Плазмидная подготовка ультразвуком

Ультразвук является надежным методом фрагментации плазмидной ДНК. Точно контролируемая амплитуда, режим пульсации и контроль температуры являются наиболее важными особенностями ультразвукового аппарата для неповреждения фрагментации плазмиды. Кроме того, использование определенных агентов помогает защитить от деградации плазмид. Hielscher Ultrasonics предлагает различные решения для контролируемой фрагментации плазмид из отдельных флаконов, одновременной обработки ультразвуком многочисленных образцов, а также пластин с несколькими скважинами. Узнайте больше об успешной ультразвуковой фрагментации плазмид!

Запрос информации




Обратите внимание на наши политика конфиденциальности,


Ультразвуковая фрагментация ДНК является надежным и эффективным методом, обычно используемым в секвенировании следующего поколения (NGS)

The UIP400MTP позволяет точно контролировать ультразвуковые пластины с несколькими скважинами. Одним из применений UIP400MTP является фрагментация плазмидной ДНК с целью получения фрагментов специально целевой длины.

Плазмидная сдвиг с использованием ультразвука

Когда образцы ДНК подвергаются воздействию ультразвуковых волн, ультразвуковые вибрации создают акустическую кавитацию в жидкости, которая сдвигает или разрушает молекулы ДНК с высокой молекулярной массой с помощью механических сил. Обработка ультразвуком является наиболее широко используемым методом для экспериментов по объемной сдвигу ДНК, включая такие приложения, как иммунопреципитация хроматина (ChIP), для которых небольшие размеры фрагментов абсолютно необходимы для получения высокого разрешения. (ср. Ценг и др., 2012)
Плазмидная ДНК (пДНК) является специфической формой ДНК, характеризующейся своей кольцевой формой и встречающейся у бактерий и некоторых эукариот.
Суперспиратанная пДНК является желаемой формой плазмидной ДНК, поскольку она показывает наилучшие результаты в нисходящих процессах, таких как автоматизированное секвенирование и трансфекция. Ультразвук подходит для успешного фрагментирования пДНК, включая суперспиратированную пДНК.
Thompson et al. (2008) продемонстрировали, что плазмидная обработка ультразвуком, которая, как известно, фрагментирует суперспиратированную ДНК, является эффективным способом улучшения длин считывания последовательности phred20 до такой степени, что они существенно не отличаются от контрольного шаблона Бекмана Култера или ферментативно линеаризованных плазмид.

Преимущества ультразвуковой фрагментации ДНК

  • Точно управляемый
  • Воспроизводимые результаты
  • Регулировка длины целевых фрагментов ДНК
  • контроль температуры
  • Масштабируемость до любого размера выборки
На видео показана ультразвуковая система пробоподготовки UIP400MTP, которая позволяет осуществлять надежную пробоподготовку любых стандартных многоскважинных пластин с использованием высокоинтенсивного ультразвука. Типичные применения UIP400MTP включают лизис клеток, сдвиг ДНК, РНК и хроматина, а также экстракцию белка.

Ультразвуковой UIP400MTP для мульти-хорошо звуковой пластины

Использование плазмидных векторов

Плазмиды часто используются в качестве инструментов для клонирования, передачи и манипулирования генами. Когда плазмиды используются экспериментально для этих целей, они называются векторами. Фрагменты ДНК или гены могут быть вставлены в плазмидный вектор, создавая так называемую рекомбинантную плазмиду. Плазмидные векторы используются в качестве транспортных средств для вождения рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина и являются ключевым компонентом молекулярного клонирования.
“Невирусные векторы широко изучаются на предмет их потенциального использования в генной терапии для лечения различных сложных заболеваний. Невирусные векторы защищают плазмидную ДНК от физической, химической и ферментативной деградации и доставляют молекулу ДНК в целевой участок. Например, катионные липосомы, хитозан и другие положительно заряженные наночастицы образуют комплексы с плазмидной ДНК посредством электростатических взаимодействий. Однако легко образующиеся катионные липосомы/плазмидные комплексы ДНК относительно велики (т.е. 300–400 нм) и неоднородны по своей природе, что затрудняет их использование в фармацевтических приложениях. Крупные и гетерогенные плазмидные ДНК/липосомы, плазмидные ДНК/аэрозоли и плазмидные комплексы ДНК/пептидов могут быть сведены к более мелким и однородным частицам с помощью ультразвука.” (Саркер и др., 2019)
Ярким примером использования плазмидных векторов является CRISPR-Cas9. Система CRISPR-Cas9 обычно доставляется к клеткам в виде одной большой плазмиды или нескольких меньших плазмид, которые кодируют целевую последовательность, направляющую CRISPR и Cas9.

Ультразвуковая подготовка нагруженных ДНК наночастиц PLGA методом нанопреципитации

Jo et al. (2020) использовали поли(молочно-когликолевую кислоту) (PLGA) для формирования носителя наночастиц для доставки плазмиды модели CRISPR-Cas9 в первичные макрофаги, полученные из костного мозга. Для нанопреципитации наночастиц PLGA использовали PLGA с двумя различными концевыми группами (эфирные и аминные группы) с целью того, чтобы положительно заряженные концевые крышки аминов увеличивали эффективность инкапсуляции и нагрузки за счет взаимодействия заряда между ней и отрицательно заряженной основой ДНК. В 50 мл полипропиленовой конической центрифужной трубки 100 мг Pluronic F127 растворяли в 20 мл автоклавной воды DI путем вихревого перемешивания с последующим 30 мин щадящей обработки ультразвуком с использованием ультразвуковой ванны (см. КупХорн). Добавляли автоклавный магнитный перемешивающий стержень и раствор смешивали при 600 об/мин в течение 30 мин, пока делали другие растворы. Пластиковая лабораторная посуда использовалась вместо стеклянной посуды повсюду, чтобы свести к минимуму неспецифическую адсорбцию ДНК. Растворы PLGA, растворенные в DMF (44,48 мг/мл) и пентацена TIPS, растворенные в THF (0,667 мг/мл), делали отдельно. PLGA оставляли в состоянии покоя, чтобы намочить в DMF в течение 30 минут, прежде чем его обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут (для полного протокола см. Jo et al., 2020)

Связанные области применения:

  • Извлечение ДНК
  • Инкапсуляция ДНК
  • Дисперсия ДНК, покрытой наночастицами
  • Доставка плазмидной ДНК в клетки
UP200St TD_CupHorn для косвенной sonication образцов

UP200St CupHorn для косвенной обработки образцов ультразвуком, например, для извлечения и фрагментации ДНК.

Запрос информации




Обратите внимание на наши политика конфиденциальности,


Защита плазмидной ДНК во время обработки ультразвуком

ДНК, включая плазмиды и сверхспираточные плазмиды, является высокочувствительной деградацией. Все доступные методы фрагментации известны определенными недостатками. Ультразвуковая фрагментация ДНК является одним из предпочтительных методов, поскольку контролируемая обработка ультразвуком в сочетании с защитными мерами позволяет уменьшить повреждение цепей ДНК, вызванное сдвигом и теплом.
Помимо низких амплитудных установок, режима пульсации и контроля температуры при ультразвуковой сдвиге ДНК, использование некоторых агентов показало значительный защитный эффект против деградации ДНК. Например, различные полимеры, пептиды и липиды защищают плазмидную ДНК во время ультразвука.

Ионные жидкости могут защитить плазмидную ДНК от повреждений во время обработки ультразвуком.

Стабильность плазмидной ДНК и плазмидных ДНК/IL нанокомплексов против ультразвукового сдвигового напряжения исследовали с помощью анализа электрофореза агарозного геля. Как плазмидная ДНК, так и плазмидные нанокомплексы ДНК/IL подвергались ультразвуковому напряжению сдвига в разные моменты времени. Плазмидная ДНК подвергалась ультразвуковому сдвиговому напряжению в течение 0, 10, 20, 30 и 40 минут. Однако плазмидные нанокомплексы ДНК/IL подвергались ультразвуковому напряжению сдвига в течение 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минут.
(исследование и фото: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) продемонстрировали, что когда наноструктуры плазмидной ДНК / ионной жидкости (pDNA / IL) подвергались ультразвуковому сдвиговому напряжению в течение 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 мин и комплексовали с коммерчески доступным катионным агентом доставки генов липофектамином, процент флуоресцентных положительных клеток составлял 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% и 50% соответственно (см. диаграмму ниже). Процент флуоресцентных положительных клеток увеличивался, когда наноструктуры подвергались ультразвуковому сдвиговому напряжению в течение 10 и 20 мин, а затем медленно уменьшался.

Ультразвуковая фрагментация плазмидной ДНК

Влияние ионной жидкости [Bmim][PF6] на доставку плазмидной ДНК к клеткам COS7. Плазмидные нанокомплексы ДНК/IL (ионная жидкость) подвергались ультразвуковому напряжению сдвига в течение 120 минут и комплексировали с LA перед доставкой в клетки COS7. Данные показывают среднее количество (%) GFP-положительных клеток HeLa, подсчитанных в 10 различных микроскопических полях, и эксперимент проводился несколько раз в течение трех разных дней. (Исследование и диаграмма: ©Sarker et al., 2019)

Плазмидная ДНК может быть защищена добавлением агента перед ультразвуковой фрагментацией.

Плазмидная ДНК может быть защищена добавлением агента перед ультразвуковой фрагментацией: вызванная ультразвуком деградация голой пДНК (А) и пДНК, состоящая из 1,5 мМ CaCl2 и 20% (v/v) t-бутанола (B)
Образцы были обработаны ультразвуком с помощью зонда мощностью 20 Вт на срок до 120 секунд, как указано в верхней части каждой полосы. Полоса H соответствует маркеру Hyperladder I ™️. Показаны плазмидные полосы OC и SC.
(исследование и фотографии: ©Wu et al., 2009)

Ультразвуковой препарат лизата

Протокол ультразвукового лизиса клеток
Ультразвуковой аппарат UP200Ht с микроконтактом S26d2 для ультразвукового лизиса биологических образцовНачните с обогащенного образца клеток, который был получен методом разделения клеток (например, иммуномагнитное разделение клеток, флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS), центрифугирование градиента плотности, изоляция клеток иммуноденции).
Образцы клеток должны показывать объем лизисного буфера, соответствующий экспериментальной цели и ультразвуковому аппарату зондового типа.
Гипотонические буферы являются предпочтительными, поскольку они усиливают ультразвуковой лизис клеток. Важно, чтобы добавки и концентрация соли использовались надлежащим образом.
Выберите устройство для ультразвукового лизиса: для непрямой обработки флаконов ультразвуком рекомендуются VialTweeter или CupHorn. Для многолуночных пластин UIP400MTP является идеальным ультразвуковым аппаратом. И классическая обработка ультразвуком зондового типа, ультразвуковой гомогенизатор, такой как UP100H или UP200Ht с микрокончиком, являются наиболее подходящими.
Протокол обработки ультразвуком зондового типа: Поместите зонд ультразвукового аппарата в объем образца в микроцентрифужную трубку и храните ультразвуком в течение примерно 10 секунд. В зависимости от образца ДНК обработка ультразвуком может быть повторена еще один или два раза. Требуемая ультразвуковая энергия (Ws/mL) зависит от вязкости образца и типа ДНК. Охлаждение с помощью ледяной ванны и режим пульсации ультразвукового аппарата помогает предотвратить термическую деградацию образца.
После ультразвукового лизиса образец центрифугируют для разделения гранулированного мусора (содержащего нелизованные клетки, ядра и нелизированные органеллы)
Если образец не подвергается немедленной дальнейшей обработке, его можно хранить при соответствующей температуре для сохранения его жизнеспособности.

Ультразвуковые аппараты для фрагментации ДНК

Hielscher Ultrasonics предлагает различные ультразвуковые платформы для фрагментации ДНК, РНК и хроматина. Эти различные платформы включают ультразвуковые зонды (сонотроды), растворы для косвенной ультразвуковой подготовки для одновременной пробоподготовки нескольких трубок или многосквозных пластин (например, плит с 96 скважинами, микротитровыми пластинами), сонореакторы и ультразвуковые купхорны. Все платформы для сдвига ДНК оснащены высокопроизводительными ультразвуковыми процессорами с частотной настройкой, которые точно контролируются и обеспечивают воспроизводимые результаты.

Ультразвуковые процессоры для любого номера и размера образца

С помощью многопрофильных ультразвуковых аппаратов Hielscher VialTweeter (до 10 пробирок) и UIP400MTP (для микропластин / многолуночных пластин) становится легко возможным сократить время обработки образцов за счет интенсивной и точно контролируемой ультразвуковой обработки при получении желаемого распределения и выхода фрагментов ДНК. Ультразвуковая фрагментация ДНК делает этапы подготовки плазмид эффективными, надежными и масштабируемыми. Протоколы могут быть линейно масштабированы от одного до нескольких образцов путем применения постоянных параметров ультразвука.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Ультразвуковая установка многопрофильной подготовки VialTweeter позволяет одновременное звуковое околение до 10 флаконов. С зажимом на устройстве VialPress, до 4 дополнительных трубок могут быть прижаты к передней для интенсивного sonication.

точный контроль процесса

Ультразвуковыми аппаратами Hielscher можно дистанционно управлять через браузер. Параметры обработки ультразвуком можно контролировать и корректировать точно в соответствии с требованиями процесса.Точно контролируемые настройки ультразвука имеют решающее значение, поскольку исчерпывающая сонификация может разрушить ДНК, РНК и хроматин, но неадекватная ультразвуковая сдвиг приводит к слишком длинным фрагментам ДНК и хроматина. Цифровые ультразвуковые аппараты Hielscher могут быть легко настроены на точный параметр обработки ультразвуком. Конкретные настройки ультразвука также могут быть сохранены как запрограммированная настройка для быстрого повторения одной и той же процедуры.
Все ультразвуковые вычисления автоматически протоколируются и сохраняются в виде CSV-файла на встроенной SD-карте. Это позволяет точно документировать выполненные испытания и позволяет легко пересматривать прогоны ультразвука.
С помощью пульта дистанционного управления браузером все цифровые ультразвуковые аппараты могут управляться и контролироваться с помощью любого стандартного браузера. Установка дополнительного программного обеспечения не требуется, так как подключение к локальной сети является очень простой настройкой plug-n-play.

Высочайшее удобство использования при ультразвуковой подготовке ДНК

Все ультразвуковые аппараты Hielscher предназначены для обеспечения высокопроизводительного ультразвука, в то же время всегда будучи очень удобными и простыми в эксплуатации. Все настройки хорошо структурированы в четком меню, к которому можно легко получить доступ с помощью цветного сенсорного дисплея или пульта дистанционного управления браузера. Интеллектуальное программное обеспечение с программируемыми настройками и автоматической записью данных обеспечивает оптимальные настройки ультразвука для надежных и воспроизводимых результатов. Чистый и простой в использовании интерфейс меню превращает ультразвуковые аппараты Hielscher в удобные и эффективные устройства.
Приведенная ниже таблица дает вам представление о приблизительной производительности обработки наших лабораторных ультразвуковых аппаратов для лизиса клеток и фрагментации ДНК:

Объем партии Скорость потока Рекомендуемые устройства
многоскважинные плиты н/д UIP400MTP
флаконы, маленький стакан н/д Ультразвуковой CupHorn
до 10 флаконов н/д VialTweeter
От 1 до 500 мл От 10 до 200 мл / мин UP100H
От 10 до 2000 мл От 20 до 400 мл / мин Uf200 ः т, UP400St

Свяжитесь с нами! / Спросите нас!

Запросить дополнительную информацию

Пожалуйста, используйте форму ниже, чтобы запросить дополнительную информацию об ультразвуковых гомогенизаторах для экстракции и фрагментации ДНК, протоколах применения и ценах. Мы будем рады обсудить с Вами Ваш процесс и предложить Вам ультразвуковую систему, отвечающую Вашим требованиям!









Пожалуйста, обратите внимание на наши политика конфиденциальности,




Литература / Ссылки

Полезные сведения

Что такое плазмиды?
Плазмида представляет собой небольшую круговую молекулу ДНК, которая физически отделена от хромосомной ДНК и реплицируется независимо. Плазмиды часто связаны с генами, которые способствуют выживанию организма и придают определенные преимущества, например, устойчивость к антибиотикам. Плазмиды чаще всего встречаются в виде небольших круглых, двухцепочечных молекул ДНК у бактерий; однако плазмиды иногда присутствуют в археях и эукариотических организмах. Плазмиды являются важными инструментами в молекулярной биологии, генетике, биохимии и науках о жизни. Известные как векторы в генной инженерии, плазмиды используются для репликации или экспрессии определенных генов. Целевое изменение вектора называется векторным дизайном.

Анализ GFP в исследованиях клеток
Зеленый флуоресцентный белок (GFP) является универсальным биологическим маркером для мониторинга физиологических процессов, визуализации локализации белка и обнаружения трансгенной экспрессии in vivo. GFP может возбуждаться лазерной линией 488 нм и оптимально обнаруживается на 510 нм.


Высокоэффективный ультразвук! Ассортимент продукции Hielscher охватывает весь спектр от компактного лабораторного ультразвукового аппарата до полностью промышленных ультразвуковых систем.

Hielscher Ultrasonics производит высокую производительность ультразвуковых гомогенизаторов из лаборатория в промышленного размера.