Плазмидная подготовка с помощью ультразвука

Ультразвуковое исследование является надежным методом фрагментации плазмидной ДНК. Точно контролируемая амплитуда, режим пульсации и контроль температуры являются наиболее важными характеристиками ультразвукового аппарата для неповреждающей фрагментации плазмиды. Кроме того, использование определенных средств помогает защититься от деградации плазмид. Hielscher Ultrasonics предлагает различные решения для контролируемой фрагментации плазмид из отдельных флаконов, одновременной ультразвука многочисленных образцов, а также многолуночных планшетов. Узнайте больше об успешной ультразвуковой фрагментации плазмид!

Плазмидный сдвиг с помощью ультразвука

Когда образцы ДНК подвергаются воздействию ультразвуковых волн, ультразвуковые колебания создают акустическую кавитацию в жидкости, которая сдвигает или разрушает высокомолекулярные молекулы ДНК под действием механических сил. Ультразвуковая обработка является наиболее широко используемым методом для экспериментов по объемному сдвигу ДНК, включая такие приложения, как иммунопреципитация хроматина (ChIP), для которой небольшие размеры фрагментов абсолютно необходимы для получения высокого разрешения. (ср. Tseng et al., 2012)
Плазмидная ДНК (пДНК) — специфическая форма ДНК, характеризующаяся формой кольца и встречающаяся у бактерий и некоторых эукариот.
Суперспиральная пДНК является желаемой формой плазмидной ДНК, поскольку она показывает наилучшие результаты в последующих процессах, таких как автоматизированное секвенирование и трансфекция. Ультразвуковое исследование успешно подходит для фрагментации пДНК, в том числе суперспиральной пДНК.
Thompson et al. (2008) продемонстрировали, что плазмидная ультразвуковая обработка, которая, как известно, фрагментирует суперспиральную ДНК, является эффективным способом улучшения длины чтения последовательности phred20 до такой степени, что она существенно не отличается от контрольного шаблона Бекмана Коултера или ферментативно линеаризованных плазмид.

Использование плазмидных векторов

Плазмиды часто используются в качестве инструментов для клонирования, переноса и манипулирования генами. Когда плазмиды используются экспериментально для этих целей, они называются векторами. Фрагменты ДНК или гены могут быть вставлены в плазмидный вектор, создавая так называемую рекомбинантную плазмиду. Плазмидные векторы используются в качестве транспортных средств для доставки рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина и являются ключевым компонентом молекулярного клонирования.
“Невирусные векторы широко изучаются на предмет их потенциального использования в генной терапии для лечения различных сложных заболеваний. Невирусные векторы защищают плазмидную ДНК от физической, химической и ферментативной деградации и доставляют молекулу ДНК к целевому участку. Например, катионные липосомы, хитозан и другие положительно заряженные наночастицы образуют комплексы с плазмидной ДНК путем электростатических взаимодействий. Тем не менее, легко образующиеся катионные липосомы/плазмидные комплексы ДНК относительно велики (т.е. 300–400 нм) и неоднородны по своей природе, что затрудняет их использование в фармацевтической промышленности. Большие и гетерогенные плазмидные ДНК/липосомы, плазмидные ДНК/аэрозоли и комплексы плазмидной ДНК/пептидов могут быть восстановлены до более мелких и однородных частиц с помощью ультразвука.” (Саркер и др., 2019)
Ярким примером использования плазмидных векторов является CRISPR–Cas9. Система CRISPR-Cas9 обычно доставляется в клетки в виде одной большой плазмиды или нескольких меньших плазмид, которые кодируют целевую последовательность, руководство CRISPR и Cas9.

Ультразвуковое получение наночастиц PLGA, загруженных ДНК, методом наноосаждения

Jo et al. (2020) использовали поли(молочную-ко-гликолевую кислоту) (PLGA) для формирования носителя наночастиц для доставки модельной плазмиды CRISPR-Cas9 в первичные макрофаги, полученные из костного мозга. Для наноосаждения наночастиц PLGA использовали PLGA с двумя различными концевыми группами (эфирными и аминными группами) с целью увеличения эффективности инкапсуляции и нагрузки положительно заряженных аминовых колпачков за счет зарядовых взаимодействий между ними и отрицательно заряженным остовом ДНК. В полипропиленовой конической центрифужной пробирке объемом 50 мл 100 мг Pluronic F127 растворяли в 20 мл автоклавной воды DI путем вихревого перемешивания с последующим мягким ультразвуковым обработкой в течение 30 минут (см. CupHorn). Добавляли автоклавный магнитный стержень для перемешивания и перемешивали раствор при 600 об/мин в течение 30 минут, пока готовили другие растворы. Вместо стеклянной посуды использовалась пластиковая лабораторная посуда, чтобы свести к минимуму неспецифическую адсорбцию ДНК. Растворы PLGA, растворенного в DMF (44,48 мг/мл) и пентацена TIPS, растворенного в THF (0,667 мг/мл), получали отдельно. PLGA оставляли в состоянии покоя для увлажнения в ДМФА в течение 30 минут, а затем подвергали ультразвуковой обработке в течение 30 минут (полный протокол см. в Jo et al., 2020)

Защита плазмидной ДНК при ультразвуковой обработке

ДНК, включая плазмиды и суперспиральные плазмиды, является высокочувствительной деградацией. Все доступные методы фрагментации известны своими недостатками. Ультразвуковая фрагментация ДНК является одним из предпочтительных методов, так как контролируемая ультразвук в сочетании с защитными мерами позволяет уменьшить повреждение нитей ДНК, вызванное сдвигом и теплом.
Помимо низких амплитудных настроек, режима пульсации и контроля температуры при ультразвуковом сдвиге ДНК, применение некоторых препаратов показало значительный защитный эффект от деградации ДНК. Например, различные полимеры, пептиды и липиды защищают плазмидную ДНК при ультразвуковой обработке.

Устойчивость плазмидной ДНК и нанокомплексов плазмидной ДНК/ИЛ к ультразвуковому напряжению сдвига исследовали с помощью электрофореза в агарозном геле. Как плазмидная ДНК, так и плазмидные нанокомплексы ДНК/IL подвергались ультразвуковому напряжению сдвига в разные моменты времени. ДНК плазмиды подвергали ультразвуковому напряжению сдвига в течение 0, 10, 20, 30 и 40 минут. Однако нанокомплексы плазмидной ДНК/ИЛ подвергались воздействию ультразвукового напряжения сдвига в течение 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минут.
(исследование и фото: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) продемонстрировали, что когда наноструктуры плазмидной ДНК / ионной жидкости (пДНК/ИЛ) подвергались ультразвуковому напряжению сдвига в течение 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 мин и комплексировались с коммерчески доступным агентом доставки катионных генов липофектамином, процент флуоресцентных положительных клеток составлял 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% и 50% соответственно (см. график ниже). Процент флуоресцентных положительных клеток увеличивался, когда наноструктуры подвергались ультразвуковому напряжению сдвига в течение 10 и 20 минут, а затем медленно уменьшался.

Влияние ионной жидкости [Bmim][PF6] на доставку плазмидной ДНК в клетки COS7. Нанокомплексы плазмидной ДНК/ИЛ (ионной жидкости) подвергались ультразвуковому напряжению сдвига в течение 120 минут и комплексировались с LA перед доставкой в клетки COS7. Данные показывают среднее количество (%) GFP-положительных клеток HeLa, подсчитанных в 10 различных микроскопических полях, и эксперимент проводился несколько раз в три разных дня. (Исследование и диаграмма: ©Sarker et al., 2019)

Ультразвуковая подготовка лизата

Протокол ультразвукового лизиса клеток
Начните с обогащенного образца клеток, который был получен с помощью метода разделения клеток (например, иммуномагнитное разделение клеток, флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS), центрифугирование с градиентом плотности, изоляция клеток иммуноплотности).
Образцы клеток должны иметь объем буфера для лизиса, подходящий для ультразвукового аппарата экспериментальной цели и зондового типа.
Гипотонические буферы предпочтительны, поскольку они усиливают ультразвуковой лизис клеток. Важно, чтобы добавки и концентрация соли использовались надлежащим образом.
Выберите устройство для ультразвукового лизиса: Для непрямой ультразвуковой обработки флаконов рекомендуется использовать VialTweeter или CupHorn. Для многолуночных планшетов UIP400MTP является идеальным ультразвуковым аппаратом. И наиболее подходящими являются классические ультразвуковые обработки зондового типа, ультразвуковой гомогенизатор типа UP100H или UP200Ht с микронаконечником.
Протокол для ультразвуковой обработки с помощью зонда: Поместите ультразвуковой зонд в объем образца в микроцентрифужной пробирке и обрабатывайте ультразвуком в течение примерно 10 секунд. В зависимости от образца ДНК ультразвуковая обработка может повторяться еще один или два раза. Требуемая потребляемая ультразвуковая энергия (Вт/мл) зависит от вязкости образца и типа ДНК. Охлаждение с помощью ледяной бани и пульсационный режим ультразвукового аппарата помогают предотвратить термическую деградацию образца.
После ультразвукового лизиса образец центрифугируется для отделения фрагментов гранул (содержащих нелизированные клетки, ядра и нелизированные органеллы)
Если образец не подвергается немедленной дальнейшей обработке, его можно хранить при соответствующей температуре, чтобы сохранить его жизнеспособность.

Ультразвуковые аппараты для фрагментации ДНК

Hielscher Ultrasonics предлагает различные платформы на основе ультразвука для фрагментации ДНК, РНК и хроматина. Эти различные платформы включают ультразвуковые зонды (сонотроды), решения для непрямой ультразвуковой обработки для одновременной подготовки образцов нескольких пробирок или многолуночных планшетов (например, 96-луночных планшетов, микротитровых планшетов), сонореакторы и ультразвуковые чашечные горны. Все платформы для анализа ДНК оснащены высокопроизводительными ультразвуковыми процессорами с частотной настройкой, которые точно управляются и обеспечивают воспроизводимые результаты.

Ультразвуковые процессоры для любого количества и размера образцов

С помощью многовыборочных ультразвуковых аппаратов Hielscher VialTweeter (до 10 пробирок) и UIP400MTP (для микропланшетов/многолуночных планшетов) можно легко сократить время обработки образцов за счет интенсивного и точно контролируемого ультразвука при одновременном получении желаемого распределения фрагментов ДНК по размерам и выходу. Ультразвуковая фрагментация ДНК делает этапы подготовки плазмид эффективными, надежными и масштабируемыми. Протоколы могут быть линейно масштабированы от одного до нескольких образцов с применением постоянных ультразвуковых параметров.
Зондовые ультразвуковые аппараты с одним-пятью пальцами идеально подходят для подготовки образцов с меньшим количеством образцов. Лабораторные ультразвуковые аппараты Hielscher доступны с различными уровнями мощности, так что вы можете выбрать идеальный ультразвуковой дестабилизатор для вашего приложения, связанного с ДНК.