Депарафинизация и экстракция белков из FFPE

Облегчите экстракцию белков из срезов тканей, фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE), используя оптимизированное сочетание депарафинизации, солюбилизации и обработки ультразвуком с помощью многопробирочного ультразвукового устройства VialTweeter. Этот протокол позволяет проводить последующий протеомный анализ на основе масс-спектрометрии и совместим с рабочими процессами очистки методом SP3 и ферментативного расщепления.

Эта стандартная операционная процедура (СОП) предназначена для сотрудников лабораторий, проводящих протеомный анализ образцов тканей FFPE с использованием высокоэффективной обработки ультразвуком. Она оптимизирована для параллельной обработки до десяти образцов FFPE с помощью многопробирочного ультразвукового устройства VialTweeter.

Протокол: экстракция белков из образцов FFPE с помощью VialTweeter

Материалы и реагенты

Реагенты

• Ксилол (для гистологии)
• Этанол (абсолютный 96%)
• Буфер для лизиса:

6 M гидрохлорид гуанидина
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine)
40 mM CAA (2-Chloroacetamide)

• Ингибитор протеаз (необязательно; например, cOmplete™ mini без ЭДТА)

Оборудование

• Многопробирочное ультразвуковое устройство VialTweeter
• Микроцентрифужные пробирки объёмом 1,5 mL или 2,0 mL с низким связыванием белков
• Нагревательный блок или инкубатор (настройки 95°C и 80°C)
• Микроцентрифуга
• Термомиксер (необязательно, но рекомендуется)

Исходный материал

• 1–2 среза ткани FFPE толщиной 10 µm на образец (т. е. на пробирку)

ИЛИ

• В общей сложности ~100 µg ткани на образец (т. е. на пробирку)

Примечание: используйте новые лезвия для микротомии, чтобы свести к минимуму загрязнение частицами парафина.

Порядок выполнения

1. Депарафинизация
   1. Перенесите срезы FFPE в микроцентрифужные пробирки с низким связыванием белков.
   2. Добавьте 1 mL ксилола и кратковременно перемешайте на вортексе.
   3. Инкубируйте 10 минут при комнатной температуре.
   4. Центрифугируйте при 14 000 × g в течение 2 минут; удалите супернатант.
   5. Повторите промывку ксилолом ещё один раз (шаги 2–4).
   6. Промойте осадок 1 mL 96% этанола, перемешайте на вортексе, затем центрифугируйте при 14 000 × g в течение 2 минут. Удалите супернатант.
   7. Повторите промывку этанолом ещё один раз (всего 2 промывки этанолом).
   8. Высушите осадок на воздухе в течение 10 минут при комнатной температуре с открытыми крышками, чтобы испарить остатки этанола.
2. Экстракция белков и обработка ультразвуком
   1. Добавьте 200 µL буфера для лизиса к каждому сухому осадку.

      Примечание: хотя ультразвуковое устройство вмещает до 1 mL, объём 200 µL оптимален для последующей обработки.

   2. Перемешайте на вортексе или осторожным пипетированием.
3. Первая термическая инкубация
   1. Инкубируйте пробирки при 95 °C в течение 30 min с перемешиванием при 400 rpm, используя термомиксер или нагревательный блок.
   2. Дайте образцам остыть при комнатной температуре в течение 5 min.
4. Первая обработка ультразвуком с помощью VialTweeter
   1. Поместите пробирки в VialTweeter.
   2. Установите для VialTweeter UP200St приведённые ниже значения и проведите обработку ультразвуком.
Настройки ультразвукового устройства
• Установите амплитуду (A) на 100%
• Установите режим пульсации (C) на 100%
• Таймер периодов: включён
• Время включения: 60s
• Время выключения: 30s
• Предельное значение: 15 min (соответствует 10 циклам)
(Примечание к расчёту: (60 s включено + 30 s выключено) × 10 циклов = 900 s = 15 min)
5. Вторая термическая инкубация
   Извлеките пробирки и снова инкубируйте при 95 °C в течение 15 min, 400 rpm.
6. Вторая обработка ультразвуком
   Повторите обработку ультразвуком на VialTweeter с теми же настройками (указанными выше), выполнив ещё 10 циклов (всего 15 min).
7. Осветление лизата
   1. Центрифугируйте образцы при 13 000 × g в течение 10 min при 23°C (комнатная температура).
   2. Осторожно перенесите супернатант в новую пробирку Eppendorf Safe-lock объёмом 2,0 mL. Не нарушайте осадок.
8. Последующая обработка
   Теперь лизат готов к очистке методом SP3 и ферментативному расщеплению.

Примечания и рекомендации

1. Риск перегрева во время обработки ультразвуком снижается благодаря запрограммированным циклам включения и выключения.
2. Не перемешивайте на вортексе после обработки ультразвуком, чтобы предотвратить агрегацию белков.

Утилизация отходов и безопасность

Таблица ниже даёт представление о приблизительной производительности наших лабораторных ультразвуковых устройств: