Ультразвуковой лизис биоинженерных клеток в промышленном производстве

Биоинженерные виды бактерий, такие как кишечная палочка, а также генетически модифицированные типы клеток млекопитающих и растений широко используются в биотехнологиях для экспрессии молекул. Для того, чтобы высвободить эти синтезированные биомолекулы, требуется надежный метод разрушения клеток. Высокоэффективная ультразвук является проверенным методом эффективного и надежного лизиса клеток – Легко масштабируется до больших пропускных способностей. Hielscher Ultrasonics предлагает вам высокопроизводительное ультразвуковое оборудование для эффективного лизиса клеток с целью производства больших объемов высококачественных биомолекул.

Экстракция молекул из клеточных фабрик

Для производства широкого спектра биомолекул в качестве фабрик микробных клеток могут использоваться различные инженерные микробы и растительные клетки, в том числе Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, цианобактерии, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolitica, Nicotiana benthamiana и водоросли, среди многих других. Эти клеточные фабрики могут производить белки, липиды, биохимикаты, полимеры, биотопливо и олеохимикаты, которые используются в качестве продуктов питания или сырья для промышленного применения. Клетки, используемые в качестве клеточных фабрик, культивируются в закрытых биореакторах, где они могут достичь высокой эффективности, специфичности и низких энергетических требований.
Чтобы выделить молекулы-мишени из биоинженерных клеточных культур, клетки должны быть разрушены таким образом, чтобы высвобождался внутриклеточный материал. Ультразвуковые разрушители клеток хорошо зарекомендовали себя как высоконадежный и эффективный метод дезинтеграции клеток и высвобождения соединений.

Фабрики микробных клеток представляют собой метаболически модифицированные клетки, используемые для синтеза различных ценных соединений. Ультразвуковое разрушение клеток является эффективным и надежным методом высвобождения ценных соединений из внутренней части клетки.
исследование и графика: ©Villaverde, 2010.

Преимущества ультразвуковых разрушителей клеток

Будучи нетермической, мягкой, но высокоэффективной технологией, ультразвуковые разрушители используются в лабораториях и промышленности для лизирования клеток и получения высококачественных экстрактов, например, используемых для выделения молекул из клеточных фабрик.

Мощный ультразвук для эффективного разрушения фабрик микробных клеток

Механизм и действие ультразвуковых разрушителей клеток:
Для ультразвукового разрушения клеток используется сила ультразвуковых волн. Ультразвуковой гомогенизатор / дизраптор ячеек оснащен зондом (он же сонотрод) из титанового сплава, который колеблется с высокой частотой около 20 кГц. Это означает, что ультразвуковой датчик связывает 20 000 колебаний в секунду с обрабатываемой ультразвуком жидкостью. Ультразвуковые волны, связанные с жидкостью, характеризуются чередованием циклов высокого и низкого давления. Во время цикла низкого давления жидкость расширяется, и возникают мельчайшие пузырьки вакуума. Эти очень маленькие пузырьки растут в течение нескольких циклов переменного давления, пока они не смогут поглощать дальнейшую энергию. В этот момент кавитационные пузыри сильно схлопываются и создают локально необычайно энергоемкую среду. Это явление известно как акустическая кавитация и характеризуется локально очень высокими температурами, очень высокими давлениями и силами сдвига. Эти напряжения сдвига эффективно разрушают клеточные стенки и увеличивают массоперенос между внутренней частью клетки и окружающим растворителем. В качестве чисто механического метода широко используются ультразвуковые силы сдвига и рекомендуется процедура для разрушения бактериальных клеток, а также для выделения белков. Являясь простым и быстрым методом разрушения клеток, ультразвуковая обработка идеально подходит для выделения малых, средних и больших объемов. Цифровые ультразвуковые аппараты Hielscher оснащены понятным меню настроек для точного управления ультразвуком. Все данные ультразвука автоматически сохраняются на встроенной SD-карте и легко доступны. Сложные варианты рассеивания тепла, такие как внешнее охлаждение, ультразвуковая обработка в импульсном режиме и т.д. в процессе ультразвукового распада, обеспечивают поддержание идеальной температуры процесса и, таким образом, целостность экстрагированных термочувствительных соединений.

