Протокол выращивания и отделения биоплёнки Staphylococcus

Стандартизированные методы необходимы для получения надёжных результатов исследований. Здесь представлен протокол выращивания и отделения стафилококковых биоплёнок. Этот протокол ориентирован на оптимизированную высокопроизводительную пробоподготовку с использованием ультразвукового устройства UIP400MTP для многолуночных планшетов, обеспечивающего эффективное высокопроизводительное отделение биоплёнок в 96-луночных планшетах. Протокол также содержит основные этапы выращивания, промывки и визуализации биоплёнок с акцентом на минимизацию вариабельности и обеспечение воспроизводимости.

Исследования биоплёнок Staphylococcus и антибиотиков

Биоплёнки Staphylococcus играют ключевую роль в персистирующих инфекциях благодаря своей устойчивости к антибиотикам и иммунным реакциям. Образование биоплёнки создаёт защитную среду для бактерий, затрудняя лечение инфекций. Исследования биоплёнок часто направлены на изучение их образования, поведения и чувствительности к антимикробным препаратам, при этом особое внимание уделяется высокопроизводительным методам для оптимизации экспериментальных рабочих процессов.
Ультразвуковое устройство UIP400MTP для многолуночных планшетов обеспечивает существенное преимущество в исследованиях биоплёнок, позволяя быстро и эффективно отделять биоплёнки от 96-луночных планшетов. Это устройство равномерно подаёт ультразвуковую энергию во все лунки, обеспечивая стабильные результаты при минимальной вариабельности.

Протокол выращивания и отделения биоплёнки Staphylococcus

Ниже приведена пошаговая инструкция по выращиванию и отделению биоплёнки Staphylococcus. В качестве примера аналитического этапа мы покажем, как количественно определить выращенную биомассу спектрофотометрическим методом с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым.

Выращивание биоплёнки Staphylococcus

Необходимые материалы:

• Стерильные 96-луночные полистирольные микротитрационные планшеты с плоским дном и крышками, с поверхностью, обработанной для культивирования тканей
• Триптиказо-соевый бульон (TSB) с 0,25% глюкозы
• Бокс биологической безопасности

Этапы:

1. Подготовьте стерильную рабочую среду в боксе биологической безопасности, чтобы минимизировать контаминацию.
2. Добавьте TSB, содержащий 0,25% глюкозы, в лунки микротитрационного планшета. TSB без глюкозы обычно не поддерживает образование биоплёнки и при необходимости должен использоваться только в качестве контроля.
3. Внесите в лунки бактериальные штаммы, подготовленные, как описано ниже:
4. Подготовьте бактериальные суспензии, обеспечив отсутствие ранее сформировавшихся скоплений клеток путём гомогенизации суспензий с помощью обработки ультразвуком или разрушения скоплений иглой калибра 23 с последующим кратковременным перемешиванием на вортексе.
5. Закройте планшет его крышкой и инкубируйте в условиях, оптимальных для образования биоплёнки (например, при 37°C в течение 24 часов).
6. Проводите эксперимент в трёх повторностях для каждого бактериального штамма (три лунки на штамм), чтобы обеспечить надёжность результатов.
7. Выделите шесть лунок на каждом планшете для отрицательных контролей. На одном 96-луночном планшете можно исследовать до 30 штаммов.

Визуализация и промывка биоплёнки

1. После инкубации осторожно удалите среду, чтобы не нарушить биоплёнку.
2. Промойте каждую лунку четыре раза физиологическим раствором, чтобы удалить планктонные бактерии.
3. Осмотрите дно лунок на наличие белых участков, указывающих на присутствие биоплёнки.

