Протокол культивирования и отслойки биопленки стафилококка

Стандартизированные методы имеют важное значение для получения надежных результатов исследований. Здесь вы можете ознакомиться с протоколом культивирования и отслойки стафилококковых биопленок. Этот протокол направлен на оптимизированную высокопроизводительную подготовку образцов с использованием многолуночного ультразвукового аппарата UIP400MTP основе многолуночного планшета для эффективного и высокопроизводительного отделения биопленки в 96-луночных планшетах. Протокол также содержит ключевые шаги по выращиванию, промывке и визуализации биопленки с акцентом на минимизацию вариабельности и обеспечение воспроизводимости.

Исследование биопленки стафилококка и антибиотиков

Биопленки стафилококка играют важную роль в персистирующих инфекциях из-за их устойчивости к антибиотикам и иммунным реакциям. Образование биопленки обеспечивает защитную среду для бактерий, что затрудняет лечение инфекций. Исследования биопленок часто сосредоточены на понимании их образования, поведения и восприимчивости к противомикробным препаратам, с акцентом на высокопроизводительные методы для оптимизации экспериментальных рабочих процессов.
Многолуночный ультразвуковой аппарат UIP400MTP предлагает значительное преимущество в исследовании биопленок, позволяя быстро и эффективно отделять биопленки от 96-луночных планшетов. Это устройство обеспечивает равномерную ультразвуковую энергию для всех скважин, обеспечивая стабильные результаты при минимизации вариативности.

Протокол культивирования и отслоения биопленки стафилококка

Ниже мы проведем вас с пошаговой инструкцией по процессу культивирования и отделения биопленки стафилококка. В качестве примера аналитического шага мы покажем вам, как количественно количественно оценить культивируемую биомассу путем окрашивания кристаллическим фиолетовым цветом.

Выращивание биопленки стафилококка

Необходимые материалы:

• Стерильные плоскодонные 96-луночные микротитровальные планшеты с микротитрами и крышками из полистирола с культурой тканей стерильные
• Триптический соевый бульон (TSB) с 0,25% глюкозы
• Шкаф биологической безопасности

Стремянка:

1. Подготовьте стерильную рабочую среду в шкафу биологической безопасности, чтобы свести к минимуму загрязнение.
2. Добавьте БЦБ, содержащий 0,25% глюкозы, в лунки микротитрового планшета. TSB без глюкозы, как правило, не способствует образованию биопленки и должен использоваться в качестве контроля только при необходимости.
3. Инокулируйте лунки штаммами бактерий, приготовленными, как описано ниже:
4. Приготовьте бактериальные суспензии, гарантируя, что ранее существовавшие клеточные кластеры, путем гомогенизации суспензий с помощью ультразвука или путем разбиения кластеров иглой 23-го калибра и кратковременного вортексирования.
5. Закройте планшет крышкой и инкубируйте в условиях, оптимальных для образования биопленки (например, 37°C в течение 24 часов).
6. Для обеспечения надежности проведите эксперимент в трех экземплярах для каждого штамма бактерий (по три лунки на штамм).
7. Выделите шесть лунок на планшет для отрицательного контроля. На 96-луночный планшет можно протестировать до 30 штаммов.

Визуализация и промывка биопленки

1. После инкубации тщательно выбросьте среду, чтобы не повредить биопленку.
2. Промойте каждую лунку четыре раза физиологическим раствором, чтобы удалить планктонные бактерии.
3. Осмотрите дно лунок на наличие белых пятен, свидетельствующих о наличии биопленки.

Отслоение биопленки с помощью многолуночного планшетного ультразвукового аппарата UIP400MTP

Настройка и параметры устройства:

• UIP400MTP многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат
• Рабочие настройки: амплитуда 60%, циклический режим с 60 секунд ВКЛ / 30 секунд ВЫКЛ

Стремянка:

1. Поместите промытую микротитровую пластину на UIP400MTP платформу.
2. Произведите ультразвуковую обработку образцов при рекомендуемых настройках (амплитуда 60%, 60 секунд ВКЛ, 30 секунд ВЫКЛ). Отрегулируйте настройки в соответствии с штаммом бактерий.
3. Начните процесс ультразвуковой обработки для отделения биопленки. Ультразвуковые волны разрушают биопленочный матрикс, высвобождая прилипшие бактерии.
4. UIP400MTP обеспечивает равномерное воздействие на все скважины для стабильных результатов отрыва.

Аналитический этап: количественное определение биомассы оторвавшейся биопленки стафилококка с использованием кристаллической фиалки (CV)

Необходимые материалы:

• 0.1% раствор кристаллического фиолета (CV)
• 95% этанол или 30% уксусная кислота (для солюбилизации)
• Считыватель микропланшетов с возможностью считывания с длиной волны 570 нм
• Стерильные микротитровальные пластины для окрашивания

Стремянка:

1. Подготовка окрашивающей пластины: Переведите 100 мкл отделенной биопленочной суспензии из каждой лунки ультразвуковой пластины в соответствующие лунки чистой, стерильной 96-луночной микротитровой пластины. Это обеспечивает чистую и однородную среду для окрашивания.
2. Окрашивание отделенной биопленки: Добавьте 150 мкл 0,1% раствора кристаллического фиалки в каждую лунку, содержащую отделенную биопленочную суспензию. Аккуратно пипеткой, чтобы обеспечить равномерное смешивание биопленки суспензии и кристаллической фиалки.
3. Инкубация: Дайте планшету инкубироваться при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы кристаллический фиолетовый цвет эффективно окрашивал биомассу.
4. Промывка: После инкубации тщательно выбросьте кристаллический фиолетовый раствор из лунок, не нарушая биомассу. Промойте каждую лунку три раза стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить несвязанное пятно.
5. Сушка: Дайте пластине высохнуть на воздухе при комнатной температуре или под стерильным колпаком. Избегайте нагревания, так как это может изменить результаты.
6. Солюбилизация: добавьте 200 μл 95% этанола (или 30% уксусной кислоты, в зависимости от стандартной лабораторной практики) в каждую лунку для растворения связанного кристаллического фиолетового цвета. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки или встряхивания тарелки в течение 10 минут при комнатной температуре.
7. Измерение: Измерьте оптическую плотность (OD) раствора солюбилизированного кристаллического фиолетового цвета при длине волны 570 нм с помощью считывателя микропланшетов.
8. Анализ данных: Вычтите среднее значение OD570 отрицательных контролей (скважины с TSB, но без бактериального инокулята) из экспериментальных скважин для учета фонового окрашивания. Записывайте и анализируйте данные.

Примечание: Проводите эксперимент в трех экземплярах для каждого условия, чтобы обеспечить воспроизводимость. Обеспечьте правильное обращение с кристаллическим фиалом и этанолом, соблюдая протоколы безопасности и утилизации.
 

Краткий обзор основных преимуществ UIP400MTP:

• Высокопроизводительная обработка: Разработан специально для многолуночных планшетов, что позволяет обрабатывать несколько образцов одновременно.
• Равномерное распределение ультразвука: Обеспечивает одинаковую интенсивность ультразвука во всех лунках, обеспечивая стабильные результаты для всех образцов.
• Используйте любую стандартную пластину: На UIP400MTP можно работать с любыми стандартными многолуночными планшетами, чашками Петри и штативами для труб. Никаких дорогих фирменных пластин не требуется!
• Удобный интерфейс: Прост в настройке и управлении, что делает его отличным инструментом для повышения производительности лаборатории. Программируемые настройки и автоматизация облегчают стандартизацию процессов!