Твердофазный синтез пептидов – повышение эффективности с помощью обработки ультразвуком
Твердофазный синтез пептидов (SPPS) – распространённый метод синтеза пептидов. Обработка ультразвуком является надёжным инструментом интенсификации твердофазного синтеза пептидов, обеспечивая более высокий выход, повышение чистоты, отсутствие рацемизации и значительное увеличение скорости реакции. Hielscher Ultrasonics предлагает различные ультразвуковые решения для синтеза, отщепления и растворения пептидов.
Ультразвуковой твердофазный синтез пептидов
Обработка ультразвуком уже широко применяется для интенсификации органического синтеза и хорошо известна такими преимуществами, как резкое сокращение времени реакций, более высокий выход, меньшее количество побочных продуктов, инициирование реакционных путей, недоступных другими способами, и/или более высокая селективность. Значительные преимущества можно получить и при введении обработки ультразвуком в реакции синтеза пептидов. Результаты исследований показали, что синтез пептидов с применением ультразвука обеспечивает оптимизированный выход пептидов высокой чистоты без рацемизации за короткое время реакции.
- Высокий выход пептидов
- Значительно более быстрый синтез
- Более высокая чистота пептидов
- Отсутствие рацемизации
- Параллельный синтез различных пептидов
- Масштабирование до любого объёма
Ультразвуковой CupHorn для равномерной обработки ультразвуком нескольких реакционных сосудов с целью улучшения синтеза пептидов.
Схема твердофазного синтеза пептидов по Меррифилду. Обработка ультразвуком используется для стимулирования и интенсификации реакции синтеза, а также для отщепления синтезированных пептидов от смолы.
Схема: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Исследование | Исследованные пептиды | Время реакции (классический метод и US-SPPS) | Чистота неочищенного продукта (классический метод и US-SPPS) | Рацемизация и побочные реакции | Основные выводы |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Мет-энкефалин, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-эндорфин | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Для Cys/His не наблюдались даже при 70°C | Синтез быстрее примерно в 7–12 раз; существенное повышение чистоты, особенно для склонных к агрегации последовательностей, таких как TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-мер), Pep2 (9-мер), Pep3 (25-мер) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (только ультразвук) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Не исследовались; отмечено небольшое снижение чистоты Pep2 | Сокращение времени в 14 раз для Pep1; выход неочищенных продуктов значительно увеличился. |
| Merlino et al. (2019) | Модельные пентапептиды, пептиды длиной до 44 звеньев, «сложные последовательности» (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (модель) | 84% → 93% (модель); значительно выше, чем при термическом нагреве (~45°C) | Значительного увеличения количества энантиомеров Cys/His не наблюдалось | Высокая эффективность для сложных и склонных к агрегации последовательностей; позволяет уменьшить избыток реагентов при сохранении высокой чистоты. |
Улучшение твердофазного синтеза пептидов с помощью ультразвука
Твердофазный синтез пептидов (SPPS) – химическая реакция, позволяющая собирать пептидную цепь посредством последовательных реакций производных аминокислот на нерастворимом пористом носителе. Однако традиционный твердофазный синтез пептидов представляет собой относительно малоэффективный и медленный процесс. Поэтому ультразвуковая интенсификация синтеза пептидов высоко ценится как инструмент для более эффективного и быстрого синтеза пептидов.
Silva et al. (2021) сравнили «классический» твердофазный синтез пептидов (SPPS) с использованием флуоренилметоксикарбонильной группы (Fmoc) и SPPS с применением ультразвука (US) на примере получения трёх пептидов: пептида Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), специфичного к рецептору фактора роста фибробластов 3 (FGFR3), и новых пептидов Pep2 (RQMATADEA-NH2) и Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS с применением ультразвука позволил сократить время сборки пептидов в 14 раз (Pep1) и в 4 раза (Pep2) по сравнению с «классическим» методом. Интересно, что SPPS с применением ультразвука обеспечил получение Pep1 с более высокой чистотой (82%), чем «классический» SPPS (73%). Значительное сокращение времени в сочетании с достигнутой высокой чистотой неочищенного пептида побудило исследовательскую группу применить SPPS с ультразвуком к крупному пептиду Pep3, содержащему большое количество гидрофобных аминокислот и гомоолигомерных последовательностей. Примечательно, что синтез этого 25-мерного пептида был осуществлён менее чем за 6 часов (347 min) с умеренной чистотой (прибл. 49%).
Ускоренный синтез пептидов методом твердофазного синтеза с использованием ультразвукового перемешивания.
(Исследование и анализ: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) также провели всестороннее исследование влияния ультразвука на твердофазный синтез пептидов с использованием Fmoc, который позволил синтезировать различные биологически активные пептиды длиной до 44 звеньев со значительной экономией материалов и времени реакции. Они показали, что обработка ультразвуком не усиливала основные побочные реакции и улучшала синтез пептидов со «сложными последовательностями», что позволяет отнести твердофазный синтез пептидов, стимулируемый ультразвуком (US-SPPS), к современным высокоэффективным стратегиям синтеза пептидов.
Наличие высокопроизводительных систем для ультразвукового синтеза пептидов позволяет значительно повысить скорость синтеза и увеличить чистоту неочищенных продуктов. (См. Wołczański et al., 2019)
Исследование рацемизации. Сравнение показательных спектров 1H ЯМР модельных пептидов, синтезированных вручную классическим методом при комнатной температуре и ультразвуковым методом при повышенной температуре. Химические сдвиги α-протонов His и Cys и метиленовой группы Acm (левые панели), а также протонов ɣ-метильной группы Val (правые панели) показывают, что обработка ультразвуком при 70°C не вызывает рацемизации.
(Исследование и анализ: Wołczański et al., 2019)
Ультразвуковое отщепление пептидов
После твердофазного синтеза пептидов (SPPS) синтезированные пептиды необходимо отщепить от полимерных смол. Этот этап также известен как снятие защитных групп. При сравнении обычного встряхивания и обработки ультразвуком для отщепления пептидов от смолы метод встряхивания требует приблизительно 1 часа, тогда как ультразвуковое отщепление может быть выполнено за 15–20 min. Ультразвуковое отщепление пептидов может применяться для отщепления защищённых аминокислот и пептидов, связанных с полистирольными смолами бензильными сложноэфирными связями.
Ультразвуковое отщепление пептидов от полистирольной смолы обеспечивает высокий выход пептидов высокой чистоты без рацемизации в ходе быстрой процедуры.
(Исследование и схема: ©Anuradha and Ravindranath, 1995)
Реактор с ультразвуковым перемешиванием для улучшения и ускорения синтеза пептидов. На изображении показан ультразвуковой гомогенизатор UP200St в стеклянном реакторе с перемешиванием.
Высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы для синтеза пептидов
Hielscher Ultrasonics предлагает различные ультразвуковые решения для прямой и непрямой обработки ультразвуком. Мощные ультразвуковые процессоры с точным управлением подают в реакционный сосуд именно необходимое количество ультразвуковой энергии. Независимо от того, используете ли вы для синтеза шприцы, пробирки, многолуночные планшеты или стеклянные реакторы, Hielscher Ultrasonics предлагает наиболее подходящий ультразвуковой гомогенизатор для вашей задачи, связанной с пептидами.
- пептидов по индивидуальному заказу
- крупномасштабного производства пептидов
- библиотек пептидов
Многие реакции синтеза пептидов проводят в шприцах, например в шприцевых реакторах с пористыми фильтрами. Ультразвуковое устройство Hielscher для перемешивания в шприцах обрабатывает пептидный раствор ультразвуком, передавая ультразвуковые волны через стенку шприца в жидкость. Ультразвуковое устройство для перемешивания в шприцах является одним из наиболее популярных ультразвуковых решений для синтеза пептидов с применением ультразвука.
Ультразвуковой CupHorn подходит для обработки ультразвуком до 5 реакционных сосудов, тогда как VialTweeter может вмещать до десяти реакционных пробирок и дополнительно пять сосудов большего размера с помощью зажимного приспособления.
Для других типов реакторов, таких как твердофазные реакторы Меррифилда или Камыша, а также других полипропиленовых или боросиликатных сосудов и реакторов Hielscher предлагает ультразвуковые гомогенизаторы для непрямой и прямой обработки ультразвуком с зажимным креплением или фланцем, изготовленными по индивидуальному заказу.
Разумеется, более крупные стеклянные реакторы с перемешиванием, например для синтеза в растворе, можно легко оснастить ультразвуковыми зондами любого размера, также известными как сонотроды или ультразвуковые рупоры.
- различные типы ультразвуковых гомогенизаторов
- прямая и непрямая обработка ультразвуком
- точное управление интенсивностью
- точное регулирование температуры
- непрерывный или импульсный ультразвук
- интеллектуальные функции, программируемые устройства
- доступны для любого объёма
- линейная масштабируемость
UIP400MTP – идеальное устройство для твердофазного синтеза пептидов в многолуночных/микротитрационных планшетах. Ультразвуковая кавитация равномерно создаётся в многочисленных лунках с образцами посредством непрямой передачи ультразвука для превосходного массопереноса и протекания реакции синтеза. Посмотрите видео ниже, чтобы увидеть, как работает ультразвуковой гомогенизатор для микропланшетов UIP400MTP!
Свяжитесь с нами! / Задайте нам вопрос!
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы для смешивания, диспергирования, эмульгирования и экстракции в лабораторном, пилотном и промышленном масштабе.
Полезные сведения об ультразвуковом синтезе пептидов
Что такое пептиды?
Пептиды – соединения, в которых несколько аминокислот соединены амидными связями, так называемыми пептидными связями. При объединении в сложные структуры – обычно состоящие из 50 или более аминокислот – такие крупные пептидные структуры называют белками. Пептиды являются важнейшим строительным компонентом живых организмов и выполняют многочисленные функции в организме.
Как происходит синтез пептидов?
В органической химии, молекулярной биологии и науках о жизни синтез пептидов – это процесс получения пептидов. Пептиды синтезируют химическим путём посредством реакции конденсации карбоксильной группы одной аминокислоты с аминогруппой другой аминокислоты. Для предотвращения нежелательных побочных реакций с различными боковыми цепями аминокислот обычно используют стратегии применения защитных групп.
Химический синтез пептидов (in vitro) чаще всего начинается с присоединения карбоксильной группы поступающей аминокислоты (C-конец) к N-концу растущей пептидной цепи. В отличие от этого синтеза в направлении от C-конца к N-концу, естественный биосинтез белков с длинными пептидными цепями в живых организмах происходит в противоположном направлении. Это означает, что при биосинтезе N-конец поступающей аминокислоты соединяется с C-концом белковой цепи (от N-конца к C-концу).
Большинство исследовательских протоколов и протоколов разработки для синтеза пептидов основано на твердофазных методах, тогда как методы синтеза в растворе применяются в крупномасштабном промышленном производстве пептидов.
Каков современный уровень развития синтеза пептидов?
SUS-SPPS (ресурсосберегающий SPPS с применением ультразвука) позволяет, как было показано, сократить процесс всего до двух этапов на цикл (совмещённые присоединение/кэппирование/снятие защитных групп + однократная промывка), значительно уменьшая расход растворителей и затраты времени. (См. Mottola et al., 2025)
TAPS с применением ультразвука представляет собой развивающееся сочетание методов, успешность которого продемонстрирована в полных синтезах (например, lipobactin) и которое изучается контрактными организациями по разработке и производству (CDMO) для производства активных фармацевтических ингредиентов (API).
Откройте для себя преимущества синтеза пептидов методом TAGGING с применением ультразвука!
Непрерывная обработка изучается как способ дальнейшего усовершенствования – описаны платформы непрерывного синтеза в одном реакционном сосуде с использованием силилированных меток.
Эта область развивается в направлении принципов зелёной химии, причём и ультразвук, и TAPS способствуют сокращению использования растворителей, уменьшению количества вводимых реагентов и повышению экологической устойчивости.
Литература / Ссылки
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы от лабораторного до промышленного размера.