Отделение биоплёнки с помощью ультразвукового устройства UIP400MTP для многолуночных планшетов

Настройка устройства и параметры:

• Ультразвуковое устройство UIP400MTP для многолуночных планшетов
• Рабочие настройки: амплитуда 60%, циклический режим с 60 секундами включения / 30 секундами выключения

Этапы:

1. Установите промытый микротитрационный планшет на платформу UIP400MTP.
2. Обработайте образцы ультразвуком при рекомендуемых настройках (амплитуда 60%, 60 секунд включения, 30 секунд выключения). Скорректируйте настройки с учётом бактериального штамма.
3. Запустите процесс обработки ультразвуком для отделения биоплёнки. Ультразвуковые волны разрушают матрикс биоплёнки, высвобождая прикреплённые бактерии.
4. UIP400MTP обеспечивает равномерное воздействие во всех лунках для получения стабильных результатов отделения.

Аналитический этап: количественное определение биомассы отделённой биоплёнки Staphylococcus с помощью кристаллического фиолетового (CV)

Необходимые материалы:

• 0,1% раствор кристаллического фиолетового (CV)
• 95% этанол или 30% уксусная кислота (для солюбилизации)
• Микропланшетный ридер, способный выполнять измерения при 570 nm
• Стерильные микротитрационные планшеты для окрашивания

Этапы:

1. Подготовка планшета для окрашивания: перенесите 100 µL суспензии отделённой биоплёнки из каждой лунки планшета, обработанного ультразвуком, в соответствующие лунки чистого стерильного 96-луночного микротитрационного планшета. Это обеспечивает чистую и однородную среду для окрашивания.
2. Окрашивание отделённой биоплёнки: добавьте 150 µL 0,1% раствора кристаллического фиолетового в каждую лунку, содержащую суспензию отделённой биоплёнки. Осторожно перемешайте пипетированием, чтобы обеспечить равномерное смешивание суспензии биоплёнки и кристаллического фиолетового.
3. Инкубация: инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы кристаллический фиолетовый эффективно окрасил биомассу.
4. Промывка: после инкубации осторожно удалите раствор кристаллического фиолетового из лунок, не нарушая биомассу. Промойте каждую лунку три раза стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить несвязанный краситель.
5. Сушка: дайте планшету высохнуть на воздухе при комнатной температуре или в боксе со стерильным воздушным потоком. Избегайте нагревания, поскольку оно может изменить результаты.
6. Солюбилизация: добавьте в каждую лунку 200 µL 95% этанола (или 30% уксусной кислоты в зависимости от стандартных лабораторных методик), чтобы солюбилизировать связанный кристаллический фиолетовый. Осторожно перемешивайте пипетированием или встряхиванием планшета в течение 10 минут при комнатной температуре.
7. Измерение: измерьте оптическую плотность (OD) раствора солюбилизированного кристаллического фиолетового при 570 nm с помощью микропланшетного ридера.
8. Анализ данных: вычтите среднее значение OD570 отрицательных контролей (лунок с TSB, но без бактериального инокулята) из значений экспериментальных лунок, чтобы учесть фоновое окрашивание. Запишите и проанализируйте данные.

Примечание: проводите эксперимент в трёх повторностях для каждого условия, чтобы обеспечить воспроизводимость. Обеспечьте надлежащее обращение с кристаллическим фиолетовым и этанолом, соблюдая правила безопасности и утилизации.
 

Краткий обзор основных преимуществ UIP400MTP:

• Высокопроизводительная обработка: Разработан специально для многолуночных планшетов и позволяет обрабатывать несколько образцов одновременно.
• Равномерное распределение ультразвука: Обеспечивает одинаковую интенсивность ультразвука во всех лунках, позволяя получать стабильные результаты для всех образцов.
• Используйте любой стандартный планшет: UIP400MTP позволяет обрабатывать любые стандартные многолуночные планшеты, чашки Петри и штативы с пробирками. Дорогие фирменные планшеты не требуются!
• Удобный интерфейс: Простота настройки и управления делает его отличным инструментом для повышения производительности лаборатории. Программируемые настройки и автоматизация облегчают стандартизацию процессов!