Биосинтетическое производство олигосахаридов грудного молока

Биосинтез олигосахаридов грудного молока (HMOs) посредством ферментации или ферментативных реакций – сложный, требующий ресурсов процесс, часто характеризующийся низким выходом продукта. Обработка ультразвуком усиливает массоперенос между субстратом и клеточными фабриками и стимулирует рост и метаболизм клеток. Тем самым обработка ультразвуком интенсифицирует ферментацию и биохимические процессы, ускоряя производство HMOs и повышая его эффективность.

Олигосахариды грудного молока

Олигосахариды грудного молока (HMOs), также известные как гликаны грудного молока, представляют собой молекулы сахаров, относящиеся к группе олигосахаридов. К наиболее известным примерам HMOs относятся 2’-fucosyllactose (2′-FL), лакто-N-неотетраоза (LNnT), 3’-galactosyllactose (3′-GL) и дифукозиллактоза (DFL).
Хотя грудное молоко человека содержит более 150 различных структур HMO, в настоящее время только 2′-fucosyllactose (2′-FL) и лакто-N-неотетраоза (LNnT) производятся в коммерческих масштабах и используются в качестве питательных добавок в детских молочных смесях.
Олигосахариды грудного молока (HMOs) известны своей значимостью для питания младенцев. Олигосахариды грудного молока – уникальный тип питательных веществ, которые действуют в кишечнике младенца как пребиотики, антимикробные вещества, препятствующие адгезии, и иммуномодуляторы, а также вносят существенный вклад в развитие мозга. HMOs встречаются исключительно в грудном молоке человека; молоко других млекопитающих (например, коров, коз, овец, верблюдов и т. д.) не содержит этих специфических форм олигосахаридов.
Олигосахариды грудного молока являются третьим по содержанию твёрдым компонентом грудного молока и могут присутствовать в воде в растворённой, эмульгированной или взвешенной форме. Лактоза и жирные кислоты – наиболее распространённые твёрдые вещества в грудном молоке. HMOs присутствуют в концентрации 0,35–0,88 унции (9,9–24,9 g)/ L. Известно около 200 структурно различных олигосахаридов грудного молока. У 80% всех женщин преобладающим олигосахаридом является 2′-fucosyllactose, присутствующая в грудном молоке в концентрации приблизительно 2,5 g/ L.
Поскольку HMOs не перевариваются, они не вносят вклада в калорийность питания. Будучи неперевариваемыми углеводами, они действуют как пребиотики и избирательно ферментируются полезной кишечной микрофлорой, особенно бифидобактериями.

Биосинтез олигосахаридов грудного молока

Клеточные фабрики и ферментативные / хемоферментативные системы – современные технологии, используемые для синтеза HMOs. Для производства HMO в промышленных масштабах ферментация с использованием микробных клеточных фабрик, биохимический синтез и различные ферментативные реакции являются практически осуществимыми способами биопроизводства HMO. По экономическим причинам биосинтез с использованием микробных клеточных фабрик в настоящее время является единственным методом, применяемым для промышленного производства HMOs.

Ферментация для получения HMOs с использованием микробных клеточных фабрик

E.coli, Saccharomyces cerevisiae и Lactococcus lactis – широко используемые клеточные фабрики для биопроизводства биологических молекул, таких как HMOs. Ферментация – биохимический процесс, в котором микроорганизмы используются для преобразования субстрата в целевые биологические молекулы. Микробные клеточные фабрики используют в качестве субстрата простые сахара, которые они преобразуют в HMOs. Поскольку простые сахара (например, лактоза) являются доступным в больших количествах и дешёвым субстратом, это обеспечивает экономическую эффективность процесса биосинтеза.
На скорость роста и биоконверсии главным образом влияет массоперенос питательных веществ (субстрата) к микроорганизмам. Скорость массопереноса – один из основных факторов, влияющих на синтез продукта при ферментации. Хорошо известно, что обработка ультразвуком усиливает массоперенос.
Во время ферментации условия в биореакторе необходимо постоянно контролировать и регулировать, чтобы клетки могли расти как можно быстрее и затем производить целевые биомолекулы (например, олигосахариды, такие как HMOs; инсулин; рекомбинантные белки). Теоретически образование продукта начинается, как только клеточная культура начинает расти. Однако, особенно в генетически модифицированных клетках, таких как микроорганизмы, полученные методами генной инженерии, его обычно индуцируют позднее, добавляя в субстрат химическое вещество, которое усиливает экспрессию целевой биомолекулы. Ультразвуковые биореакторы (сонобиореакторы) допускают точное управление и позволяют осуществлять специфическую стимуляцию микроорганизмов. Это приводит к ускорению биосинтеза и повышению выхода продукта.
Ультразвуковой лизис и экстракция: ферментация для получения сложных HMOs может быть ограничена низкими титрами продукта при ферментации и сохранением продуктов внутри клеток. Ультразвуковой лизис и экстракция используются для высвобождения внутриклеточного материала перед очисткой и последующими процессами обработки.

Ферментация, стимулируемая ультразвуком

Скорость роста микроорганизмов, таких как Escherichia coli, E.coli, полученные методами генной инженерии, Saccharomyces cerevisiae и Lactococcus lactis, можно повысить за счёт увеличения скорости массопереноса и проницаемости клеточной стенки путём применения контролируемой низкочастотной обработки ультразвуком. Будучи мягким, нетермическим методом обработки, обработка ультразвуком воздействует на ферментационный бульон исключительно механическими силами.
Акустическая кавитация: принцип действия обработки ультразвуком основан на акустической кавитации. Ультразвуковой зонд (сонотрод) передаёт низкочастотные ультразвуковые волны в среду. Ультразвуковые волны распространяются в жидкости, создавая чередующиеся циклы высокого давления (сжатия) / низкого давления (разрежения). При сжатии и растяжении жидкости в чередующихся циклах возникают мельчайшие вакуумные пузырьки. Эти небольшие вакуумные пузырьки растут в течение нескольких циклов, пока не достигнут размера, при котором уже не могут поглощать дополнительную энергию. В этой точке максимального роста вакуумный пузырёк резко схлопывается и создаёт локальные экстремальные условия, известные как явление кавитации. В кавитационной «горячей точке» могут наблюдаться большие перепады давления и температуры, а также интенсивные сдвиговые силы со струями жидкости со скоростью до 280m/sec. Благодаря этим кавитационным эффектам достигаются интенсивный массоперенос и сонопорация (перфорация клеточных стенок и клеточных мембран). Питательные вещества субстрата переносятся к живым целым клеткам и внутрь них, благодаря чему клеточные фабрики получают оптимальное питание, а скорости роста и преобразования повышаются. Ультразвуковые биореакторы представляют собой простое, но высокоэффективное решение для обработки биомассы в процессе биосинтеза в одном реакторе.
Хорошо известно, что точно контролируемая мягкая обработка ультразвуком интенсифицирует процессы ферментации.
Обработка ультразвуком повышает «производительность многих биопроцессов с участием живых клеток за счёт улучшения поглощения субстрата, усиления производства или роста благодаря повышению пористости клеток и потенциального усиления высвобождения клеточных компонентов». (Naveena et al. 2015)
Узнайте больше о ферментации с применением ультразвука!

Naveena et al. (2015) установили, что ультразвуковая интенсификация даёт ряд преимуществ при биотехнологической обработке, включая низкие эксплуатационные затраты по сравнению с другими вариантами обработки для повышения эффективности, простоту эксплуатации и умеренные требования к мощности.

