Депарафинизация и экстракция белка из FFPE

Упростите экстракцию белка из фиксированных формалином парафинов (FFPE) с помощью оптимизированной комбинации депарафинизации, солюбилизации и ультразвука с помощью многотрубочного ультразвукового аппарата VialTweeter. Этот протокол поддерживает протеомику на основе масс-спектрометрии и совместим с рабочими процессами очистки SP3 и ферментативного разложения.

Данная СОП предназначена для сотрудников лабораторий, занимающихся протеомным анализом образцов тканей FFPE с использованием высокопроизводительной ультразвуковой обработки. Он оптимизирован для одновременной обработки до десяти образцов FFPE с помощью многотрубочного ультразвукового аппарата VialTweeter.

Протокол: Экстракция белка из образцов FFPE с помощью VialTweeter

Материалы и реагенты

Реагентов

• Ксилол (степень гистологии)
• Этанол (абсолютный 96%)
• Буфер для лизиса:

6 М гуанидина гидрохлорид
50 мМ Tris-HCl, pH 8,5
10 мМ TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфин)
40 мМ CAA (2-хлорацетамид)

• Ингибитор протеазы (опционально; например, cOmplete™ mini EDTA-free)

Оборудование

• VialTweeter Многотрубный ультразвуковой аппарат
• Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл или 2,0 мл с низким связыванием
• Тепловой блок или инкубатор (настройки 95°C и 80°C)
• Микроцентрифуга
• Термомиксер (опционально, но рекомендуется)

Пример входных данных

• 1–2 среза ткани FFPE толщиной 10 мкм на образец (т. е. на флакон)

или

• Итого ~100 мкг ткани на образец (т.е. на флакон)

Примечание: Используйте свежие лезвия для микротомии, чтобы свести к минимуму загрязнение парафиновыми обломками.

Процедура

1. депарафинизация
   1. Переложите секции FFPE в микроцентрифужные пробирки с низким связыванием.
   2. Добавьте 1 мл ксилола, быстро перемешайте.
   3. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре.
   4. Центрифугируйте при 14 000 × г в течение 2 минут; Выбросьте надосадочную жидкость.
   5. Повторите промывку ксилолом еще раз (шаги 2–4).
   6. Промойте гранулу 1 мл 96% этанола, вортексом, затем центрифугируйте при 14 000 × г в течение 2 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
   7. Повторите промывку этанолом еще раз (всего 2 промывки этанолом).
   8. Высушите пеллеты на воздухе в течение 10 минут при комнатной температуре при открытых крышках для испарения остатков этанола.
2. Экстракция белка и ультразвуковая обработка
   1. Добавьте 200 мкл буфера для лизиса в каждую сухую гранулу.
      Примечание: Несмотря на то, что ультразвуковой аппарат вмещает до 1 мл, 200 мкл является оптимальным для последующей обработки.

   2. Перемешайте с помощью вортекса или аккуратного пипетирования.
3. Первая термическая инкубация
   1. Инкубируйте пробирки при температуре 95 °C в течение 30 минут, перемешивая при 400 об/мин с помощью термомиксера или теплового блока.
   2. Дайте образцам остыть при комнатной температуре в течение 5 минут.
4. Первая ультразвуковая обработка с помощью VialTweeter
   1. Поместите трубки в VialTweeter.
   2. Установите VialTweeter UP200St на следующие значения и произведите ультразвуковую обработку.
Настройки ультразвукового аппарата
• Установите амплитуду (A) на 100%
• Установите режим пульсации (C) на 100%
• Часы периода: Вкл
• Вовремя: 60-е годы
• Время выключения: 30 с
• Предельное значение: 15 мин (соответствует 10 циклам)
(Примечание по расчету: (60 с вкл. + 30 с выкл.) × 10 циклов = 900 с = 15 мин)
5. Вторая термическая инкубация
   Извлеките трубки и снова инкубируйте при температуре 95 °C в течение 15 мин, 400 об/мин.
6. Вторая ультразвук
   Повторите ультразвуковую обработку на VialTweeter с теми же настройками (как указано выше) в течение дополнительных 10 циклов (всего 15 минут).
7. Осветление лизата
   1. Центрифугируйте образцы при давлении 13 000 × г в течение 10 минут при температуре 23°C (комнатная температура).
   2. Осторожно соберите надосадочную жидкость в новую пробирку Safe-lock Eppendorf объемом 2,0 мл. Не тревожьте гранулы.
8. Последующая переработка
   Теперь лизат готов к очистке SP3 и ферментативному перевариванию.

Примечания и рекомендации

1. Риск перегрева во время ультразвуковой обработки снижается за счет запрограммированного циклического включения/выключения.
2. Избегайте завихрения после ультразвуковой обработки, чтобы предотвратить агрегацию белков.

Утилизация отходов и безопасность

В таблице ниже приведена приблизительная производительность обработки наших лабораторных ультразвуковых аппаратов: