Биосинтетическое производство олигосахаридов грудного молока
Биосинтез олигосахаридов грудного молока (ОГМ) путем ферментации или ферментативных реакций является сложным, трудоемким и часто малопродуктивным процессом. Ультразвуковое исследование увеличивает массоперенос между субстратом и клеточными фабриками, а также стимулирует рост и метаболизм клеток. Таким образом, ультразвуковая обработка интенсифицирует ферментацию и биохимические процессы, что приводит к ускоренному и более эффективному производству ОГМ.
олигосахариды грудного молока
Олигосахариды грудного молока (ОГМ), также известные как гликаны грудного молока, представляют собой молекулы сахара, входящие в группу олигосахаридов. Яркими примерами ОГМ являются 2'-фукозиллактоза (2′-FL), лакто-N-неотетраозу (LNnT), 3'-галактозиллактозу (3′-GL) и дифукозиллактозы (DFL).
В то время как грудное молоко человека состоит из более чем 150 различных структур ОГМ, только 2'-фукозиллактоза (2'-FL) и лакто-N-неотетраоза (LNnT) в настоящее время производятся на коммерческом уровне и используются в качестве пищевых добавок в детских смесях.
Олигосахариды грудного молока (ОГМ) известны своей значимостью в детском питании. Олигосахариды грудного молока являются уникальным типом питательных веществ, которые действуют как пребиотики, антиадгезивные противомикробные препараты и иммуномодуляторы в кишечнике младенца и вносят существенный вклад в развитие мозга. ОГМ содержатся исключительно в грудном молоке человека; Другие виды молока млекопитающих (например, коровьи, козьи, овечьи, верблюжьи и т.д.) не содержат этих специфических форм олигосахаридов.
Олигосахариды грудного молока являются третьим по распространенности твердым компонентом в грудном молоке, который может присутствовать в воде в растворенной, эмульгированной или взвешенной форме. Лактоза и жирные кислоты являются наиболее распространенными твердыми веществами, содержащимися в грудном молоке. ОГМ присутствуют в концентрации 0,35–0,88 унций (9,9–24,9 г)/л. Известно около 200 структурно различных олигосахаридов грудного молока. Доминирующим олигосахаридом у 80% всех женщин является 2′-фукозиллактоза, которая присутствует в грудном молоке человека в концентрации примерно 2,5 г/л.
Поскольку ОГМ не перевариваются, они не вносят калорийного вклада в питание. Будучи неперевариваемыми углеводами, они действуют как пребиотики и избирательно ферментируются желательной микрофлорой кишечника, особенно бифидобактериями.
- способствуют развитию младенцев
- важны для развития мозга
- обладает противовоспалительными и
- противоадгезивное действие в желудочно-кишечном тракте
- поддерживает иммунную систему у взрослых
Биосинтез олигосахаридов грудного молока
Клеточные фабрики и ферментативные/хемоферментативные системы являются современными технологиями, используемыми для синтеза ОГМ. Для производства ОГМ в промышленных масштабах возможными способами биопроизводства ОГМ являются ферментация фабрик микробных клеток, биохимический синтез и различные ферментативные реакции. По экономическим причинам биосинтез с помощью фабрик микробных клеток в настоящее время является единственным методом, используемым на уровне промышленного производства ОГМ.
Ферментация ОГМ с использованием фабрик микробных клеток
E.coli, Saccharomyces cerevisiae и Lactococcus lactis являются широко используемыми клеточными фабриками, используемыми для биопроизводства биологических молекул, таких как ОГМ. Ферментация — это биохимический процесс с использованием микроорганизмов для превращения субстрата в целевые биологические молекулы. Фабрики микробных клеток используют простые сахара в качестве субстрата, которые они превращают в ОГМ. Поскольку простые сахара (например, лактоза) являются распространенным и дешевым субстратом, это делает процесс биосинтеза экономически эффективным.
На рост и скорость биоконверсии в основном влияет массоперенос питательных веществ (субстрата) к микроорганизмам. Скорость массопереноса является основным фактором, влияющим на синтез продукта в процессе брожения. Хорошо известно, что ультразвук способствует массопереносу.