Высокопроизводительные ультразвуковые реакторы для ферментации

В процессах ферментации участвуют живые микроорганизмы, такие как бактерии или дрожжи, которые действуют как клеточные фабрики. Хотя обработка ультразвуком применяется для усиления массопереноса и повышения скорости роста микроорганизмов и преобразования субстрата, крайне важно точно контролировать интенсивность ультразвука, чтобы избежать разрушения клеточных фабрик.
Hielscher Ultrasonics специализируется на проектировании, производстве и распространении высокопроизводительных ультразвуковых аппаратов, параметры которых можно точно контролировать и отслеживать для обеспечения превосходного выхода продукта при ферментации.

Управление процессом не только необходимо для высокого выхода продукта и превосходного качества, но и позволяет повторять и воспроизводить результаты. Особенно при стимуляции клеточных фабрик адаптация параметров обработки ультразвуком к специфике клеток необходима для достижения высокого выхода продукта и предотвращения деградации клеток. Поэтому все цифровые модели ультразвуковых аппаратов Hielscher оснащены интеллектуальным программным обеспечением, которое позволяет настраивать, отслеживать и корректировать параметры обработки ультразвуком. Такие параметры ультразвукового процесса, как амплитуда, температура, давление, продолжительность обработки ультразвуком, коэффициенты заполнения импульсов и подводимая энергия, необходимы для стимулирования производства HMO посредством ферментации.
Интеллектуальное программное обеспечение ультразвуковых аппаратов Hielscher автоматически записывает все важные параметры процесса на встроенную SD-карту. Автоматическая регистрация данных процесса обработки ультразвуком служит основой для стандартизации процесса и воспроизводимости / повторяемости, которые необходимы для соблюдения надлежащей производственной практики (GMP).

Ультразвуковые реакторы для ферментации

Hielscher предлагает ультразвуковые зонды различных размеров, длины и геометрии, которые можно использовать как для периодической, так и для непрерывной проточной обработки. Ультразвуковые реакторы, также известные как сонобиореакторы, доступны для любых объёмов и охватывают ультразвуковую биотехнологическую обработку от небольших лабораторных образцов до пилотного и полномасштабного коммерческого производства.
Хорошо известно, что расположение ультразвукового сонотрода в реакционном сосуде влияет на распределение кавитации и микропотоков в среде. Сонотрод и ультразвуковой реактор следует выбирать в соответствии с обрабатываемым объёмом клеточного бульона. Хотя обработку ультразвуком можно проводить как в периодическом, так и в непрерывном режиме, для больших производственных объёмов рекомендуется использовать установку непрерывного потока. При прохождении через ультразвуковую проточную ячейку вся клеточная среда подвергается совершенно одинаковому воздействию ультразвука, что обеспечивает наиболее эффективную обработку. Широкий ассортимент ультразвуковых зондов и реакторов с проточными ячейками Hielscher Ultrasonics позволяет собрать идеальную установку для ультразвуковой биотехнологической обработки.

Hielscher Ultrasonics – от лаборатории к пилотным установкам и производству

Hielscher Ultrasonics охватывает весь спектр ультразвукового оборудования, предлагая компактные ручные ультразвуковые гомогенизаторы для подготовки образцов, настольные и пилотные системы, а также мощные промышленные ультразвуковые установки, которые с лёгкостью перерабатывают за час объёмы, соответствующие грузам нескольких грузовиков. Благодаря универсальности и гибкости вариантов установки и монтажа ультразвуковые аппараты Hielscher легко интегрируются в любые типы реакторов периодического действия, системы периодического действия с подпиткой или установки непрерывной проточной обработки.
Различные принадлежности, а также детали, изготовленные на заказ, позволяют идеально адаптировать вашу ультразвуковую установку к требованиям вашего процесса.
Ультразвуковые процессоры Hielscher, рассчитанные на работу 24/7 при полной нагрузке и в тяжёлом режиме в сложных условиях, надёжны и требуют лишь небольшого объёма технического обслуживания.
Приведённая ниже таблица даёт представление о приблизительной производительности обработки наших ультразвуковых аппаратов: