Биоинженерные виды бактерий, такие как E. coli, а также генетически модифицированные типы клеток млекопитающих и растений широко используются в биотехнологии для экспрессии молекул. Чтобы освободить эти синтезированные биомолекулы, требуется надежный метод разрушения клеток. Высокоэффективная ультразвуковая обработка является проверенным методом эффективного и надежного лизиса клеток – легко масштабируется до большой пропускной способности. Hielscher Ultrasonics предлагает вам высокопроизводительное ультразвуковое оборудование для эффективного лизиса клеток с целью получения больших объемов высококачественных биомолекул.

Извлечение молекул из клеточных фабрик

Для производства широкого спектра биомолекул различные инженерные микробы и растительные клетки могут быть использованы в качестве микробных клеточных фабрик, включая Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana и водоросли, среди многих других. Эти клеточные фабрики могут производить белки, липиды, биохимические вещества, полимеры, биотопливо и олеохимические вещества, которые используются в качестве продуктов питания или сырья для промышленного применения. Клетки, используемые в качестве клеточных фабрик, культивируются в закрытых биореакторах, где они могут достичь высокой эффективности, специфичности и низких энергетических требований.
Чтобы изолировать молекулы-мишени из биоинженерных клеточных культур, клетки должны быть разрушены, чтобы внутриклеточный материал высвобождался. Ультразвуковые разрушители клеток хорошо зарекомендовали себя как высоконадежный и эффективный метод распада клеток и высвобождения соединений.

Микробные клеточные фабрики — это метаболически спроектированные клетки, используемые для синтеза различных ценных соединений. Ультразвуковое разрушение клеток является эффективным и надежным методом высвобождения ценных соединений изнутри клетки.
этюд и графика: ©Виллаверде, 2010.

Преимущества ультразвуковых разрушителей клеток

Как нетепловая, мягкая, но высокоэффективная технология, ультразвуковые разрушители используются в лабораториях и промышленности для лизирования клеток и производства высококачественных экстрактов, например, используемых для выделения молекул из клеточных фабрик.

Силовой ультразвук для эффективного разрушения микробных клеточных фабрик

Механизм и эффекты ультразвуковых разрушителей клеток:
Ультразвуковое разрушение клеток использовало силу ультразвуковых волн. Ультразвуковой гомогенизатор / разрушитель ячеек оснащен зондом (он же сонотрод), изготовленным из титанового сплава, который колеблется на высокой частоте около 20 кГц. Это означает, что ультразвуковой зонд соединяет 20 000 вибраций в секунду в ультразвуковую жидкость. Ультразвуковые волны, связанные с жидкостью, характеризуются чередованием циклов высокого давления / низкого давления. Во время цикла низкого давления жидкость расширяется и возникают мельчайшие пузырьки вакуума. Эти очень маленькие пузырьки растут в течение нескольких циклов переменного давления, пока они не смогут поглотить какую-либо дополнительную энергию. В этот момент кавитационные пузырьки сильно взрываются и создают локально необычайно энергоемкую среду. Это явление известно как акустическая кавитация и характеризуется локально очень высокими температурами, очень высоким давлением и силами сдвига. Эти сдвиговые напряжения эффективно разрушают клеточные стенки и увеличивают массоперенос между внутренней частью клетки и окружающим растворителем. В качестве чисто механического метода широко используются ультразвуковые генерируемые силы сдвига и рекомендуемая процедура для разрушения бактериальных клеток, а также для выделения белка. Как простой и быстрый метод разрушения клеток, обработка ультразвуком идеально подходит для изоляции малых, средних и больших объемов. Цифровые ультразвуковые аппараты Hielscher оснащены четким меню настроек для точного управления ультразвуком. Все данные обработки ультразвуком автоматически сохраняются на встроенной SD-карте и просто доступны. Сложные варианты рассеивания тепла, такие как внешнее охлаждение, обработка ультразвуком в режиме пульсации и т. Д. Во время процесса ультразвуковой дезинтеграции, обеспечивают поддержание идеальной температуры процесса и, следовательно, целостность извлеченных термочувствительных соединений.