Во время ферментации условия в биореакторе должны постоянно контролироваться и регулироваться, чтобы клетки могли расти как можно быстрее, чтобы затем производить целевые биомолекулы (например, олигосахариды, такие как ОГМ; инсулин; рекомбинантные белки). Теоретически формирование продукта начинается, как только клеточная культура начинает расти. Однако, особенно в генетически модифицированных клетках, таких как модифицированные микроорганизмы, он обычно индуцируется позже путем добавления химического вещества в субстрат, которое усиливает экспрессию целевой биомолекулы. Ультразвуковые биореакторы (соно-биореакторы) могут быть точно управляемы и позволяют проводить специфическую стимуляцию микробов. Это приводит к ускоренному биосинтезу и повышению урожайности.
Ультразвуковой лизис и экстракция: ферментация сложных ОГМ может быть ограничена низкими титрами ферментации и продуктами, остающимися внутриклеточными. Ультразвуковой лизис и экстракция используются для высвобождения внутриклеточного материала перед очисткой и последующими процессами.
Ферментация под ультразвуковым давлением
Скорость роста таких микробов, как кишечная палочка, модифицированная кишечная палочка, Saccharomyces cerevisiae и Lactococcus lactis, может быть ускорена за счет увеличения скорости массопереноса и проницаемости клеточной стенки путем применения контролируемого низкочастотного ультразвука. Как мягкий, нетермический метод обработки, ультразвук прикладывает чисто механические силы к ферментационному бульону.
Акустическая кавитация: Принцип работы ультразвуковой обработки основан на акустической кавитации. Ультразвуковой зонд (сонотрод) связывает низкочастотные ультразвуковые волны со средой. Ультразвуковые волны проходят через жидкость, создавая чередующиеся циклы высокого давления (сжатие) и низкого давления (разрежение). При сжатии и растяжении жидкости в чередующихся циклах возникают мельчайшие пузырьки вакуума. Эти маленькие вакуумные пузырьки растут в течение нескольких циклов, пока не достигнут размера, при котором они не смогут поглощать дальнейшую энергию. В этой точке максимального роста вакуумный пузырь сильно схлопывается и создает локально экстремальные условия, известные как явление кавитации. В кавитационной «горячей точке» наблюдаются высокие перепады давления и температуры, а также интенсивные силы сдвига со струями жидкости до 280 м/сек. С помощью этих кавитационных эффектов достигается тщательный массоперенос и сонопорация (перфорация клеточных стенок и клеточных мембран). Питательные вещества субстрата плавают в живые целые клетки и проникают в них, так что клеточные фабрики получают оптимальное питание и ускоряют рост, а также скорость конверсии. Ультразвуковые биореакторы представляют собой простую, но высокоэффективную стратегию переработки биомассы в процессе биосинтеза в одном котле.
Хорошо известно, что точно контролируемая, мягкая ультразвук интенсифицирует процессы брожения.
Ультразвуковая обработка повышает «продуктивность многих биопроцессов с участием живых клеток за счет улучшения поглощения субстрата, увеличения производства или роста за счет увеличения пористости клеток и потенциально усиленного высвобождения клеточных компонентов». (Навина и др. 2015)
Узнайте больше о ферментации с помощью ультразвука!
- Повышенная урожайность
- Ускоренное брожение
- Клеточно-специфическая стимуляция
- Улучшенное впитывание подложки
- Повышенная пористость клеток
- Простота в эксплуатации
- Безопасный
- Простое дооснащение
- Линейное масштабирование вверх
- Пакетная обработка или обработка InIine
- Быстрая окупаемость инвестиций
Naveena et al. (2015) обнаружили, что ультразвуковая интенсификация имеет ряд преимуществ при биообработке, включая низкие эксплуатационные расходы по сравнению с другими вариантами усовершенствования обработки, простоту эксплуатации и скромные требования к мощности.
Высокопроизводительные реакторы ультразвукового брожения
В процессах ферментации участвуют живые микроорганизмы, такие как бактерии или дрожжи, которые функционируют как клеточные фабрики. В то время как ультразвуковая обработка применяется для стимулирования массопереноса и увеличения скорости роста и преобразования микроорганизмов, крайне важно точно контролировать интенсивность ультразвука, чтобы избежать разрушения клеточных фабрик.
