Подготовка плазмид с помощью обработки ультразвуком

Обработка ультразвуком – надежный метод фрагментации плазмидной ДНК. Точно регулируемая амплитуда, импульсный режим и контроль температуры – важнейшие характеристики ультразвукового устройства для фрагментации плазмид без повреждения. Кроме того, применение определенных веществ помогает защитить плазмиды от деградации. Hielscher Ultrasonics предлагает различные решения для контролируемой фрагментации плазмид в отдельных флаконах, одновременной обработки ультразвуком многочисленных образцов, а также многолуночных планшетов. Узнайте больше об успешной ультразвуковой фрагментации плазмид!

Фрагментация плазмид под действием сдвига с помощью ультразвука

Когда образцы ДНК подвергаются воздействию ультразвуковых волн, создаваемые ультразвуком колебания вызывают акустическую кавитацию в жидкости, которая за счет механических сил фрагментирует или разрывает высокомолекулярные молекулы ДНК. Обработка ультразвуком – наиболее широко используемый метод в экспериментах по фрагментации ДНК под действием сдвига в больших объемах, включая такие применения, как иммунопреципитация хроматина (ChIP), для которых малые размеры фрагментов абсолютно необходимы для получения высокого разрешения. (ср. Tseng et al., 2012)
Плазмидная ДНК (pDNA) – особая форма ДНК, характеризующаяся кольцевой структурой и встречающаяся у бактерий и некоторых эукариот.
Суперскрученная pDNA является желательной формой плазмидной ДНК, поскольку она дает наилучшие результаты на последующих этапах, таких как автоматизированное секвенирование и трансфекция. Обработка ультразвуком подходит для успешной фрагментации pDNA, включая суперскрученную pDNA.
Thompson et al. (2008) показали, что обработка плазмид ультразвуком, которая, как известно, фрагментирует суперскрученную ДНК, является эффективным способом увеличения длины прочтений последовательности с качеством phred20 до уровня, при котором они существенно не отличаются от прочтений контрольной матрицы Beckman Coulter или ферментативно линеаризованных плазмид.

Использование плазмидных векторов

Плазмиды часто используют как инструменты для клонирования, переноса генов и манипуляций с ними. Когда плазмиды применяют для этих целей в экспериментах, их называют векторами. Фрагменты ДНК или гены можно вставить в плазмидный вектор, создавая так называемую рекомбинантную плазмиду. Плазмидные векторы используются как средства доставки рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина и являются ключевым компонентом молекулярного клонирования.
«Невирусные векторы активно изучаются с точки зрения их потенциального применения в генной терапии для лечения различных сложных заболеваний. Невирусные векторы защищают плазмидную ДНК от физической, химической и ферментативной деградации и доставляют молекулу ДНК в целевую область. Например, катионные липосомы, хитозан и другие положительно заряженные наночастицы образуют комплексы с плазмидной ДНК посредством электростатических взаимодействий. Однако легко образующиеся комплексы катионных липосом/плазмидной ДНК относительно велики (т. е. 300–400 nm) и неоднородны по своей природе, что затрудняет их применение в фармацевтике. Крупные и неоднородные комплексы плазмидной ДНК/липосом, плазмидной ДНК/аэрозолей и плазмидной ДНК/пептидов можно уменьшить до более мелких и однородных частиц с помощью обработки ультразвуком». (Sarker et al., 2019)
Яркий пример использования плазмидных векторов – CRISPR–Cas9. Систему CRISPR–Cas9 обычно доставляют в клетки в виде одной крупной плазмиды или нескольких меньших плазмид, которые кодируют целевую последовательность, направляющую CRISPR и Cas9.

Ультразвуковое получение наночастиц PLGA, содержащих ДНК, методом наноосаждения

Jo et al. (2020) использовали сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA) для создания наночастиц-носителей, предназначенных для доставки модельной плазмиды CRISPR–Cas9 в первичные макрофаги, полученные из костного мозга. Для наноосаждения наночастиц PLGA использовали PLGA с двумя различными концевыми группами (сложноэфирными и аминными группами), рассчитывая на то, что положительно заряженные концевые аминные группы повысят эффективность инкапсуляции и загрузку благодаря взаимодействию зарядов этих групп и отрицательно заряженного остова ДНК. В полипропиленовой конической центрифужной пробирке объемом 50 mL растворяли 100 mg Pluronic F127 в 20 mL автоклавированной деионизированной воды путем перемешивания на вортексе с последующей щадящей обработкой ультразвуком в течение 30 min в ультразвуковой ванне (см. CupHorn). Добавляли автоклавированный магнитный якорь, и раствор перемешивали при 600 RPM в течение 30 min, пока готовили другие растворы. На всех этапах вместо стеклянной лабораторной посуды использовали пластиковую, чтобы минимизировать неспецифическую адсорбцию ДНК. Отдельно готовили растворы PLGA в DMF (44,48 mg/ ml) и TIPS-пентацена в THF (0,667 mg/ml). PLGA оставляли в покое для смачивания в DMF на 30 min, затем обрабатывали ультразвуком в течение 30 min. (полный протокол см. в Jo et al., 2020)

Защита плазмидной ДНК при обработке ультразвуком

ДНК, включая плазмиды и суперскрученные плазмиды, крайне чувствительна к деградации. Все доступные методы фрагментации имеют определенные известные недостатки. Ультразвуковая фрагментация ДНК является одним из предпочтительных методов, поскольку контролируемая обработка ультразвуком в сочетании с защитными мерами позволяет уменьшить повреждение цепей ДНК, вызванное сдвигом и нагревом.
Помимо низких значений амплитуды, импульсного режима и контроля температуры при ультразвуковой фрагментации ДНК под действием сдвига, применение определенных веществ продемонстрировало значительный защитный эффект против деградации ДНК. Например, различные полимеры, пептиды и липиды защищают плазмидную ДНК во время обработки ультразвуком.

Устойчивость плазмидной ДНК и нанокомплексов плазмидной ДНК/IL к ультразвуковому напряжению сдвига исследовали методом электрофореза в агарозном геле. Как плазмидную ДНК, так и нанокомплексы плазмидной ДНК/IL подвергали ультразвуковому напряжению сдвига в течение разных промежутков времени. Плазмидную ДНК подвергали ультразвуковому напряжению сдвига в течение 0, 10, 20, 30 и 40 минут. Нанокомплексы плазмидной ДНК/IL, однако, подвергали ультразвуковому напряжению сдвига в течение 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минут.
(исследование и изображение: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) показали, что, когда наноструктуры плазмидной ДНК / ионной жидкости (pDNA/IL) подвергали ультразвуковому напряжению сдвига в течение 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 min и формировали их комплексы с коммерчески доступным катионным реагентом для доставки генов липофектамином, доля флуоресцентно-положительных клеток составляла 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% и 50% соответственно (см. диаграмму ниже). Доля флуоресцентно-положительных клеток увеличивалась, когда наноструктуры подвергали ультразвуковому напряжению сдвига в течение 10 и 20 min, а затем медленно снижалась.

Влияние ионной жидкости [Bmim][PF6] на доставку плазмидной ДНК в клетки COS7. Нанокомплексы плазмидной ДНК/IL (ионной жидкости) подвергали ультразвуковому напряжению сдвига в течение до 120 минут и формировали их комплексы с LA перед доставкой в клетки COS7. Данные показывают среднее количество (%) GFP-положительных клеток HeLa, подсчитанных в 10 различных полях зрения микроскопа; эксперимент проводили многократно в течение трех разных дней. (Исследование и диаграмма: ©Sarker et al., 2019)

Ультразвуковая подготовка лизата

Протокол ультразвукового лизиса клеток
Начните с обогащенного образца клеток, подготовленного с помощью метода разделения клеток (например, иммуномагнитного разделения клеток, сортировки клеток с активацией флуоресценцией (FACS), центрифугирования в градиенте плотности, иммуноплотностного выделения клеток).
Образцы клеток должны содержать объем буфера для лизиса, подходящий для цели эксперимента и ультразвукового устройства зондового типа.
Предпочтительны гипотонические буферы, поскольку они усиливают ультразвуковой лизис клеток. Важно надлежащим образом использовать добавки и выбирать концентрацию солей.
Выберите устройство для ультразвукового лизиса: для непрямой обработки флаконов ультразвуком рекомендуются VialTweeter или CupHorn. Для многолуночных планшетов идеальным ультразвуковым устройством является UIP400MTP. Для классической обработки ультразвуком с помощью зонда лучше всего подходят ультразвуковые гомогенизаторы, такие как UP100H или UP200Ht, с микронаконечником.
Протокол обработки ультразвуком с помощью зонда: Поместите зонд ультразвукового устройства в объем образца в микроцентрифужной пробирке и обрабатывайте ультразвуком приблизительно 10 секунд. В зависимости от образца ДНК обработку ультразвуком может потребоваться повторить еще один или два раза. Необходимое количество вводимой ультразвуковой энергии (Ws/mL) зависит от вязкости образца и типа ДНК. Охлаждение с помощью ледяной бани и импульсный режим ультразвукового устройства помогают предотвратить термическую деградацию образца.
После ультразвукового лизиса образец центрифугируют для отделения осадка клеточных остатков (содержащего нелизированные клетки, ядра и нелизированные органеллы).
Если образец не подвергается дальнейшей обработке немедленно, его можно можно хранить при подходящей температуре для сохранения его жизнеспособности.

Ультразвуковые устройства для фрагментации ДНК

Hielscher Ultrasonics предлагает различные платформы на основе ультразвука для фрагментации ДНК, РНК и хроматина. Эти платформы включают ультразвуковые зонды (сонотроды), решения для непрямой обработки ультразвуком, позволяющие одновременно подготавливать образцы в нескольких пробирках или многолуночных планшетах (например, 96-луночных планшетах, микротитрационных планшетах), сонореакторы и ультразвуковые устройства CupHorn. Все платформы для фрагментации ДНК под действием сдвига работают от высокопроизводительных ультразвуковых процессоров с настройкой частоты, которые обеспечивают точное регулирование и воспроизводимые результаты.

Ультразвуковые процессоры для любого количества и объема образцов

С помощью ультразвуковых устройств Hielscher для обработки нескольких образцов VialTweeter (для до 10 пробирок) и UIP400MTP (для микропланшетов/многолуночных планшетов) можно легко сократить время обработки образцов благодаря интенсивной и точно регулируемой обработке ультразвуком, получая при этом желаемое распределение фрагментов ДНК по размерам и желаемый выход. Ультразвуковая фрагментация ДНК делает этапы подготовки плазмид эффективными, надежными и масштабируемыми. Протоколы можно линейно масштабировать от одного до многочисленных образцов, применяя постоянные параметры ультразвука.
Зондовые ультразвуковые устройства с числом пальцев от одного до пяти идеально подходят для подготовки небольшого количества образцов. Лабораторные ультразвуковые устройства Hielscher доступны с различными уровнями мощности, что позволяет выбрать идеальное ультразвуковое устройство для разрушения для вашей задачи, связанной с ДНК.