Исследования подчеркивают сильные стороны ультразвукового разрушения и экстракции клеток

Профессор Chemat et al. (2017) резюмирует в своем исследовании, что «ультразвуковая экстракция является зеленой и экономически жизнеспособной альтернативой традиционным методам для пищевых продуктов и натуральных продуктов. Основными преимуществами являются сокращение времени экстракции и переработки, количество используемой энергии и растворителей, операции на единице и CO.₂ выбросов».
Gabig-Ciminska et al. (2014) использовали гомогенизатор высокого давления и ультразвуковой клеточный дсинтегратор в своем исследовании для лизиса спор с целью высвобождения ДНК. Сравнивая оба метода разрушения клеток, исследовательская группа приходит к выводу, что в отношении лизиса клеток для споровой ДНК «анализ был проведен с использованием лизатов клеток из гомогенизации высокого давления. Впоследствии мы поняли, что ультразвуковое разрушение клеток имеет выдающиеся преимущества для этой цели. Он довольно быстрый и может быть обработан для небольших объемов образцов». (Габиг-Чиминска и др., 2014)

Биомолекулы с клеточных фабрик для производства продуктов питания

Микробные клеточные фабрики являются жизнеспособной и эффективной методологией производства с использованием микробных организмов для получения высоких выходов нативных и ненативных метаболитов путем метаболической биоинженерии микробных микроорганизмов, таких как бактерии, дрожжи, грибы и т. Д. Объемные ферменты, например, производятся с использованием микроорганизмов, таких как Aspergillus oryzae, грибы и бактерии. Эти объемные ферменты используются для производства продуктов питания и напитков, а также в сельском хозяйстве, биоэнергетике и бытовом уходе.
Некоторые бактерии, такие как Acetobacter xylinum и Gluconacetobacter xylinus, производят целлюлозу в процессе ферментации, где нановолокна синтезируются в процессе снизу вверх. Бактериальная целлюлоза (также известная как микробная целлюлоза) химически эквивалентна растительной целлюлозе, но она имеет высокую степень кристалличности и высокую чистоту (без лигнина, гемицеллюлозы, пектина и других биогенных компонентов), а также уникальную структуру целлюлозной нановолокнистой трехмерной (3D) сетчатой сети. (ср. Чжун, 2020) По сравнению с целлюлозой растительного происхождения, бактериальная целлюлоза более устойчива, а полученная целлюлоза является чистой, не требующей сложных этапов очистки. Ультразвук и экстракция растворителем с использованием NaOH или SDS (додецилсульфат натрия) очень эффективны для выделения бактериальной целлюлозы из бактериальных клеток.

Биомолекулы с клеточных фабрик для фармацевтического и вакцинного производства

Одним из наиболее известных фармацевтических продуктов, полученных с клеточных фабрик, является человеческий инсулин. Для биоинженерной выработки инсулина преимущественно используются E. coli и Saccharomyces cerevisiae. Поскольку биосинтезированные наноразмерные молекулы обеспечивают высокую биосовместимость, биологические наночастицы, такие как ферритин, являются выгодными для многочисленных применений биопроизводства. Кроме того, производство метаболически спроектированных микробов часто значительно более эффективно в полученных выходах. Например, производство артемизиновой кислоты, ресвератрола и ликопина увеличилось в десять раз до нескольких сотен и уже налажено или находится в разработке к промышленному производству. (см. Лю и др.; Микроб. Клеточный факт. 2017)
Например, наноразмерные биомолекулы на основе белка с самособирающимися свойствами, такими как ферритин и вирусоподобные частицы, особенно интересны для разработки вакцин, поскольку они имитируют как размер, так и структуру патогенов и поддаются поверхностному конъюгации антигенов для содействия взаимодействию с иммунными клетками. Такие молекулы экспрессируются на так называемых клеточных фабриках (например, инженерных штаммах E. coli), которые производят определенную молекулу-мишень.