Исследования подчеркивают сильные стороны ультразвукового разрушения и экстракции клеток

Профессор Чемат и др. (2017) резюмируют в своем исследовании, что «ультразвуковая экстракция является экологически чистой и экономически жизнеспособной альтернативой традиционным методам для пищевых продуктов и натуральных продуктов. Основными преимуществами являются сокращение времени экстракции и обработки, количество используемой энергии и растворителей, работа агрегата и CO₂ выбросы».
Gabig-Ciminska et al. (2014) использовали гомогенизатор высокого давления и ультразвуковой динтегратор клеток в своем исследовании лизиса спор с целью высвобождения ДНК. Сравнивая оба метода разрушения клеток, исследовательская группа пришла к выводу, что в отношении лизиса клеток споровой ДНК «анализ был проведен с использованием клеточных лизатов гомогенизации под высоким давлением. Впоследствии мы поняли, что ультразвуковое разрушение клеток имеет выдающиеся преимущества для этой цели. Он довольно быстрый и может быть обработан для небольших объемов образцов». (Габиг-Чиминска и др., 2014)

Биомолекулы из клеточных фабрик для производства продуктов питания

Фабрики микробных клеток являются жизнеспособной и эффективной методологией производства с использованием микробных организмов для получения высоких выходов нативных и ненативных метаболитов путем метаболической биоинженерии микробных микроорганизмов, таких как бактерии, дрожжи, грибы и т. д. Объемные ферменты, например, производятся с использованием таких микроорганизмов, как Aspergillus oryzae, грибов и бактерий. Эти объемные ферменты используются в производстве продуктов питания и напитков, а также в сельском хозяйстве, биоэнергетике и быту.
Некоторые бактерии, такие как Acetobacter xylinum и Gluconacetobacter xylinus, производят целлюлозу в процессе ферментации, где нановолокна синтезируются в процессе «снизу вверх». Бактериальная целлюлоза (также известная как микробная целлюлоза) химически эквивалентна растительной целлюлозе, но она обладает высокой степенью кристалличности и высокой чистотой (не содержит лигнина, гемицеллюлозы, пектина и других биогенных компонентов), а также уникальной структурой трехмерной (3D) сетчатой сетчатой сетки, сплетенной из нановолокна целлюлозы. (ср. Чжун, 2020) По сравнению с целлюлозой растительного происхождения, бактериальная целлюлоза более устойчива, а полученная целлюлоза является чистой, не требующей сложных этапов очистки. Ультразвуковое исследование и экстракция растворителем с использованием NaOH или SDS (додецилсульфата натрия) очень эффективны для выделения бактериальной целлюлозы из бактериальных клеток.

Биомолекулы из клеточных фабрик для производства фармацевтических препаратов и вакцин

Одним из наиболее известных фармацевтических продуктов, получаемых на клеточных фабриках, является человеческий инсулин. Для производства биоинженерного инсулина преимущественно используются E. coli и Saccharomyces cerevisiae. Поскольку биосинтезированные наноразмерные молекулы обладают высокой биосовместимостью, биологические наночастицы, такие как ферритин, являются полезными для многочисленных применений в биопроизводстве. Кроме того, производство метаболически модифицированных микробов часто значительно эффективнее с точки зрения получаемого выхода. Например, производство артемизиновой кислоты, ресвератрола и ликопина увеличилось в десятки – несколько сотен раз, и уже налажено или разрабатывается до промышленных масштабов. (ср. Liu et al.; Микроб. Факт о ячейке. 2017)
Например, наноразмерные биомолекулы на основе белков с самоорганизующимися свойствами, такие как ферритин и вирусоподобные частицы, особенно интересны для разработки вакцин, поскольку они имитируют как размер, так и структуру патогенов и поддаются поверхностной конъюгации антигенов, способствуя взаимодействию с иммунными клетками. Такие молекулы экспрессируются в так называемых клеточных фабриках (например, в сконструированных штаммах E. coli), которые производят определенную молекулу-мишень.

Протокол ультразвукового лизиса и E. coli BL21 для высвобождения ферритина

Ферритин – это белок, основной функцией которого является хранение железа. Ферритин демонстрирует многообещающие способности в качестве самоорганизующихся наночастиц в вакцинах, где он используется в качестве средства доставки вакцин (например, шиповидные белки SARS-Cov-2). Научные исследования Sun et. al. (2016) показывает, что рекомбинантный ферритин может высвобождаться в виде растворимой формы из Escherichia coli при низких концентрациях NaCl (≤50 ммоль/л). Для экспрессии ферритина в E. coli BL21 и высвобождения фертина был успешно применен следующий протокол. Рекомбинантную плазмиду pET-28a/ферритина трансформировали в штамм E. coli BL21 (DE3). Клетки ферритина E. coli BL21 (DE3) культивировали в питательных средах LB с 0,5% канамицина при 37°C и индуцировали при OD600 0,6 с 0,4% изопропил-β-D-тиогалактопиранизида в течение 3 часов при 37°C. Затем окончательную культуру собирали центрифугированием при 8000 г в течение 10 минут при 4°C, и собирали гранулы. Затем гранулу ресуспендировали в среде LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% дрожжевого экстракта)/буфере для лизиса (20 ммоль/л Tris, 50 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л EDTA, pH 7,6) и различных концентрациях раствора NaCl (0, 50, 100, 170 и 300 ммоль/л) соответственно. Для лизиса бактериальных клеток ультразвук применяли в импульсном режиме: например, с помощью метода Ультразвуковой аппарат УП400Ст при 100% амплитуде с рабочим циклом 5 секунд ВКЛ, 10 секунд ВЫКЛ, в течение 40 циклов), а затем центрифугируется при 10 000g в течение 15 минут при 4°C. Надосадочную жидкость и осадок анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Все гели, окрашенные додецилсульфатом натрия, были отсканированы с помощью сканера с высоким разрешением. Изображения геля были проанализированы с помощью программного обеспечения Magic Chemi 1D. Для оптимальной ясности белковые полосы были обнаружены путем корректировки параметров. Данные для полос были получены из технических тройных показателей. (см. Sun et al., 2016)

Ультразвуковые клеточные разрушители для промышленного лизиса клеточных фабрик

Ультразвуковой лизис и экстракция является надежным и удобным методом высвобождения метаболитов из клеточных фабрик, тем самым способствуя эффективному производству целевых молекул. Ультразвуковые разрушители ячеек доступны как в лабораторных, так и в промышленных масштабах, а процессы могут быть масштабированы полностью линейно.
Компания Hielscher Ultrasonics является вашим компетентным партнером в области высокопроизводительных ультразвуковых разрушителей и имеет многолетний опыт в области имплантации ультразвуковых систем в настольных и промышленных условиях.
Когда речь идет о сложном аппаратном и программном обеспечении, системы разрушения ячеек Hielscher Ultrasonics отвечают всем требованиям к оптимальному управлению процессом, простоте эксплуатации и удобству для пользователя. Клиенты и пользователи ультразвуковых аппаратов Hielscher ценят преимущество, которое ультразвуковые разрушители и экстракторы Hielscher обеспечивают для точного мониторинга и управления процессом – с помощью цифрового сенсорного дисплея и пульта дистанционного управления через браузер. Все важные данные ультразвуковой обработки (например, чистая энергия, общая энергия, амплитуда, продолжительность, температура, давление) автоматически сохраняются в виде файла CSV на встроенной SD-карте. Это помогает получить воспроизводимые и воспроизводимые результаты, а также способствует стандартизации процессов, а также выполнению надлежащей производственной практики (cGMP).
Конечно, ультразвуковые процессоры Hielscher рассчитаны на работу в режиме 24/7 при полной нагрузке и поэтому могут надежно эксплуатироваться в условиях промышленного производства. Благодаря высокой прочности и неприхотливости в обслуживании время простоя ультразвукового оборудования действительно невелико. Функции CIP (очистка на месте) и SIP (стерилизация на месте) сводят к минимуму трудоемкость очистки, тем более что все влажные части представляют собой гладкие металлические поверхности (без скрытых отверстий или форсунок).

В таблице ниже приведена примерная производительность обработки наших ультразвуковых аппаратов: