Ультразвук является надежным методом фрагментации плазмидной ДНК. Точно контролируемая амплитуда, режим пульсации и контроль температуры являются наиболее важными особенностями ультразвукового аппарата для неповреждения фрагментации плазмиды. Кроме того, использование определенных агентов помогает защитить от деградации плазмид. Hielscher Ultrasonics предлагает различные решения для контролируемой фрагментации плазмид из отдельных флаконов, одновременной обработки ультразвуком многочисленных образцов, а также пластин с несколькими скважинами. Узнайте больше об успешной ультразвуковой фрагментации плазмид!

Плазмидная сдвиг с использованием ультразвука

Когда образцы ДНК подвергаются воздействию ультразвуковых волн, ультразвуковые вибрации создают акустическую кавитацию в жидкости, которая сдвигает или разрушает молекулы ДНК с высокой молекулярной массой с помощью механических сил. Обработка ультразвуком является наиболее широко используемым методом для экспериментов по объемной сдвигу ДНК, включая такие приложения, как иммунопреципитация хроматина (ChIP), для которых небольшие размеры фрагментов абсолютно необходимы для получения высокого разрешения. (ср. Ценг и др., 2012)
Плазмидная ДНК (пДНК) является специфической формой ДНК, характеризующейся своей кольцевой формой и встречающейся у бактерий и некоторых эукариот.
Суперспиратанная пДНК является желаемой формой плазмидной ДНК, поскольку она показывает наилучшие результаты в нисходящих процессах, таких как автоматизированное секвенирование и трансфекция. Ультразвук подходит для успешного фрагментирования пДНК, включая суперспиратированную пДНК.
Thompson et al. (2008) продемонстрировали, что плазмидная обработка ультразвуком, которая, как известно, фрагментирует суперспиратированную ДНК, является эффективным способом улучшения длин считывания последовательности phred20 до такой степени, что они существенно не отличаются от контрольного шаблона Бекмана Култера или ферментативно линеаризованных плазмид.

Использование плазмидных векторов

Плазмиды часто используются в качестве инструментов для клонирования, передачи и манипулирования генами. Когда плазмиды используются экспериментально для этих целей, они называются векторами. Фрагменты ДНК или гены могут быть вставлены в плазмидный вектор, создавая так называемую рекомбинантную плазмиду. Плазмидные векторы используются в качестве транспортных средств для вождения рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина и являются ключевым компонентом молекулярного клонирования.
“Невирусные векторы широко изучаются на предмет их потенциального использования в генной терапии для лечения различных сложных заболеваний. Невирусные векторы защищают плазмидную ДНК от физической, химической и ферментативной деградации и доставляют молекулу ДНК в целевой участок. Например, катионные липосомы, хитозан и другие положительно заряженные наночастицы образуют комплексы с плазмидной ДНК посредством электростатических взаимодействий. Однако легко образующиеся катионные липосомы/плазмидные комплексы ДНК относительно велики (т.е. 300–400 нм) и неоднородны по своей природе, что затрудняет их использование в фармацевтических приложениях. Крупные и гетерогенные плазмидные ДНК/липосомы, плазмидные ДНК/аэрозоли и плазмидные комплексы ДНК/пептидов могут быть сведены к более мелким и однородным частицам с помощью ультразвука.” (Саркер и др., 2019)
Ярким примером использования плазмидных векторов является CRISPR-Cas9. Система CRISPR-Cas9 обычно доставляется к клеткам в виде одной большой плазмиды или нескольких меньших плазмид, которые кодируют целевую последовательность, направляющую CRISPR и Cas9.

Ультразвуковая подготовка нагруженных ДНК наночастиц PLGA методом нанопреципитации

Jo et al. (2020) использовали поли(молочно-когликолевую кислоту) (PLGA) для формирования носителя наночастиц для доставки плазмиды модели CRISPR-Cas9 в первичные макрофаги, полученные из костного мозга. Для нанопреципитации наночастиц PLGA использовали PLGA с двумя различными концевыми группами (эфирные и аминные группы) с целью того, чтобы положительно заряженные концевые крышки аминов увеличивали эффективность инкапсуляции и нагрузки за счет взаимодействия заряда между ней и отрицательно заряженной основой ДНК. В 50 мл полипропиленовой конической центрифужной трубки 100 мг Pluronic F127 растворяли в 20 мл автоклавной воды DI путем вихревого перемешивания с последующим 30 мин щадящей обработки ультразвуком с использованием ультразвуковой ванны (см. КупХорн). Добавляли автоклавный магнитный перемешивающий стержень и раствор смешивали при 600 об/мин в течение 30 мин, пока делали другие растворы. Пластиковая лабораторная посуда использовалась вместо стеклянной посуды повсюду, чтобы свести к минимуму неспецифическую адсорбцию ДНК. Растворы PLGA, растворенные в DMF (44,48 мг/мл) и пентацена TIPS, растворенные в THF (0,667 мг/мл), делали отдельно. PLGA оставляли в состоянии покоя, чтобы намочить в DMF в течение 30 минут, прежде чем его обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут (для полного протокола см. Jo et al., 2020)

Защита плазмидной ДНК во время обработки ультразвуком

ДНК, включая плазмиды и сверхспираточные плазмиды, является высокочувствительной деградацией. Все доступные методы фрагментации известны определенными недостатками. Ультразвуковая фрагментация ДНК является одним из предпочтительных методов, поскольку контролируемая обработка ультразвуком в сочетании с защитными мерами позволяет уменьшить повреждение цепей ДНК, вызванное сдвигом и теплом.
Помимо низких амплитудных установок, режима пульсации и контроля температуры при ультразвуковой сдвиге ДНК, использование некоторых агентов показало значительный защитный эффект против деградации ДНК. Например, различные полимеры, пептиды и липиды защищают плазмидную ДНК во время ультразвука.

Стабильность плазмидной ДНК и плазмидных ДНК/IL нанокомплексов против ультразвукового сдвигового напряжения исследовали с помощью анализа электрофореза агарозного геля. Как плазмидная ДНК, так и плазмидные нанокомплексы ДНК/IL подвергались ультразвуковому напряжению сдвига в разные моменты времени. Плазмидная ДНК подвергалась ультразвуковому сдвиговому напряжению в течение 0, 10, 20, 30 и 40 минут. Однако плазмидные нанокомплексы ДНК/IL подвергались ультразвуковому напряжению сдвига в течение 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минут.
(исследование и фото: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) продемонстрировали, что когда наноструктуры плазмидной ДНК / ионной жидкости (pDNA / IL) подвергались ультразвуковому сдвиговому напряжению в течение 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 мин и комплексовали с коммерчески доступным катионным агентом доставки генов липофектамином, процент флуоресцентных положительных клеток составлял 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% и 50% соответственно (см. диаграмму ниже). Процент флуоресцентных положительных клеток увеличивался, когда наноструктуры подвергались ультразвуковому сдвиговому напряжению в течение 10 и 20 мин, а затем медленно уменьшался.

Влияние ионной жидкости [Bmim][PF6] на доставку плазмидной ДНК к клеткам COS7. Плазмидные нанокомплексы ДНК/IL (ионная жидкость) подвергались ультразвуковому напряжению сдвига в течение 120 минут и комплексировали с LA перед доставкой в клетки COS7. Данные показывают среднее количество (%) GFP-положительных клеток HeLa, подсчитанных в 10 различных микроскопических полях, и эксперимент проводился несколько раз в течение трех разных дней. (Исследование и диаграмма: ©Sarker et al., 2019)

Ультразвуковой препарат лизата

Протокол ультразвукового лизиса клеток
Начните с обогащенного образца клеток, который был получен методом разделения клеток (например, иммуномагнитное разделение клеток, флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS), центрифугирование градиента плотности, изоляция клеток иммуноденции).
Образцы клеток должны показывать объем лизисного буфера, соответствующий экспериментальной цели и ультразвуковому аппарату зондового типа.
Гипотонические буферы являются предпочтительными, поскольку они усиливают ультразвуковой лизис клеток. Важно, чтобы добавки и концентрация соли использовались надлежащим образом.
Выберите устройство для ультразвукового лизиса: для непрямой обработки флаконов ультразвуком рекомендуются VialTweeter или CupHorn. Для многолуночных пластин UIP400MTP является идеальным ультразвуковым аппаратом. И классическая обработка ультразвуком зондового типа, ультразвуковой гомогенизатор, такой как UP100H или UP200Ht с микрокончиком, являются наиболее подходящими.
Протокол обработки ультразвуком зондового типа: Поместите зонд ультразвукового аппарата в объем образца в микроцентрифужную трубку и храните ультразвуком в течение примерно 10 секунд. В зависимости от образца ДНК обработка ультразвуком может быть повторена еще один или два раза. Требуемая ультразвуковая энергия (Ws/mL) зависит от вязкости образца и типа ДНК. Охлаждение с помощью ледяной ванны и режим пульсации ультразвукового аппарата помогает предотвратить термическую деградацию образца.
После ультразвукового лизиса образец центрифугируют для разделения гранулированного мусора (содержащего нелизованные клетки, ядра и нелизированные органеллы)
Если образец не подвергается немедленной дальнейшей обработке, его можно хранить при соответствующей температуре для сохранения его жизнеспособности.

Ультразвуковые аппараты для фрагментации ДНК

Hielscher Ultrasonics предлагает различные ультразвуковые платформы для фрагментации ДНК, РНК и хроматина. Эти различные платформы включают ультразвуковые зонды (сонотроды), растворы для косвенной ультразвуковой подготовки для одновременной пробоподготовки нескольких трубок или многосквозных пластин (например, плит с 96 скважинами, микротитровыми пластинами), сонореакторы и ультразвуковые купхорны. Все платформы для сдвига ДНК оснащены высокопроизводительными ультразвуковыми процессорами с частотной настройкой, которые точно контролируются и обеспечивают воспроизводимые результаты.

Ультразвуковые процессоры для любого номера и размера образца

С помощью многопрофильных ультразвуковых аппаратов Hielscher VialTweeter (до 10 пробирок) и UIP400MTP (для микропластин / многолуночных пластин) становится легко возможным сократить время обработки образцов за счет интенсивной и точно контролируемой ультразвуковой обработки при получении желаемого распределения и выхода фрагментов ДНК. Ультразвуковая фрагментация ДНК делает этапы подготовки плазмид эффективными, надежными и масштабируемыми. Протоколы могут быть линейно масштабированы от одного до нескольких образцов путем применения постоянных параметров ультразвука.
Зондовые ультразвуковые аппараты с одним-пятью пальцами идеально подходят для подготовки меньших количеств образцов. Лабораторные ультразвуковые аппараты Hielscher доступны с различными уровнями мощности, так что вы можете выбрать идеальный ультразвуковой разрушитель для вашего применения, связанного с ДНК.