Протокол использования ультразвуковых устройств Hielscher для одновременной обработки нескольких образцов при исследовании биоплёнок и протеомном анализе

Использование ультразвуковых устройств для одновременной обработки нескольких образцов, таких как устройство VialTweeter для обработки нескольких пробирок и устройство UIP400MTP для обработки микропланшетов, оптимизирует лабораторные рабочие процессы для задач с высокой производительностью. Оба устройства обеспечивают точную и равномерную обработку ультразвуком нескольких образцов, минимизируя вариабельность и повышая воспроизводимость. Это особенно полезно в экспериментах, требующих одинакового лизиса образцов, отделения биоплёнок, экстракции белков или протеолитического расщепления, где ручные методы или методы обработки отдельных образцов менее эффективны и склонны давать неодинаковые результаты.

Оптимизация рабочих процессов с помощью ультразвуковых устройств для одновременной обработки нескольких образцов

Например, UIP400MTP позволяет одновременно обрабатывать ультразвуком содержимое лунок микропланшета, обеспечивая равномерное отделение биоплёнок или клеточного материала. В свою очередь, VialTweeter обеспечивает точный лизис и гомогенизацию нескольких образцов в пробирках без перекрёстного загрязнения. Эти ультразвуковые устройства значительно сокращают время обработки, повышают воспроизводимость экспериментов и сохраняют высокую целостность образцов, что делает их незаменимыми инструментами в исследованиях по микробиологии, протеомике и молекулярной биологии.
Ниже приведён подробный протокол, иллюстрирующий использование моделей ультразвуковых устройств Hielscher для одновременной обработки нескольких образцов – устройства VialTweeter для обработки нескольких пробирок и устройства UIP400MTP для обработки микропланшетов – в исследовании формирования биоплёнки E. coli и последующего протеомного анализа.

Протокол: формирование и отделение биоплёнок и протеомный анализ с использованием ультразвуковых устройств Hielscher для одновременной обработки нескольких образцов

1. Подготовка бактериальной культуры

• Культивируйте бактерии E. coli (штамм W3110) при 30°C, температуре, благоприятной для формирования биоплёнок E. coli, в среде на основе триптонового бульона (TB), содержащей:
  – 10 g/L триптона
  – 5 g/L NaCl
• При необходимости добавляйте антибиотики, чтобы обеспечить сохранение плазмид.
• Для микроскопии и исследований активности промоторов используйте штамм E. coli W3110 с геномным репортёром на основе усиленного GFP (eGFP) под контролем промотора rplL.
• Используйте репортёрные плазмиды GFP для различных промоторов (например, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) для измерения активности промоторов.

2. Выращивание и отделение биоплёнок

• Внесите по 1,5 mL разбавленной бактериальной культуры в каждую лунку 12-луночного планшета (12-луночные планшеты CellStar, Greiner Bio-One).
• Инкубируйте для формирования биоплёнки.
• Осторожно удалите планктонную (неприкреплённую) культуру.

– Промойте каждую лунку 500 µL PBS.
– Отделите прикреплённые клетки, обработав 12-луночный планшет ультразвуком в устройстве UIP400MTP для микропланшетов. UIP400MTP обеспечивает равномерное отделение благодаря одинаковой передаче ультразвуковой энергии во все лунки.
– Настройки обработки ультразвуком: амплитуда 60%, циклический режим: 60 sec ВКЛ. / 30 sec ВЫКЛ.

3. Сбор и лизис клеток

• Центрифугируйте отделённые клетки биоплёнки при 4 500 g в течение 5 минут.
• Промойте осаждённые клетки PBS.
• Ресуспендируйте клетки в 100 µL 2% лауроилсаркозината натрия (SLS) и инкубируйте при 95°C в течение 15 минут.
• Обработайте ультразвуком с помощью устройства VialTweeter для обработки нескольких пробирок, чтобы обеспечить полный лизис клеток.
  – Настройки обработки ультразвуком: амплитуда 100%, 50 s ВКЛ. / 10 s ВЫКЛ., общее время работы 10 min; держите образцы на льду.

4. Восстановление и алкилирование

• Добавьте 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) для восстановления дисульфидных связей и инкубируйте при 95°C в течение 15 минут.
• Алкилируйте белки 10 mM йодацетамида в течение 30 минут при 25°C.

5. Количественное определение и расщепление белков

• Центрифугируйте лизаты для удаления клеточных остатков.
• Определите общее содержание белка с помощью набора Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Расщепите 50 µg общего белка с помощью 1 µg трипсина в растворе, содержащем 2% SLS и 100 mM бикарбоната аммония.
• Инкубируйте реакционную смесь для расщепления в течение ночи при 30°C.

6. Очистка пептидов

• Осадите SLS, добавив 1,5% трифторуксусной кислоты (TFA), затем центрифугируйте.
• Очистите пептиды с помощью центрифужных микроколонок C18.
• Высушите очищенные пептиды и ресуспендируйте их в 0,1% TFA.

7. Жидкостная хроматография – масс-спектрометрия (LC-MS/MS)

• Проанализируйте пептиды на масс-спектрометре Q-Exactive Plus, соединённом с системой Ultimate 3000 RSLC nano.
• Разделите пептиды с помощью колонки для обращённо-фазовой ВЭЖХ (75 µm × 42 cm), заполненной сорбентом C18 (2,4 µm).
• Применяйте градиент от 2% до 35% растворителя B (ацетонитрил с 0,15% муравьиной кислоты) в течение 140 минут.
• Получайте данные с помощью сканирования MS высокого разрешения с последующим тандемным сканированием MS/MS 10 ионов с наибольшей интенсивностью.

8. Анализ данных

• Обработайте исходные данные LC-MS с помощью программного обеспечения Progenesis.
• Экспортируйте файлы .mgf и проанализируйте их с помощью MASCOT.
• Выполните количественное определение пептидов с помощью SafeQuant для контроля качества и корректировки ложных обнаружений.
• Проводите все эксперименты в двух или трёх повторностях, чтобы обеспечить воспроизводимость.

Ультразвуковые устройства для одновременной обработки нескольких образцов и высокопроизводительной пробоподготовки

Модели ультразвуковых устройств VialTweeter и UIP400MTP для одновременной обработки нескольких образцов значительно повышают точность и эффективность экспериментальных рабочих процессов, особенно в исследованиях биоплёнок и протеомике. Их способность равномерно обрабатывать несколько образцов обеспечивает высокую производительность без ущерба для качества данных. Эти преимущества в сочетании с оптимизированными рабочими процессами, описанными выше, делают ультразвуковые устройства Hielscher для одновременной обработки нескольких образцов необходимыми инструментами для современных биологических исследований.

Проектирование, производство и консультирование – качество из Германии

Ультразвуковые устройства Hielscher хорошо известны высочайшими стандартами качества и проектирования. Прочность и простота эксплуатации позволяют легко интегрировать наши ультразвуковые устройства в промышленные установки. Ультразвуковые устройства Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными производственными средами.

Hielscher Ultrasonics – компания, сертифицированная по ISO, которая уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым устройствам, сочетающим передовые технологии и удобство использования. Разумеется, ультразвуковые устройства Hielscher соответствуют требованиям CE и отвечают требованиям UL, CSA и RoHs.