Компания Hielscher Ultrasonics специализируется на разработке, производстве и распространении высокопроизводительных ультразвуковых аппаратов, которые можно точно контролировать и контролировать для обеспечения превосходного выхода ферментации.
Управление процессом не только необходимо для получения высоких выходов и превосходного качества, но и позволяет повторять и воспроизводить результаты. Особенно когда речь идет о стимуляции клеточных фабрик, специфическая для клеток адаптация параметров ультразвука имеет важное значение для достижения высоких выходов и предотвращения деградации клеток. Поэтому все цифровые модели ультразвуковиков Hielscher оснащены интеллектуальным программным обеспечением, которое позволяет настраивать, контролировать и пересматривать параметры ультразвука. Ультразвуковые технологические параметры, такие как амплитуда, температура, давление, продолжительность ультразвука, рабочие циклы и поступление энергии, имеют важное значение для стимулирования производства ОГМ путем ферментации.
Интеллектуальное программное обеспечение ультразвуковых аппаратов Hielscher автоматически записывает все важные параметры процесса на встроенную SD-карту. Автоматическая запись данных процесса ультразвуковой обработки является основой для стандартизации процесса и воспроизводимости/повторяемости, которые необходимы для надлежащей производственной практики (GMP).
Ультразвуковые ректоры для брожения
Hielscher предлагает ультразвуковые преобразователи различных размеров, длины и геометрии, которые могут использоваться как для периодической, так и для непрерывной проточной обработки. Ультразвуковые реакторы, также известные как соно-биореакторы, доступны для любого объема, охватывающего ультразвуковую биообработку, от небольших лабораторных образцов до пилотного и полностью коммерческого уровня производства.
Хорошо известно, что расположение ультразвукового сонотрода в реакционном сосуде влияет на распределение кавитации и микропотока в среде. Сонотродный и ультразвуковой реактор следует выбирать в соответствии с объемом обработки клеточного бульона. В то время как ультразвуковая обработка может выполняться как в периодическом, так и в непрерывном режиме, для больших объемов производства рекомендуется использовать установку непрерывного действия. Проходя через ультразвуковую проточную ячейку, вся клеточная среда подвергается точно такому же воздействию ультразвука, что обеспечивает максимально эффективное лечение. Широкий ассортимент ультразвуковых зондов и реакторов с проточными ячейками Hielscher Ultrasonics позволяет собрать идеальную установку для ультразвуковой биообработки.
Hielscher Ultrasonics – От лаборатории к опытному проекту и к производству
Hielscher Ultrasonics охватывает весь спектр ультразвукового оборудования, предлагая компактные ручные ультразвуковые гомогенизаторы для подготовки образцов до настольных и пилотных систем, а также мощные промышленные ультразвуковые установки, которые легко обрабатывают грузовые автомобили в час. Будучи универсальными и гибкими в вариантах установки и монтажа, ультразвуковые аппараты Hielscher могут быть легко интегрированы во все виды реакторов периодического действия, периодических или непрерывных проточных установок.
Различные аксессуары, а также детали по индивидуальному заказу позволяют идеально адаптировать ультразвуковую установку к вашим технологическим требованиям.
Ультразвуковые процессоры Hielscher, предназначенные для работы в режиме 24/7 при полной нагрузке и тяжелых условиях в сложных условиях, надежны и требуют минимального технического обслуживания.
В таблице ниже приведена примерная производительность обработки наших ультразвуковых аппаратов:
Объем партии | Расход | Рекомендуемые устройства |
---|---|---|
от 1 до 500 мл | От 10 до 200 мл/мин | УП100Ч |
от 10 до 2000 мл | от 20 до 400 мл/мин | УП200Хт, УП400Ст |
0.1 до 20 л | 0от 0,2 до 4 л/мин | УИП2000HDT |
От 10 до 100 л | От 2 до 10 л/мин | УИП4000HDT |
н.а. | От 10 до 100 л/мин | UIP16000 |
н.а. | больше | Кластер UIP16000 |
Свяжитесь с нами! / Спросите нас!
Литература / Литература
- Muschiol, Jan; Meyer, Anne S. (2019): A chemo-enzymatic approach for the synthesis of human milk oligosaccharide backbone structures. Zeitschrift für Naturforschung C, Volume 74: Issue 3-4, 2019. 85-89.
- Birgitte Zeuner, David Teze, Jan Muschiol, Anne S. Meyer (2019): Synthesis of Human Milk Oligosaccharides: Protein Engineering Strategies for Improved Enzymatic Transglycosylation. Molecules 24, 2019.
- Yun Hee Choi, Bum Seok Park, Joo‐Hyun Seo, Byung‐Gee Ki (2019): Biosynthesis of the human milk oligosaccharide 3‐fucosyllactose in metabolically engineered Escherichia coli via the salvage pathway through increasing GTP synthesis and β‐galactosidase modification. Biotechnology and Bioengineering Volume 116, Issue 12. December 2019.
- Balakrishnan Naveena, Patricia Armshaw, J. Tony Pembroke (2015): Ultrasonic intensification as a tool for enhanced microbial biofuel yields. Biotechnology of Biofuels 8:140, 2015.
- Shweta Pawar, Virendra K. Rathod (2020): Role of ultrasound in assisted fermentation technologies for process enhancements. Preparative Biochemistry & Biotechnology 50(6), 2020. 1-8.
Факты, которые стоит знать
Биосинтез с использованием клеточных фабрик
Фабрика микробных клеток — это метод биоинженерии, при котором микробные клетки используются в качестве производственного объекта. С помощью генной инженерии микробов ДНК микроорганизмов, таких как бактерии, дрожжи, грибы, клетки млекопитающих или водоросли, модифицируется, превращая микробы в клеточные фабрики. Клеточные фабрики используются для преобразования субстратов в ценные биологические молекулы, которые используются, например, в пищевой промышленности, фармацевтике, химии и производстве топлива. Различные стратегии биосинтеза на основе клеточной фабрики направлены на производство нативных метаболитов, экспрессию гетерологичных путей биосинтеза или экспрессию белков.
Клеточные фабрики могут быть использованы либо для синтеза нативных метаболитов, либо для экспрессии гетерологичных биосинтетических путей, либо для экспрессии белков.
Биосинтез нативных метаболитов
Нативные метаболиты определяются как биологические молекулы, которые клетки, используемые в качестве клеточной фабрики, производят естественным образом. Клеточные фабрики производят эти биологические молекулы либо внутриклеточно, либо в виде секретируемого вещества. Последний является предпочтительным, поскольку он облегчает разделение и очистку целевых соединений. Примерами нативных метаболитов являются аминокислоты и нуклеиновые кислоты, антибиотики, витамины, ферменты, биологически активные соединения и белки, полученные из анаболических путей клетки.
Гетерологичные пути биосинтеза
При попытке получить интересное соединение, одним из наиболее важных решений является выбор производства в нативном хосте и оптимизация этого хоста, или перенос пути на другой хорошо известный хост. Если исходный хозяин может быть адаптирован к промышленному процессу ферментации и при этом нет рисков, связанных со здоровьем (например, производство токсичных побочных продуктов), это может быть предпочтительной стратегией (как это было, например, в случае с пенициллином). Тем не менее, во многих современных случаях потенциал использования промышленно предпочтительной клеточной фабрики и связанных с ней платформенных процессов перевешивает сложность переноса пути.
Экспрессия белка
Экспрессия белков может быть достигнута гомологичным и гетерологичным способами. При гомологичной экспрессии ген, который естественным образом присутствует в организме, чрезмерно экспрессируется. Благодаря этой сверхэкспрессии можно получить более высокий выход определенной биологической молекулы. Для гетерологичной экспрессии специфический ген переносится в клетку-хозяина, в которой ген отсутствует в природе. Используя клеточную инженерию и технологию рекомбинантной ДНК, ген встраивается в ДНК хозяина таким образом, что клетка-хозяин производит (большое) количество белка, которое она не продуцировала бы естественным путем. Экспрессия белков осуществляется в различных организмах-хозяевах из бактерий, например, E. coli и Bacillis subtilis, дрожжей, например, Klyuveromyces lactis, Pichia pastoris, S. cerevisiae, нитчатых грибов, например, A. niger, и в клетках, полученных от многоклеточных организмов, таких как млекопитающие и насекомые. Большой коммерческий интерес представляют бесчисленные белки, в том числе из объемных ферментов, сложных биофармацевтических препаратов, диагностических и исследовательских реактивов. (ср. А.М. Дэви и др. 2017)