Протокол для ультразвукового лизиса и E. coli BL21 для высвобождения ферритина

Ферритин – это белок, основной функцией которого является хранение железа. Ферритин демонстрирует многообещающие возможности в качестве самособирающихся наночастиц в вакцинах, где он используется в качестве средства доставки вакцин (например, спайковые белки SARS-Cov-2). Научные исследования Sun et. al. (2016) показывает, что рекомбинантный ферритин может высвобождаться в виде растворимой формы из кишечной палочки при низких концентрациях NaCl (≤50 ммоль/л). Для того, чтобы экспрессировать ферритин в E. coli BL21 и освободить ферртин, был успешно применен следующий протокол. Рекомбинантная плазмида pET-28a/ферритина трансформировалась в штамм E coli BL21 (DE3). Клетки ферритина E coli BL21 (DE3) культивировали в средах роста LB с 0,5% канамицина при 37°C и индуцировали при OD600 0,6 с 0,4% изопропил-β-D-тиогалакопиранозидом в течение 3 часов при 37°C. Затем окончательную культуру собирали центрифугированием при 8000 г в течение 10 минут при 4°C, и гранулу собирали. Затем гранулу повторно суспендировали в среде LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% дрожжевого экстракта)/буфере лизиса (20 ммоль/л Tris, 50 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л ЭДТА, рН 7,6) и различных концентрациях раствора NaCl (0, 50, 100, 170 и 300 ммоль/л) соответственно. Для бактериального лизиса клеток ультразвук применяли в импульсном режиме: например, с использованием ультразвуковой ореол UP400St при 100% амплитуде с рабочим циклом 5 секунд ON, 10 секунд OFF, в течение 40 циклов), а затем центрифугируют при 10 000g в течение 15 минут при 4°C. Супернатант и осадок анализировали методом электрофореза додецилсульфата натрия полиакриламидного геля (SDS-PAGE). Все гели, окрашенные додецилсульфатом натрия, сканировались сканером высокого разрешения. Изображения геля были проанализированы с помощью программного обеспечения Magic Chemi 1D. Для оптимальной четкости белковые полосы были обнаружены путем корректировки параметров. Данные для диапазонов были сгенерированы из технических трипликаций. (ср. Sun et al., 2016)

Ультразвуковые разрушители клеток для промышленного лизиса клеточных фабрик

Ультразвуковой лизис и экстракция являются надежным и удобным методом высвобождения метаболитов с клеточных фабрик, тем самым способствуя эффективному производству молекул-мишеней. Ультразвуковые разрушители клеток доступны от лабораторных до промышленных размеров, а процессы могут быть масштабированы полностью линейно.
Hielscher Ultrasonics является вашим компетентным партнером по высокопроизводительным ультразвуковым разрушителям и имеет многолетний опыт в области имплантации ультразвуковых систем в настольных и промышленных условиях.
Когда дело доходит до сложного аппаратного и программного обеспечения, системы Hielscher Ultrasonics для разрушения ячеек отвечают всем требованиям для оптимального управления процессом, простоты эксплуатации и удобства для пользователя. Клиенты и пользователи ультразвуковых аппаратов Hielscher ценят то преимущество, что ультразвуковые разрушители и экстракторы клеток Hielscher обеспечивают точный мониторинг и управление процессом – через цифровой сенсорный дисплей и пульт дистанционного управления браузером. Все важные данные обработки ультразвуком (например, чистая энергия, общая энергия, амплитуда, продолжительность, температура, давление) автоматически сохраняются в виде CSV-файла на встроенной SD-карте. Это помогает получить воспроизводимые и воспроизводимые результаты и облегчает стандартизацию процессов, а также выполнение надлежащей производственной практики (cGMP).
Конечно, ультразвуковые процессоры Hielscher созданы для работы 24/7 при полной нагрузке и поэтому могут надежно эксплуатироваться в условиях промышленного производства. Благодаря высокой надежности и низким эксплуатационным расходам время простоя ультразвукового оборудования действительно низкое. Функции CIP (очистка на месте) и SIP (стерилизация на месте) сводят к минимуму трудоемкую очистку, тем более что все влажные детали представляют собой гладкие металлические поверхности (без скрытых отверстий или форсунок).

В приведенной ниже таблице приведена приблизительная производительность наших ультразвуковых аппаратов: