Протокол с использованием многовыборочных ультразвуковиков Hielscher в биопленочном и протеомном анализе

Использование многовыборочных ультразвуковых аппаратов, таких как многотрубочный ультразвуковой аппарат VialTweeter и ультразвуковой аппарат UIP400MTP Microplate, оптимизирует лабораторные рабочие процессы для высокопроизводительных приложений. Оба устройства обеспечивают точную и равномерную ультразвуковую обработку нескольких образцов, сводя к минимуму вариативность и повышая воспроизводимость. Это особенно выгодно в экспериментах, требующих последовательного лизиса образца, отделения биопленки, экстракции белка или протеолитического расщепления, где ручные методы или методы с одним образцом менее эффективны и подвержены несогласованности.

Оптимизируйте рабочие процессы с помощью ультразвуковых аппаратов с несколькими образцами

Например, UIP400MTP позволяет проводить одновременную ультразвуковую обработку лунок микропланшетов, обеспечивая равномерное отделение биопленок или клеточного материала. Между тем, VialTweeter обеспечивает точный лизис и гомогенизацию нескольких образцов пробирок без перекрестного загрязнения. Эти ультразвуковые аппараты значительно сокращают время обработки, улучшают экспериментальную воспроизводимость и поддерживают высокую целостность образца, что делает их незаменимыми инструментами в исследованиях в области микробиологии, протеомики и молекулярной биологии.
Ниже приведен подробный протокол, иллюстрирующий использование моделей многовыборочных ультразвуковых аппаратов Hielscher, многотрубочного ультразвукового аппарата VialTweeter и ультразвукового аппарата Microplate Sonicator UIP400MTP, в исследовании, включающем образование биопленки E. coli и последующий протеомный анализ.

Протокол: Формирование, отслойка и протеомный анализ биопленки с использованием многообразных ультразвуковиков Hielscher

1. Подготовка бактериальной культуры

• Культивирование бактерий E. coli (штамм W3110) при температуре 30°С, благоприятной для образования биопленки E. coli, в среде триптонного бульона (ТБ), содержащей:
  – 10 г/л триптона
  – 5 г/л NaCl
• При необходимости принимайте добавки с антибиотиками для обеспечения удержания плазмиды.
• Для микроскопии и исследований активности промотора используйте штамм W3110 E. coli с геномно усиленным репортером GFP (eGFP) под контролем промотора rplL.
• Используйте репортерные плазмиды GFP для различных промоторов (например, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) для измерения деятельности промоутеров.

2. Культивирование и отслоение биопленки

• Засейте 1,5 мл разведенной бактериальной культуры на лунку в 12-луночный планшет (12-луночные планшеты CellStar, Greiner Bio-One).
• Инкубируйте для образования биопленки.
• Удалите планктонную (не прилипшую) культуру аккуратно.

– Промойте каждую лунку 500 μл PBS.
– Отсоедините прикрепленные ячейки путем ультразвуковой обработки 12-луночного планшета в ультразвуковике UIP400MTP микропланшета. UIP400MTP обеспечивает равномерное отделение, подавая постоянную ультразвуковую энергию по всем скважинам.
– Настройки ультразвука: амплитуда 60%, циклический режим: 60 сек ВКЛ / 30 сек ВЫКЛ.

3. Забор и лизис клеток

• Центрифугируйте отделенные биопленочные клетки при 4500 г в течение 5 минут.
• Гранулированные ячейки промыть с помощью PBS.
• Ресуспендируйте клетки в 100 мкл 2% лауроилсаркозината натрия (SLS) и инкубируйте при 95°C в течение 15 минут.
• Проводите ультразвуковую обработку с помощью многотрубочного ультразвукового аппарата VialTweeter для обеспечения полного лизиса клеток.
  – Настройки ультразвука: 100% амплитуда, 50 с ВКЛ / 10 с ВЫКЛ на 10 минут общего времени работы; Храните образцы на льду.

4. Восстановление и алкилирование

• Добавьте 5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) для уменьшения дисульфидных связей и инкубируйте при температуре 95°C в течение 15 минут.
• Алкилатируют белки с 10 мМ йодоацетамида в течение 30 минут при 25°С.

5. Количественное определение и переваривание белка

• Центрифугируйте лизаты для очистки от мусора.
• Количественно оцените общее содержание белка с помощью набора для анализа белка BCA Pierce.
• Расщепите 50 г общего белка с 1 г трипсина в растворе, содержащем 2% SLS и 100 мМ бикарбоната аммония.
• Инкубируйте реакцию пищеварения в течение ночи при 30°C.

6. Пептидная очистка

• Осадите SLS, добавив 1,5% трифторуксусной кислоты (ТЖК), затем центрифугируете.
• Очистите пептиды с помощью микроспиновых колонок C18.
• Сухие очищенные пептиды и ресуспендирование в 0,1% ТФК.

7. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС)

• Анализируйте пептиды на масс-спектрометре Q-Exactive Plus в сочетании с наносистемой Ultimate 3000 RSLC.
• Разделять пептиды с помощью колонки ВЭЖХ с обратной фазой (75 мкм × 42 см), упакованной смолой C18 (2,4 мкм).
• Нанесите градиент от 2% до 35% растворителя B (ацетонитрил с 0,15% муравьиной кислоты) в течение 140 минут.
• Собирайте данные с помощью МС-сканирования с высоким разрешением, за которым следует тандемное МС/МС сканирование 10 наиболее интенсивных ионов.

8. Анализ данных

• Обрабатывайте необработанные данные ЖХ-МС с помощью программного обеспечения Progenesis.
• Экспортируйте файлы .mgf и анализируйте их с помощью MASCOT.
• Выполняйте количественное определение пептидов с помощью SafeQuant для контроля качества и корректировки ложных обнаружений.
• Проводите все эксперименты в дубликатах или в трех экземплярах, чтобы обеспечить воспроизводимость.

Ультразвуковые аппараты с несколькими образцами для высокопроизводительной пробоподготовки

Модели ультразвукового аппарата с несколькими образцами VialTweeter и UIP400MTP значительно повышают точность и эффективность экспериментальных рабочих процессов, особенно в области исследований биопленок и протеомики. Их способность равномерно обрабатывать несколько образцов обеспечивает высокую пропускную способность без ущерба для качества данных. Эти преимущества в сочетании с оптимизированными рабочими процессами, описанными выше, делают ультразвуковые аппараты Hielscher с несколькими образцами незаменимыми инструментами для современных биологических исследований.

Проектирование, производство и консалтинг – Качество «Сделано в Германии»

Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными условиями окружающей среды.

Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.