированные типы клеток млекопитающих и растений широко используются в биотехнологии для экспрессии молекул. Для высвобождения этих синтезированных биомолекул необходим надёжный метод разрушения клеток. Высокопроизводительная обработка ультразвуком – проверенный метод эффективного и надёжного лизиса клеток, который легко масштабируется до высокой производительности. Hielscher Ultrasonics предлагает вам высокопроизводительное ультразвуковое оборудование для эффективного лизиса клеток с целью получения больших объёмов высококачественных биомолекул.

Извлечение молекул из клеточных фабрик

Для производства широкого спектра биомолекул в качестве микробных клеточных фабрик можно использовать различные модифицированные микроорганизмы и растительные клетки, в том числе Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, цианобактерии, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana и водоросли, а также многие другие. Эти клеточные фабрики могут производить белки, липиды, биохимические вещества, полимеры, биотопливо и олеохимические вещества, которые используются в качестве пищевых продуктов или сырья для промышленного применения. Клетки, используемые в качестве клеточных фабрик, культивируются в закрытых биореакторах, где они могут обеспечивать высокую эффективность, специфичность и низкую потребность в энергии.
Для выделения целевых молекул из биоинженерных клеточных культур клетки необходимо разрушить, чтобы высвободить внутриклеточный материал. Ультразвуковые разрушители клеток зарекомендовали себя как высоконадёжное и эффективное средство разрушения клеток и высвобождения соединений.

Микробные клеточные фабрики – это клетки, модифицированные методами метаболической инженерии и используемые для синтеза различных ценных соединений. Ультразвуковое разрушение клеток – эффективный и надёжный метод высвобождения ценных соединений из клеток.
исследование и иллюстрация: ©Villaverde, 2010.

Преимущества ультразвуковых разрушителей клеток

Ультразвуковые разрушители клеток, представляющие собой нетепловую, мягкую и при этом высокоэффективную технологию, используются в лабораториях и промышленности для лизиса клеток и получения высококачественных экстрактов, например для выделения молекул из клеточных фабрик.

Мощный ультразвук для эффективного разрушения микробных клеточных фабрик

Механизм действия и эффекты ультразвуковых разрушителей клеток:
Ультразвуковое разрушение клеток использует энергию ультразвуковых волн. Ультразвуковой гомогенизатор / разрушитель клеток оснащён зондом (также называемым сонотродом) из титанового сплава, который колеблется с высокой частотой около 20 kHz. Это означает, что ультразвуковой зонд передаёт 20 000 колебаний в секунду в обрабатываемую ультразвуком жидкость. Ультразвуковые волны, передаваемые в жидкость, характеризуются чередующимися циклами высокого / низкого давления. Во время цикла низкого давления жидкость расширяется и возникают мельчайшие вакуумные пузырьки. Эти очень маленькие пузырьки растут в течение нескольких чередующихся циклов давления, пока не перестают поглощать дополнительную энергию. В этот момент кавитационные пузырьки резко схлопываются и локально создают среду с чрезвычайно высокой плотностью энергии. Это явление известно как акустическая кавитация и характеризуется локально очень высокими температурами, очень высоким давлением и силами сдвига. Эти сдвиговые напряжения эффективно разрушают клеточные стенки и усиливают массоперенос между внутренним содержимым клетки и окружающим растворителем. Силы сдвига, создаваемые ультразвуком, действуют исключительно механически; они широко используются, и их применение является рекомендуемым методом разрушения бактериальных клеток, а также выделения белков. Как простой и быстрый метод разрушения клеток, обработка ультразвуком идеально подходит для выделения веществ из малых, средних и больших объёмов. Цифровые ультразвуковые аппараты Hielscher оснащены понятным меню настроек для точного управления обработкой ультразвуком. Все данные обработки ультразвуком автоматически сохраняются на встроенной SD-карте и легко доступны. Продуманные возможности отвода тепла, такие как внешнее охлаждение, обработка ультразвуком в импульсном режиме и т. д., во время ультразвукового разрушения обеспечивают поддержание идеальной температуры процесса и тем самым сохранность извлекаемых термочувствительных соединений.

Исследования подтверждают преимущества ультразвукового разрушения клеток и экстракции

Профессор Chemat и соавторы (2017) в своём исследовании подводят итог: «Экстракция с использованием ультразвука – экологичная и экономически жизнеспособная альтернатива традиционным методам для пищевых и натуральных продуктов. Основные преимущества заключаются в сокращении времени экстракции и обработки, количества используемой энергии и растворителей, числа технологических операций и выбросов CO₂ ».
Gabig-Ciminska и соавторы (2014) в своём исследовании использовали гомогенизатор высокого давления и ультразвуковой разрушитель клеток для лизиса спор с целью высвобождения ДНК. Сравнивая оба метода разрушения клеток, исследовательская группа делает следующий вывод о лизисе клеток для получения ДНК спор: «Анализ проводился с использованием клеточных лизатов, полученных гомогенизацией под высоким давлением. Впоследствии мы поняли, что ультразвуковое разрушение клеток имеет выдающиеся преимущества для этой цели. Оно выполняется довольно быстро и может применяться для малых объёмов образцов». (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Биомолекулы из клеточных фабрик для производства пищевых продуктов

Микробные клеточные фабрики – жизнеспособный и эффективный подход к производству, использующий микроорганизмы для получения высоких выходов нативных и ненативных метаболитов посредством метаболической биоинженерии таких микроорганизмов, как бактерии, дрожжи, грибы и т. д. Например, ферменты массового производства получают с использованием микроорганизмов, таких как Aspergillus oryzae, грибы и бактерии. Эти ферменты используются для производства пищевых продуктов и напитков, а также в сельском хозяйстве, биоэнергетике и производстве средств для ухода за домом.
Некоторые бактерии, такие как Acetobacter xylinum и Gluconacetobacter xylinus, производят целлюлозу в процессе ферментации, при котором нановолокна синтезируются по принципу «снизу вверх». Бактериальная целлюлоза (также известная как микробная целлюлоза) химически эквивалентна растительной целлюлозе, но обладает высокой степенью кристалличности и высокой чистотой (не содержит лигнина, гемицеллюлозы, пектина и других биогенных компонентов), а также уникальной структурой трёхмерной (3D) сетки, сплетённой из целлюлозных нановолокон. (см. Zhong, 2020) По сравнению с целлюлозой растительного происхождения бактериальная целлюлоза более экологически устойчива, а получаемая целлюлоза является чистой и не требует сложных этапов очистки. Обработка ультразвуком и экстракция растворителем с использованием NaOH или SDS (додецилсульфата натрия) очень эффективны для выделения бактериальной целлюлозы из бактериальных клеток.

Биомолекулы из клеточных фабрик для производства фармацевтических препаратов и вакцин

Одним из наиболее известных фармацевтических продуктов, получаемых из клеточных фабрик, является человеческий инсулин. Для биоинженерного производства инсулина преимущественно используются E. coli и Saccharomyces cerevisiae. Поскольку биосинтезированные молекулы наноразмеров обладают высокой биосовместимостью, биологические наночастицы, такие как ферритин, имеют преимущества для многочисленных применений в биопроизводстве. Кроме того, производство с использованием микроорганизмов, модифицированных методами метаболической инженерии, часто значительно эффективнее по достигаемому выходу. Например, производство артемизининовой кислоты, ресвератрола и ликопина увеличилось от десятикратного до нескольких сотен раз и уже налажено в промышленном масштабе либо находится на стадии разработки для такого производства. (см. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Например, белковые биомолекулы наноразмеров со свойствами самосборки, такие как ферритин и вирусоподобные частицы, особенно интересны для разработки вакцин, поскольку они имитируют как размер, так и структуру патогенов и допускают конъюгацию антигенов на поверхности для усиления взаимодействия с иммунными клетками. Такие молекулы экспрессируются в так называемых клеточных фабриках (например, модифицированных штаммах E. coli), которые производят определённую целевую молекулу.

Протокол ультразвукового лизиса E. coli BL21 для высвобождения ферритина

Ферритин – белок, основная функция которого заключается в хранении железа. Ферритин демонстрирует перспективные возможности в качестве самособирающихся наночастиц в вакцинах, где он используется как носитель для доставки вакцины (например, шиповидных белков SARS-Cov-2). Научное исследование Sun и соавторов (2016) показывает, что рекомбинантный ферритин может высвобождаться из Escherichia coli в растворимой форме при низких концентрациях NaCl (≤50 mmol/L). Для экспрессии ферритина в E. coli BL21 и его высвобождения был успешно применён следующий протокол. Рекомбинантную плазмиду pET-28a/ferritin ввели путём трансформации в штамм E coli BL21 (DE3). Клетки E coli BL21 (DE3), экспрессирующие ферритин, культивировали в питательной среде LB с 0,5% канамицина при 37°C и при OD600, равной 0,6, индуцировали с помощью 0,4% изопропил-β-D-тиогалактопиранозида в течение 3 часов при 37°C. Затем полученную культуру собирали центрифугированием при 8000g в течение 10 минут при 4°C и собирали осадок. Далее осадок ресуспендировали в среде LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% дрожжевого экстракта)/буфере для лизиса (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) и растворе NaCl различных концентраций (0, 50, 100, 170 и 300 mmol/L) соответственно. Для лизиса бактериальных клеток применяли обработку ультразвуком в импульсном режиме: например, с использованием ультразвукового аппарата UP400St при амплитуде 100% с рабочим циклом: 5 секунд ВКЛ., 10 секунд ВЫКЛ., в течение 40 циклов), а затем центрифугировали при 10 000g в течение 15 минут при 4°C. Супернатант и осадок анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Все гели, окрашенные додецилсульфатом натрия, сканировали с помощью сканера высокого разрешения. Изображения гелей анализировали с помощью программного обеспечения Magic Chemi 1D. Для оптимальной чёткости белковые полосы выявляли путём настройки параметров. Данные для полос получали на основе трёх технических повторов. (см. Sun et al., 2016)

Ультразвуковые разрушители клеток для промышленного лизиса клеточных фабрик

Ультразвуковой лизис и экстракция – надёжный и удобный метод высвобождения метаболитов из клеточных фабрик, способствующий эффективному производству целевых молекул. Ультразвуковые разрушители клеток доступны в исполнениях от лабораторных до промышленных, а процессы можно масштабировать полностью линейно.
Hielscher Ultrasonics – ваш компетентный партнёр в области высокопроизводительных ультразвуковых разрушителей клеток, обладающий многолетним опытом внедрения ультразвуковых систем в настольных установках и промышленных условиях.
Благодаря продуманному аппаратному и программному обеспечению системы разрушения клеток Hielscher Ultrasonics отвечают всем требованиям к оптимальному управлению процессом, простоте эксплуатации и удобству использования. Клиенты и пользователи ультразвуковых аппаратов Hielscher ценят то, что ультразвуковые разрушители клеток и экстракторы Hielscher обеспечивают точный мониторинг и управление процессом – посредством цифрового сенсорного дисплея и дистанционного управления через браузер. Все важные данные обработки ультразвуком (например, полезная энергия, общая энергия, амплитуда, продолжительность, температура, давление) автоматически сохраняются в виде CSV-файла на встроенной SD-карте. Это помогает получать воспроизводимые и повторяемые результаты и облегчает стандартизацию процесса, а также соблюдение надлежащей производственной практики (cGMP).
Разумеется, ультразвуковые процессоры Hielscher рассчитаны на работу 24/7 при полной нагрузке и поэтому могут надёжно эксплуатироваться в условиях промышленного производства. Благодаря высокой прочности и низкой потребности в техническом обслуживании время простоя ультразвукового оборудования действительно мало. Функции CIP (очистка на месте) и SIP (стерилизация на месте) сводят к минимуму трудоёмкую очистку, особенно с учётом того, что все контактирующие с жидкостью части имеют гладкие металлические поверхности (без скрытых отверстий или сопел).

Приведённая ниже таблица даёт представление о приблизительной производительности обработки наших ультразвуковых аппаратов: