Масштабирование синтеза пептидов: ультразвуковые методы для периодического и непрерывного производства
Синтез пептидов с использованием ультразвука сочетает в себе традиционные методы пептидной химии с высокочастотной механической энергией для ускорения реакционных и транспортных процессов. Акустическая кавитация – образование и схлопывание микроскопических пузырей – вызывает интенсивное локальное перемешивание, образование микроструй и сдвиговых сил. При синтезе пептидов эти эффекты улучшают перенос реагентов, смачивание смолы, растворение и разрушение агрегатов. Таким образом, низкочастотный ультразвук выступает в первую очередь в качестве средства интенсификации процесса: он не заменяет химию соединения, но может сделать соединение, депротекцию, промывку, расщепление и последующую обработку значительно быстрее и эффективнее.
Проблема наращивания масштабов производства пептидов
Масштабирование производства пептидов с лабораторного уровня до промышленного представляет собой сложную задачу, поскольку небольшие потери эффективности накапливаются в ходе многочисленных циклов соединения и депротекции, что приводит к снижению выхода и увеличению количества трудноудаляемых примесей. Использование более крупных реакторов также влечет за собой ограничения в области перемешивания, теплообмена, набухания смолы и транспортировки реагентов, при этом резко возрастают расход растворителя, требования к очистке и производственные затраты. Поэтому для успешного масштабирования необходимо сохранить однородность реакции и качество продукта, обеспечивая при этом воспроизводимую производительность, эффективное использование ресурсов и точный контроль всех критических параметров процесса.
Фармацевтическая партия с использованием ультразвукового устройства UIP2000hdT для оптимизации синтеза пептидов
Стратегии синтеза пептидов с использованием ультразвукового воздействия
Ультразвуковой твердофазный синтез пептидов
Твердофазный синтез пептидов (SPPS) с использованием Fmoc является наиболее широко исследованным методом, основанным на применении ультразвука. Ультразвуковая обработка способствует проникновению реагентов для депротекции и соединения в набухшие полимерные гранулы, одновременно уменьшая толщину застойных пограничных слоев вокруг смолы. Она также может препятствовать агрегации на смоле, что является одной из основных причин неполного превращения в гидрофобных и других “сложный” последовательности.
Экспериментальные исследования продемонстрировали возможность ультразвукового синтеза биологически активных пептидов, содержащих до 44 остатков, с меньшим расходом реагентов и сокращением времени реакции без заметного усиления основных побочных реакций в описанных условиях. (см. Мерлино и др., 2019)
В другом исследовании было отмечено сокращение времени сборки отдельных пептидов в 4–14 раз; 25-мер, богатый гидрофобными остатками, был собран за 347 минут. (см. Silva и др., 2021)
Ультразвуковое исследование может проводиться во время:
- Набухание смолы и обмен реагентами
- Депротекция Fmoc или Boc
- Активация и соединение аминокислот
- Промежуточная промывка
- Циклизация на основе смолы
- Отщепление готового пептида от носителя
Синтез в жидкой фазе и с использованием меток
Ультразвук также может повысить эффективность традиционного жидкофазного синтеза пептидов за счет ускорения растворения, диспергирования реагентов и массопереноса в гетерогенных или вязких смесях. Его преимущество, как правило, наиболее заметно в тех случаях, когда процесс ограничен перемешиванием или массопереносом; при полностью гомогенной реакции, определяемой исключительно внутренней химической кинетикой, эффект может быть менее заметным.
При синтезе пептидов с использованием меток растущий пептид присоединяется к растворимому или осаждаемому органическому анкору. Реакции протекают в растворе, после чего промежуточное соединение с меткой извлекается путем осаждения или фильтрации. Ультразвуковая обработка может ускорить процессы соединения, депротекции, циклизации и отщепления метки, при этом сохраняя плохо растворимые промежуточные соединения в диспергированном состоянии.
| Техника | Как ультразвуковая обработка способствует этому | Значение и ограничения |
|---|---|---|
| Твердофазный синтез пептидов методом Fmoc | Ультразвуковая обработка ускоряет проникновение пиперидина и удаление продуктов Fmoc; улучшает транспорт активированных аминокислот в набухшую смолу; препятствует агрегации на смоле | Наиболее убедительные доказательства и, как правило, наибольшая польза |
| Твердофазный синтез по методу Бока | Ультразвуковая обработка улучшает проникновение кислоты, обмен реагентами, соединение и промывку аналогично методам Fmoc-химии | С хранением и нагревом кислоты следует обращаться с осторожностью |
| Синтез в растворе/жидкой фазе | Ультразвуковая обработка улучшает растворение защищенных аминокислот, способствует диспергированию осадков и увеличивает площадь контакта в двухфазных реакциях или реакциях в суспензии | Польза меньше, если реакция уже протекает в гомогенной фазе и скорость реакции ограничивается химическими факторами |
| Синтез с использованием растворимых маркеров или на основе осаждения | Ультразвуковая обработка обеспечивает диспергированное состояние меченных промежуточных соединений в процессе конъюгации и может улучшить растворение перед фильтрацией или осаждением | Полезно для плохо растворимых или сыпучих препаратов; ультразвук в основном облегчает обработку и способствует массообмену |
| Потоковый или непрерывный синтез | Ультразвуковая обработка способствует поддержанию контакта между смолой и жидкостью и предотвращению образования локальных зон застоя или агрегации | Масштабирование с использованием конструкции проточной ячейки для равномерного воздействия ультразвука |
| Лигирование фрагментов и циклизация | Ультразвуковая обработка позволяет растворять гидрофобные фрагменты, разрушать агрегаты и улучшать межмолекулярные контакты | Это само по себе не ускоряет все естественные химические реакции лигации или макроциклизации; доминирующим фактором могут оставаться чрезмерное разбавление или межмолекулярная агрегация |
| Ферментативный синтез пептидов | При соответствующей интенсивности ультразвуковая обработка может изменять динамику ферментов и улучшать перенос субстрата, особенно в случае иммобилизованных ферментов или двухфазных сред | В значительной степени зависит от ферментов; избыточная энергия приводит к разворачиванию или инактивации |
| Рибосомный/рекомбинантный синтез | Не оказывает прямого влияния на перевод | Ультразвуковая обработка применяется в основном для разрушения клеток после экспрессии |
Увеличение масштаба ультразвуковой обработки: периодическая, рециркуляционная и непрерывная обработка
Ультразвуковые аппараты Hielscher можно легко интегрировать в вашу конкретную технологическую линию по синтезу пептидов.
Для увеличения масштаба производства актуальны три конфигурации реакторов:
- Пакетная обработка ультразвуком отличается простотой и гибкостью, однако с увеличением объёма емкости становится сложнее обеспечить оптимальную однородность обработки.
- При рециркуляционной обработке содержимое реактора многократно прокачивается через ультразвуковую проточную ячейку, что обеспечивает более равномерную обработку при сохранении гибкости периодического режима.
- При непрерывном режиме потока реакционная смесь проходит через одну или несколько зон контролируемой ультразвуковой обработки. Время пребывания, расход и подаваемая энергия могут быть точно заданы, что делает данную архитектуру предпочтительной для высокопроизводительного и воспроизводимого производства.
В процессах на основе смолы тракт потока, насос и клапаны должны быть рассчитаны на размер гранул, чтобы избежать их истирания или засорения. Альтернативным вариантом является удержание смолы в реакторе с перемешиванием и циркуляция только жидкой фазы через ультразвуковую камеру.
2 промышленных ультразвуковых аппарата модели UIP4000hdT подключенный к реактору с проточной ячейкой из нержавеющей стали для производства пептидов.
Часто задаваемые вопросы о масштабировании ультразвукового синтеза пептидов
Что такое ультразвуковой синтез пептидов?
При ультразвуковом синтезе пептидов используются звуковые волны высокой интенсивности для улучшения перемешивания, массообмена и кинетики реакции в процессе синтеза пептидов. Акустическая кавитация способствует проникновению реагентов в набухшую смолу, рассеивает агрегаты и ускоряет этапы соединения, депротекции, промывки и расщепления.
Как ультразвук улучшает твердофазный синтез пептидов?
При ультразвуковом твердофазном синтезе пептидов (US-SPPS) ультразвуковая обработка улучшает контакт между пептидом, связанным с смолой, и растворенными реагентами. Это позволяет сократить продолжительность реакционных циклов, способствует более полному соединению и снижает вероятность потери аминокислотных остатков, особенно при синтезе гидрофобных, склонных к агрегации или иных сложных пептидов.
Может ли ультразвуковая обработка повысить выход и чистоту пептидов?
Ультразвуковая обработка может повысить степень превращения, выход сырого продукта и чистоту за счёт обеспечения равномерного распределения реагентов и снижения количества неполных соединений. Результат зависит от аминокислотной последовательности пептида, смолы, растворителя, химии соединения и параметров ультразвуковой обработки, поэтому каждый процесс должен быть оптимизирован и подтвержден аналитическими испытаниями.
На каких этапах синтеза пептидов можно применять ультразвуковое воздействие?
Ультразвук может способствовать набуханию смолы, снятию защитных групп Fmoc или Boc, соединению аминокислот, промывке, конденсации фрагментов, циклизации и отщеплению от твёрдой подложки. Он также может улучшать растворение и массоперенос при синтезе пептидов в жидкой фазе и с использованием меток.
Откройте для себя ультразвуковой синтез пептидов – для твердофазного синтеза пептидов и – жидкофазный синтез с маркировкой!
Подходит ли ультразвуковой синтез пептидов для сложных последовательностей?
Да. Ультразвук особенно полезен для гидрофобных и склонных к агрегации последовательностей, поскольку кавитация и микропотоки способствуют разрушению агрегатов на смоле и улучшают доступ реагентов к реакционным центрам. Для сложных процессов конъюгации по-прежнему может потребоваться использование оптимизированных реагентов, повторная конъюгация или корректировка условий реакции.
Можно ли увеличить масштабы ультразвукового синтеза пептидов?
Ультразвуковой синтез пептидов можно перенести из лабораторных испытаний на серийное, рециркуляционное или потоковое производство. Масштабирование достигается за счет поддержания критических параметров, таких как амплитуда, удельная энергия, температура и время пребывания, при одновременном увеличении мощности ультразвука, площади сонотрода или количества технологических модулей.
Что означает «линейная масштабируемость» в области ультразвуковой обработки?
Линейная масштабируемость означает, что пропускная способность может увеличиваться примерно пропорционально установленной ультразвуковой мощности при неизменных значениях требуемой энергии на единицу объема и других технологических параметров. Например, удвоение эффективной ультразвуковой мощности может привести к примерно двукратному увеличению расхода при условии соблюдения геометрии реактора, температуры и целевых показателей качества продукции.
Почему ультразвуковые аппараты Hielscher подходят для масштабирования производства пептидов?
Ультразвуковые аппараты Hielscher охватывают диапазоны мощности от лабораторного до пилотного и промышленного уровня, обеспечивая стабильные и регулируемые рабочие параметры. Регулируемая амплитуда, автоматическая регистрация данных, контроль температуры и давления, совместимость с проточными ячейками и модульные конфигурации способствуют воспроизводимому переносу технологических процессов и надежному производству.
Могут ли ультразвуковые аппараты Hielscher использоваться в непрерывном производстве пептидов?
Да. Промышленные ультразвуковые устройства компании Hielscher могут быть интегрированы в контуры рециркуляции и реакторы с непрерывным потоком, оснащённые проточными ячейками. Такие конфигурации обеспечивают контролируемое время пребывания и подачу энергии, одновременно снижая колебания показателей от партии к партии. Промышленные системы рассчитаны на непрерывную круглосуточную работу в сложных производственных условиях.
Что лучше подходит для синтеза пептидов: ультразвуковые ванны или зондовые ультразвуковые аппараты?
Ультразвуковые ванны могут быть удобны для первичного отбора и одновременной обработки небольших закрытых сосудов. Ультразвуковые преобразователи зондового типа направляют ультразвук непосредственно в рабочую среду, обеспечивая более высокую интенсивность, лучший контроль параметров и большую масштабируемость. В связи с этим зонды и проточные ячейки, как правило, предпочтительны для пилотного и промышленного производства.
Как регулируется температура в процессе ультразвукового синтеза пептидов?
Поскольку ультразвуковая обработка приводит к поступлению энергии в реакционную смесь, крайне важно обеспечить эффективное охлаждение. Ультразвуковые аппараты Hielscher поставляются с емкостями с рубашкой, внешними теплообменниками, системой рециркуляции с регулированием температуры и импульсной ультразвуковой обработкой, что позволяет эффективно предотвращать перегрев. Вставные датчики температуры и программируемые предельные значения температуры обеспечивают надежный мониторинг и регистрацию температуры на всех этапах разработки и производства.
Как выбрать ультразвуковой аппарат Hielscher для синтеза пептидов?
Выбор зависит от объема партии, требуемой скорости потока, растворителя, вязкости, концентрации твердых веществ или смолы, требуемой удельной энергии и графика производства. В ходе лабораторных испытаний определяется эффективный технологический диапазон, после чего можно подобрать размеры ультразвукового преобразователя Hielscher, сонотрода и конфигурации проточной ячейки в соответствии с запланированной производительностью.
Литература / Литература
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы от лаборатория Кому промышленного размера.